第2章 基因克隆的载体——质粒和噬菌体

第2章基因克隆的载体——质粒和

噬菌体

载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。

一、载体的功能：

1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供条件

二、载体应具备的条件：

1.具有对受体细胞的可转移性

2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

3.长度尽可能小，以提高其载装能力

4.具有多种单一的酶切位点

5.具有合适的选择性标记

附图：

图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式

2.1 质粒

质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。

一、质粒的基本特性：

（一）自主复制性

质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。

（二）不相容性

利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。

（三）可扩增性

质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。

但另外两种质粒（psc101和p15A）和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。

（四）可转移性

在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。

二、质粒的构建

（一）天然存在的两种质粒

（1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell。

（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。

（二）质粒人工构建的目的

天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：

（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择

（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组

（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量

（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝

（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。

三、质粒的分类

（一）根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类：

致育（fertility）质粒 /F质粒：仅携带转移（tra）基因，并且除了能够促进质粒有性结合的转移外，不再具备其他的特征，如大肠杆菌的F质粒。

耐药性（resistance）质粒 / R质粒：携带有能够赋予宿主细菌对某一种或多种抗菌药的耐药性的基因，如抗氯霉素、青霉素或水银。如RP4，发现于假单胞杆菌。

Col 质粒（col plasmid）：编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的蛋白，如存在于E. coli 中的CoE1。

图3-2 利用抗性基因进行重组子的筛选

降解质粒（degradative plasmid）:使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如：甲苯，水杨酸，例如，假单胞菌中的TOL质粒。

毒性质粒（virulence plasmid）：赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的Ti质粒（Ti plasmid），能够在双子叶植物中诱导冠瘿瘤。

2.2 噬菌体

一、λDNA载体

（一）λ噬菌体的分子生物学

λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成

1) λ-DNA的物理图谱

λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如，所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对λ基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起作用。

图3-11 cos位点的作用

2）感染周期

噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入

（1）吸附吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。

（2）DNA注入

（3）DNA复制从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，λ-DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。

（4）包装包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，

形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。

包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责

被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA 本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。

（5）裂解每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。

图3-12 λ噬菌体的侵染循环

3）溶源状态的建立

噬菌体感染大肠杆菌后除了可能裂解细胞外，也可能直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不裂解细菌，这种情况的为溶源状态，整合重要由-DNA上

的cI和int两基因的产物所激活，而这个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使λ-DNA或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。

（二）λ－DNA载体的构建

建立λ克隆载体前需要解决2个问题：

1）λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。

2）λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。

Ⅰ. 缩短长度

野生型λ－DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA 片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实λ－DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。

图3-13 λ－DNA的结构

Ⅱ.修饰酶切识别位点

天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会

被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。

图3-16 通过自然选择法筛选无EcorI识别位点的λ-噬菌体

（三）λ-DNA作为载体的优点

1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌

2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量

3) 重组λ-DNA的筛选较为方便

4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易

二、柯斯质粒（粘性质粒，cosmid）

（一）柯斯质粒的构建

λ-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA

片段，柯斯质粒就是应这种需要而人工组建的。

柯斯质粒顾名思义就是含有λ-DNA两端cos区的质粒。由于λ-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象λ-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。

图3-17 Cos质粒pJB8

（二）柯斯质粒的优越性：

1) 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞

2) 可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA

3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选

4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。

图3-18 利用Cos质粒进行克隆

三、M13-DNA

（一） M13单链噬菌体的分子生物学

M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛

内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。

图3-19 M13噬菌体的侵染循环

（二） M13-DNA载体家族

1. M13mp载体家族

M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ'、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ’基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。

M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。

M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ’基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。

图3-20 外源基因由M13mp8向M13mp9载体的转移

2. 噬菌粒（Phagemid）

质粒与M13-DNA的重组体，它带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样更于筛选及克隆，同时由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及λ-DNA。

图3-21 pEMBL8的结构

图3-22 将pEMBL8转化为单链形式

（三） M13-DNA作为载体的优点及用途

最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途：

（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序

（2）用于单链DNA的定点诱变

（3）用于合成探针

2.3 构建基因文库的大容量载体

一、构建文库需要的克隆的数目

不同载体承载外源DNA片段大小的能力是不同的。如λ载体可以插入20kb 的片段，粘粒可以携带40kb的片段。质粒的最大插入片断是8kb，M13只能插入小于3kb的分子。克隆片段的能力决定了构建生物基因文库需要的克隆的数目。建立一个基因文库需要克隆的数目，可以通过下面的公式计算：

N=ln(1-P)/ln(1-a/b)

N=所需要的克隆数

P=可能性，一般用95%的可能性所有的基因都包括在内

a=插入在踢得DNA片段的平均大小

b=整个基因组的大小

表中给出了多种生物体基因文库所需要的克隆的数目。获得成千上万的克隆是完全可能的，所以这样大小的基因文库是合理的。然而，科学家们一直致力于寻找大容量的载体，以便降低克隆数目的方法。

二、大容量的载体

a)噬菌体P1，头部可以装入110kb得DNA片段，以P1为基础的粘粒，可以插入70-100kb得DNA分子，这样可以将人类基因文库克隆的数目从257000个（λ粘粒）降低到90000个。

b)以F质粒为基础称为细菌人工染色体或者BACs，可以插入300kb的片段，只需要30000个克隆就可以建立人类的基因文库。

c) 酵母人工染色体（YACs），可以克隆600kb的片段，一些特殊的类型可以携带1400kb片段，可以是人类基因文库的克隆是降至6500个。