巴斯德毕赤酵母表达系统

文章编号:100128751(2002)0620246205

巴斯德毕赤酵母表达系统

唐元家　余柏松　

综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所,　成都610051)

摘要:　巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。

关键词:　巴斯德毕赤酵母;　外源蛋白;　表达中图分类号:　Q816　文献标识码:　A

　收稿日期:2001209227　修订日期:2002206215

　作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。

余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。

基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示

了广阔的前景。到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981

年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕

。

此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子,

分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。

1　巴斯德毕赤酵母表达系统的优点

巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系

统所不具备的优点。(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2)

作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和

翻译后修饰,。比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正

确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕

;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如

破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕

,Heva brasiliensis

羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕

;(5)在巴斯德毕

赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞

外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素

(HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕

,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和

凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕

;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到

的基因工程菌株比较稳定。巴斯德毕赤酵母的遗传操作技术和酿酒酵母非常相似,后者是现代分子生物学中研究得比较透彻和应用很广的酵母表达体系;(7)糖基化程度低。和酿酒酵母相比,毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基,较之酿酒酵母每条侧链平均50～150甘露糖残基短得多。此外酿酒酵母核心多糖末端存在α21,3糖苷链,而毕赤酵母没有。一般认为酿酒酵母中糖蛋白的α21,3糖苷使得这些蛋白具有高度的抗原性,因而无治疗用途。

2　巴斯德毕赤酵母的生物学

巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。在缺乏抑制性碳源(如葡萄糖、甘油)时,能利用甲醇作为惟一碳源。甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,并产生过氧化氢。为了避免过氧化氢对细胞的毒性,甲醇代谢的第一步在过氧化物酶体中发生。乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱,因此巴斯德毕赤酵母代偿性地大量产生这种酶,调控这种酶的启动子是强启动子,用来调控异源蛋白的表达。在巴斯德毕赤酵母中有两种基因编码乙醇氧化酶(即AOX1和AOX2),细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供的。在甲醇培养的细胞中,该酶可占细胞总蛋白的30%以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97%,但只承担很少一部分活力。当aox1基因缺失只存在aox2时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为Mut s(Methanol utilization slow);aox1基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut+。

aox1基因的表达为转录水平调控。aox1基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达。在一般情况下,胞内AOX酶的变化直接反映了外源蛋白的表达状况,因此通过分析检测胞内AOX酶的含量和变化速率,就可以确定外源基因所处的状态。顾小勇等根据细胞氧化甲醇过程中消耗氧的情况,通过测定溶氧的变化,建立一种简便、可行的检测方法〔7〕。

甲醇酵母生长适宜温度一般为28～30℃。诱导期间如果温度超过32℃,不利于蛋白表达,甚至会导致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时,Mut s和Mut+生长速度并无区别;而以甲醇为碳源时,Mut+的生长比Mut s的生长明显更快。

3　宿主菌和载体

巴斯德毕赤酵母表达宿主菌于20世纪80年代初开发获得,大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵母Y211430进行突变改造而来,在组氨酸脱氢酶基因(his4)处有一突变,用于转化后筛选重组菌株(表1)。

表1 巴斯德毕赤酵母表达宿主菌

菌株基因型表型

Y211430W ile type野生型

G S115his4Mut+H is2

K M71aox1Δ::sarg4his4arg4Mut+H is2

MC10023aox

1Δ::sarg4aox2

Δ::phis4his4arg4Mu t

+H is2

S M D1168pep4Δhis4Mut+H is2蛋白酶不足

S M D1165prb1his4Mut+H is2蛋白酶不足

S M D1163pep4prb1his4Mut+H is2蛋白酶不足目前主要有3种表达宿主菌,它们的区别在于aox1和/或aox2基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化。最常用的宿主菌为G S115(his4),它含aox1和aox2基因,在含甲醇的培养基上以野生型速率生长。K M71(his4arg4aox1::arg4)宿主菌的aox1已被酿酒酵母的arg4所代替,因此,此宿主菌只有依赖aox2基因合成AOX2,在甲醇中低速生长。MC10023 (aox1Δ::sarg4aox2Δ::phis4his4arg4)的aox1和aox2都被去除,不能在含甲醇的培养基上生长〔8,9,21〕。上述的宿主菌进一步改造,还可得到其它衍生的宿主菌,目前不同基因型已达十几种S M D1163(his4pep4 prb1),S M D1165(his4prb1)和S M D1168(his4pep4)是最近开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌,它们为表达外源蛋白提供了一个减少降解的环境,有广泛的应用价值。

巴斯德毕赤酵母的表达载体包括整合型载体和自我复制的游离载体,现在一般都用整合型载体(表2)。载体通常含有启动子,如aox1、gap(3′磷酸甘油醛脱氢酶)、fld1(甲醛脱氢酶)等基因启动子,多克隆位点区(MHC),aox1转录终止子(aox t),组氨酸脱氢酶基因(his4)以及来自大肠埃希氏菌质粒pBR322的氨苄西林耐药(Ap r)和C olElori序列。Aox启动子是强启动子,可严格控制外源蛋白的表达。与aox启动子的诱导表达不同,gap启动子具有很强的组成型表达能力。fld1启动子也是强启动子,能在以甲醇为惟一碳源或以甲胺为惟一氮源(葡萄糖、甘油等为碳源)条件下表达〔10〕。表达载体均不含酵母复制原点,也就是说导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组整合到染色体上,外源基因才能够稳定存在。整合位点一般位于his4区或aox1区,对于载体

的改进包括建立在体外插入多个目的基因拷贝载体,如pAO815、pPICZ、p G APZ等载体。由于提高整合的拷贝数有可能提高外源基因的表达量,因此人们又发展了可以快速筛选高拷贝整合转化子的载体,如pPIC9K。该载体包含来自转座子Tn903的卡那霉素耐药基因(Kan r),可依靠基因剂量效应,对G418的抗性水平快速筛选出高拷贝整合的转化子〔11〕。Invitrogen 公司的pPICZα、pPICZ、p G AP Z、p G APZα等载体,不仅可利用高剂量的Z eocin来筛选含多拷贝载体的转化菌株,同时这些载体的c2myc抗原决定簇可方便地检测外源蛋白,C末端的多聚组氨酸(6个His)为方便使用树脂来纯化外源蛋白质提供了条件〔12〕。

表2 常用的巴斯德毕赤酵母表达载体

载　体表达

方式

选择标记特　点

pHI L2D2胞内his4在not1位点整合产生Mut s转化子

pAO815胞内his4适合构建形成多个串联的表达框

pPIC3K胞内H is4和kan r可筛选含多拷贝载体的转化子

pPICZ胞内ble r可筛选含多拷贝载体的转化子

pHW O10胞内His4外源蛋白的表达受组成型启动子控制

p G APZ胞内ble r外源蛋白的表达受组成型启动子控制

pHI L2S1分泌his4PH O1为分泌信号肽

pPIC9K分泌his4和kan r可筛选含多拷贝载体的转化子

pPICZα分泌ble r可筛选含多拷贝载体的转化子

p G APZα分泌ble r外源蛋白的表达受组成型启动子控制

4　巴斯德毕赤酵母的转化

和大肠埃希氏菌不同,毕赤酵母转化较为复杂。只有外源基因整合到染色体上才能够稳定存在,如果转化后的重组载体未能整合到染色体上,而是以游离的附加体形式存在,那么这种转化子是不稳定的,重组载体极易丢失。对于巴斯德毕赤酵母而言,重组可分为两种情况;一是单交换,即插入,外源基因通过重组插入到酵母染色体上,aox1仍然保留,得到的转化子表型为Mut+;另一种情况是双交换,即替换,外源基因通过重组替换了染色体上的aox1基因,这样得到的转化子表型为Mut s。同源重组有时会产生多拷贝的整合,一般占转化子的1%～10%。这是因为一个拷贝整合到染色体上以后,整合位点依然存在,则另外的拷贝又可整合上去。

转化巴斯德毕赤酵母的常见方法有四种:原生质体转化法、电转化法、聚乙二醇(PEG)法和氯化锂(LiCl)法。一般说来,原生质球和电转化法效率较高〔11〕(约103～104转化子/μgDNA)。电转化简单,原生质球方法复杂。PEG方法和LiCl方法很简单,但这两种方法转化效率较低,且不易形成多拷贝〔12〕。实验中发现原生质球法转化形成的转化子有时能达到很高的拷贝数,但以Z eocin为筛选标记的表达载体时,不宜使用原生质球法转化,因为Z eocin对原生质体有致死性。

5　外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目前巴斯德毕赤酵母表达系统在国内外的应用非常广泛,许多难于用其它系统表达的蛋白在这一系统中得到成功表达,且表达量较为可观。到目前为止,已用这个系统成功的表达了200种以上蛋白,包括病毒的、细菌的、真菌的、动植物和人的一些蛋白〔13〕。

5.1　巴斯德毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般步骤

在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤比大肠埃希氏菌要复杂得多。一般的步骤为:(1)目的基因的克隆　选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点区,如果选用的是分泌型表达载体,则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。

(2)重组载体线性化　重组载体只有被线性化,整合效率才能大大提高,环状质粒整合效率是很低的。(3)转化　一般选用原生质球或电击法。(4)筛选　可先利用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性来进行初筛,复筛可用多聚链式反应(PCR)。对于大量转化子的筛选,可用原位点杂交法进行〔14〕。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子,还可以鉴定多拷贝。

(5)外源蛋白的表达　如果表达载体的启动子是组成型启动子,则表达比较简单;如果载体的启动子是醇诱导型启动子,则外源蛋白的表达分为2步,即菌体生长和蛋白诱导表达。(6)放大　表达的条件(如通气状况,pH值,培养基的组成等),经优化以后就可以按比例放大,从摇瓶培养转至大规模发酵。

5.2　重组蛋白的分泌表达

分泌表达是一种理想的蛋白生产方式。一些在其它系统不能分泌的蛋白能在巴斯德毕赤酵母中分泌表达,如人肠组织蛋白酶E(CTSE)在大肠埃希氏菌中表达时以包含体形式存在,在哺乳细胞中为胞内表达,而在巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外〔15〕。为了分泌外源蛋白,可在表达载体的启动子后加入一个编码信号肽的序列。尽管现在许多不同的信号序列成功地用来分泌表达外源蛋白,但不同的信号肽,分泌效率不一样,如用PH O1、酵母Mα和天然外源基因信号肽表达小鼠52HT5A52羟色胺受体,发现天然信号肽的表达量比PH01信号肽要高〔16〕,因此要达到外源蛋白的最高表达,应尝试不同的信号肽。

5.3　重组蛋白的翻译后修饰加工

巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能,这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成和O2及N2型糖基化等。比如,人基质金属蛋白酶29(hM MP29)有3个糖基化位点,颜春洪等用巴斯德毕赤酵母表达系统表达获得了相对分子质量为92126ku的重组hM MP29,相对分子质量略大于天然hM MP29(91127ku),这是由于酵母中蛋白的糖基化方式和哺乳动物不同〔13,17〕所致,但糖基化方式的不同并没有明显影响蛋白的活性〔18〕。

5.4　影响外源蛋白表达的因素

虽然许多外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中可高效表达,达到g/L以上水平,但仍有一些蛋白表达量相对较低。多种因素可以影响外源蛋白表达。

5.4.1　外源基因的内在特性　主要包括mRNA5′端非翻译区(5′2UTR)、基因的A+T组成和密码子的使用频率三个方面。5′2UTR的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达,由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30%以上),极少有外源蛋白能达到这么高的水平,因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA5′2UTR尽可能和AOX1 mR NA5′2UTR相似是必需的,最好是保持两者一致。A+T含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为AT丰富区可能存在转录提前终止信号。因此对AT含量丰富的基因最好是重新设计序列,使其A+T含量在30%～55%范围内。用这种方法使破伤风毒素C片段得到高效表达〔3〕。Paul〔19〕等通过对110个酵母基因使用密码子的统计学分析,确证了密码子的偏爱性与基因的表达量密切相关。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。赵翔等通过分析巴斯德毕赤酵母的28个蛋白编码基因的同义密码子使用情况,计算出该酵母的密码子用法,并确定出巴斯德毕赤酵母的19个高表达优越密码子〔20〕。

5.4.2　载体和宿主菌　用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白时有多种表达载体可供选择。既有胞内表达的,又有分泌表达的;既有组成性表达的,又有诱导性表达的。分泌表达又有多种表达信号肽可以选择。可以根据具体情况选择高表达载体。比如,外源蛋白的表达也受宿主菌遗传特性和生长特性等的影响,比如说,如果外源蛋白对蛋白酶敏感,使用蛋白酶缺陷的受体菌可减弱蛋白酶的作用,此外通过调整培养基的pH值,在培养基中添加1%酪蛋白水解物也可减弱蛋白酶的水解作用〔21,22〕。转化子的表型对外源蛋白的表达也有影响,一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Mut s 表型;对于分泌表达,Mut+和Mut s都可使用。在高生物量的发酵中,Mut+生长更快,较之Mut s对于提高外源蛋白的表达量更有效。有时Mut s菌株虽然在诱导阶段生长缓慢,但外源蛋白的表达反而更高,更有利于蛋白的正确折叠,如PepT1的表达在Mut s菌株中较高〔23〕。也可以在不改变现有表达载体及宿主菌的前提下,通过从Mut s菌中分离Mut+自发突变体来使外源蛋白的表达量增加〔24〕。

5.4.3　基因拷贝数　一般情况下,外源基因整合的拷贝数愈高,蛋白表达量愈大,如表达鼠表皮生长因子(mEG F)〔21〕时多拷贝产生非常高的表达量。并非所有高拷贝的转化子都能产生高的表达量,特别在分泌表达时,这可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。有时有意增加拷贝数对表达量并没有什么效果〔25〕,辛利等在用巴斯德毕赤酵母表达人血管抑素时发现,拷贝数超过1的菌株表达血管抑素的量要高于单拷贝的菌株,然而拷贝数超过2以后,重组蛋白的表达量并没有明显的增长〔26〕。在极少数情况下拷贝数的增加反而会导致蛋白产量的下降。因此在筛选出高拷贝转化子、鉴定表达的同时,有必要以单拷贝转化子作为对照,比较两者表达量。

5.4.4　培养条件　主要包括培养基、通气量、pH、甲醇含量和培养时间等。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要,充足的氧气是巴斯德毕赤酵母高效表达所必需的。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。官孝群等在表达血管生成抑制因子K4K5时发现,在诱导阶段不同的培养基诱导表达外源蛋白的水平不一样〔27〕。一般说来,高的生物量导致总的蛋白表达量增大。比如,在表达mEG F时,在含酵母膏和蛋白胨的培养基中单拷贝转化子表达量为20μg/L,但在不含酵母膏和蛋白胨的基本培养基中表达量为1μg/L〔25〕。但是生物量越大,培养基中的氧和营养供给就越受限制。培养时间长,也会产生比较大的生物量,在表达某些蛋白时发现,培养时间过长会发生蛋白质的过量水解〔28〕。因此一个高的细胞密度不一定有利于外源蛋白的表达,这有赖于所要表达的外源蛋白的性质(如溶解度、稳定性、毒性等)。如果是利用甲醇诱导外源蛋白表达,则在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇,以弥补甲醇的消耗和蒸发。一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基体积015%,但由于培养条件和转化子表型不同,添加甲醇的量也有所不同。

6　巴斯德毕赤酵母表达系统的应用

近年来巴斯德毕赤酵母表达系统在细胞、分子生

物学的理论和应用领域的研究越来越广泛。(1)巴斯德毕赤酵母表达系统成功地表达了多种外源蛋白,表达产物除了人畜药用制品外,还包括来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质〔13〕等。巴斯德毕赤酵母表达系统还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系而以全细胞作为生物催化剂〔29〕。(2)巴斯德毕赤酵母作为一种有用的模型系统用于现代细胞生物学的基础研究,主要用于研究过氧化物酶体输入和组装、过氧化物酶体选择性自噬降解的分子机制和真核细胞分泌途径的结构与功能等。

对巴斯德毕赤酵母表达系统的广泛研究,促进了人们对分子生物学领域许多问题的认识。随着研究的深入,巴斯毕赤酵母表达系统也将更完善,在将来的理论和应用领域中会发挥出越来越重要的作用。

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