酵母基因工程
酵母基因工程
一酵母基因工程的发展现状
1.酿酒酵母自身的改造
（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母
（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母
（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母
（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达
（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母
2酵母表达异源蛋白
（1）表达水平
（2）表达质量
2酵母基因工程的发展趋势
（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷
（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向
（3）利用酵母基因工程筛选更多新药
（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本
（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注
3发展历程
1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。
2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补
了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。
3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。
4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。
5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母
全基因组的测序。
二．酵母基因工程的优点
1.安全无毒，不致病；
2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；
3.容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可
以取得较高的转化率；
4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；
5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；
6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能
三．酵母表达系统
（1）酵母表达载体
①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。
原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。
酵母部分：
1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；
整合型载体的整合介导区。
2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列
3基因启动子和终止子序列
4信号肽序列
②载体的复制形式
附加型载体：在酵母染色体外自主复制
1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的
2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的
整合型载体：随同酵母染色体一起复制
1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载
体与宿主染色体之间发生同源重组。
2常用的外源基因整合靶位点：rDNA
（2）宿主
广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
a.酵母属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
b.克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
c.毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
d.裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
e.汉逊酵母属多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想
（3）酵母DNA转化
①原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质
体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%
②离子溶液法:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、
热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。103~104个转化子/μg DNA
③电穿孔法(electroporation)和粒子轰击法(particle bombardment)：酵母
菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/μg
DNA
（4）酵母分泌外源蛋白的糖基化
1酿酒酵母分泌的多数外源蛋白均是过度糖基化的(>40个甘露糖残基)；
2巴斯德毕赤酵母分泌表达糖蛋白的寡糖链平均长度约为8~14个甘露糖残
基
3解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖链(8~10个甘露糖残基)
酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用。
四、酿酒酵母表达系统
（1）、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
酿酒酵母是发酵工业中的主要生产菌株，是最先建立的酵母表达系统。
应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素、粒细胞集落刺激因子
酵母表达系统的不足
?较难进行高密度发酵：发酵时产生乙醇，影响生长代谢和基因产物表达；
?蛋白质的分泌表达能力较差；
?蛋白质的加工过程发生过度糖基化作用。
表达盒式结构组成：
?启动子常用乙醇脱氢酶启动子(P ADH1)和半乳糖诱导型启动子(P GAL)。
?分泌信号用酿酒酵母自身α-交配因子的分泌信号
?终止子用CYC1基因的转录终止子
(2)、巴斯德毕赤酵母表达系统
1、巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。
应用：乙型肝炎表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子和链激酶
2、巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
启动子强并受甲醇严格诱导，可用于调控外源基因的表达；
能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化接近高等真核生物；
外源DNA 的转化、基因替换、基因敲除等操作简单易行，
外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加10~100 倍；
容易进行工业化生产，高密度培养干细胞可达100g/L 以上。
3、巴斯德毕赤酵母的整合型载体
启动子
?基因AOX1的启动子(P
)，在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达；
AOX1
?三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(P
), 组成型启动子，不需甲醇诱导，外源基因表达量高。
GAP
选择标记
?对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4 ( 组氨醇脱氢酶基因) ；ARG4(精氨酸合成酶基因)；TRP1(色氨酸合成酶基因)；URA3 ( 尿嘧啶合成酶基因) 。
?抗性选择标记：抗生素G418 抗性基因和Zeocin 抗性基因
信号肽序列
?由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号α-交配因子
4、巴斯德毕赤酵母受体菌
X-33为野生型毕赤酵母。
GS115为HIS4突变型,是使用最广泛的巴斯德毕赤酵母宿主菌，含甲醇利用AOX1和AOX2基因，甲醇利用能力与野生型一样。
KM71为HIS4突变型,AOX1基因缺陷的菌株，在甲醇培养基中生长缓慢，广泛用于多种外源基因的表达。
5、转化方式
转化之前，将表达载体酶切线性化，使之整合于酵母基因组AOX1 或HIS4 基因位置，随酵母生长稳定存在。
转化方法：原生质体法、电击法、LiCl2和PEG法
6 、整合方式
5’AOX1 能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因；
染色体AOX1 区与载体质粒AOX1 区发生单位点互换；
染色体HIS4 基因与载体的HIS4 基因发生置换。
7、获得高拷贝数整合转化子的方法
不同的转化方法导致产生天然高拷贝转化子。
原生质体法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高；
体外在载体上多次插入目的基因片段；
将载体中目的基因两端连上来自宿主rDNA 或其他非必需高重复的基因片段，通过同源重组而达到高拷贝整合的目的；
利用基因的功能筛选高拷贝整合。
8、巴斯德毕赤酵母菌株的培养条件
在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但外源基因的表达被完全抑制；
当甘油缺失或被完全消耗，甲醇被添加到培养液中，才诱导大量产生外源蛋白；
最大的通气量可提高表达量。
9 、巴斯德毕赤酵母表达系统的缺点
分子生物学的研究基础差
不是一种食品微生物；
发酵周期一般较长。
五酵母基因工程的应用
应用举例
1利用毕赤酵母生产饲料用植酸酶
2可利用淀粉酿酒酵母的基因工程
酵母基因工程
酵母基因工程 一酵母基因工程的发展现状 1.酿酒酵母自身的改造 （1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 （2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 （3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母 （4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达 （5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母 2酵母表达异源蛋白 （1）表达水平 （2）表达质量 2酵母基因工程的发展趋势 （1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷 （2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向 （3）利用酵母基因工程筛选更多新药 （4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 （5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注 3发展历程 1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补 了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母 全基因组的测序。 二．酵母基因工程的优点 1.安全无毒，不致病； 2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3.容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率； 4.培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能 三．酵母表达系统 （1）酵母表达载体 ①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。 原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。 酵母部分： 1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)； 整合型载体的整合介导区。 2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列 3基因启动子和终止子序列 4信号肽序列
基因工程思考题
《基因工程》思考题 第一章绪论 1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。 2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？ 3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。 4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程. 5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？ 6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础. 第二章基因工程的基本原理与支撑技术 1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点 2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点 3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？ 4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素. 5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？ 6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？ 7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。 8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？ 9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？ 10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？ 11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？ 12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？ 13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？ 14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？ 15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？ 16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？ 17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation. 第三章基因工程操作的基本条件 1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素. 2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？ 3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法. 4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？
酵母基因工程综述
酵母基因工程综述 姓名：张衡学号：060509215 班级：生工092 酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核微生物，种类繁多，至少包括80个属，600多种，1000多菌株。它有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达调控机制，它既能通过有丝分裂进行无性繁殖，也可以通过减数分裂实现有性繁殖。酵母菌作为单细胞真核生物，既具有细菌生长迅速、操作简单的特点，又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰的能力，它是表达外源基因的理想宿主。因此利用酵母基因工程成功的生产了人类、动物、植物或微生物来源的异源蛋白，在医药生物技术上发挥了重要作用。 一、酵母基因工程的发展现状和发展趋势 酵母既具有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又有哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，如二硫键的正确形成、糖基化作用等，用来生产来源于真核生物的生物活性蛋白有很多优点。目前在酵母基因工程中发展和应用的较多的酵母有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母等，其应用主要体现在两个方面，一是改造酵母本身用以提高发酵性能；二是利用酵母作为宿主表达异源蛋白。1、酿酒酵母自身的改造：a、将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母；b、将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母；c、将β—葡聚糖酶基因导入酵母； d、将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达； e、将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母。2、酵母表达异源蛋白：a、表达水平；b、表达质量。 对于酵母基因工程，在构建各种表达载体、建立新的表达系统方面取得了一系列进展。在未来一段时间内，酵母基因工程的研究将逐步转移到完善现有的表达系统、解决存在的缺陷、扩大应用领域等方面。对酵母自身的改造集中体现在如何通过转基因技术使酿酒酵母能利用纤维素和半纤维素等可再生物质来生产廉价的酒精，缓解能源紧张。1、解决酵母基因工程中还存在的缺陷；2、在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；3、利用酵母基因工程筛选更多的新药；4、改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；5、酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。 二、酵母表达系统 酵母菌作为单细胞真核生物，既具有细菌生长迅速、操作简单的特点，又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰的能力，所以是表达外源基因的理想宿主。1、酵母表达载体：a、载体的基本构架典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的"穿梭"质粒。它是由来自酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成。其原核部分主要包括可以再大肠杆菌中复制的起点序列（ori)和特定的抗生素抗性基因序列。2、载体的复制形式酵母表达系统的载体主要分为附加型载体和整合型载体两种。附加型载体在酵母宿主中的拷贝数量大，但是在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量：整合型载体导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但是基因的拷贝数量低。2、宿主能够发展成基因表达系统的宿主应该具备一定的条件：a、安全无毒，不致病；b、遗传背景清楚，容易进行遗传操作；c、构建的载体DNA容易进入，转化频率较高；d、发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度发酵；e、蛋白质分泌能力好。3、酵母的DNA转化：a、原生质体法；b、离子溶液法；c、一步法；d、PEG1000法；e、电穿孔法和粒子轰击法。4酵母分泌外源蛋白的糖基化不同酵母细胞对分泌蛋白的糖基化方式和程度不同，加到分泌蛋白上的碳水化合物
第七章 外源基因在酵母菌中的表达
生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学张惠展
基因工程 523416789重组DNA 技术与基因工程的基本概念 重组DNA 技术与基因工程的基本原理 重组DNA 技术所需的基本条件 重组DNA 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化
7外源基因在酵母菌中的表达 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物
第七章、酵母基因工程
酵母基因工程 A B 酵母菌的宿主系统 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征C 酵母菌的载体系统 E D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统F F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如菌）（半知酵母菌）共由多个种组成如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 核 成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物 简单核
B 酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用源因表的酵母宿菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。 表达外源基因最理想