黄嘌呤氧化酶抑制剂_超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立_谢涛
黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立
谢涛?, 秦至臻?, 周睿, 赵赢, 杜冠华*
(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室, 北京 100050)
摘要: 本文建立了适用于同时筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的双靶点高通量复合筛选模型。在黄嘌呤氧化酶超氧阴离子生成体系中,加入WST-1作为超氧阴离子生成量的探针,以反应体系中标识性产
物尿酸为黄嘌呤氧化酶活性指示剂, 采用SpectraMax M5酶标测试仪, 同时检测两种指示剂的浓度变化, 通过
对反应体系中的影响因素进行优化建立双靶点HTS筛选模型, 并利用阳性药物对该模型进行评价。在反应体系
中, 反应终体积50 μL, 黄嘌呤氧化酶4 mU·mL?1、黄嘌呤250 μmol·L?1、WST-1浓度为100 μmol·L?1, 黄嘌呤氧
化酶抑制剂筛选模型的Z'-因子为0.5374, S/N为47.5199; 超氧阴离子清除剂筛选模型的Z'-因子为0.5074, S/N
为5.3889。结果表明, 本文建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/氧自由基清除剂高通量筛选模型具有稳定性好、成本较
低和重复性高等特点, 可以广泛应用于药物筛选。
关键词: 高通量筛选方法; 黄嘌呤氧化酶; 超氧阴离子清除剂; 抗氧化; 药物评价
中图分类号: R965 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2015) 04-0447-06 Establishment of double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers
XIE Tao?, QIN Zhi-zhen?, ZHOU Rui, ZHAO Ying, DU Guan-hua*
(Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identification and Drug Screening, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)
Abstract: A double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers was established. In the reaction system of xanthine oxidase, WST-1 works as the probe for the ultra oxygen anion generation, and product uric acid works as xanthine oxidase activity indicator. By using SpectraMax M5 continuous spectrum enzyme sign reflectoscope reflector, the changes of these indicators’ concentration were observed and the influence factors of this reaction system to establish the high throughput screening model were studied. And the model is confirmed by positive drugs. In the reaction system, the final volume of reaction system is 50 μL and the concentrations of xanthine oxidase is 4 mU·mL?1, xanthine 250 μmol·L?1 and WST-1 100 μmol·L?1, separately. The Z'-factor of model for xanthine oxidase inhibitors is 0.5374, S/N is 47.5199; the Z'-factor of model for superoxide anion scavengers is 0.5074, S/N is 5.3889. This model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers has more common characteristics of the good stability, the fewer reagent types and quantity, the good repeatability, and so on. And it can be widely applied in high-throughput screening research.
Key words: high throughput screening method; xanthine oxidase; superoxide anion scavenger; antioxidant;
drug evaluation
收稿日期: 2014-10-20; 修回日期: 2014-12-22.
基金项目: 重大新药创制科技重大专项 (2012ZX09101); 国际合作项目 (2012DFH30070).
?并列第一作者.
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-63165184, E-mail: dugh@https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html,
痛风是目前常见严重的代谢性疾病, 以高尿酸血症为特征并通过尿酸在关节处形成晶体, 引起与自由基损伤相关的组织损伤, 危害患者运动功能并引起巨大痛苦。黄嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase, XO)[1]是一种黄素蛋白酶, 存在于多种生物体中, 可催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸, 在此过程中伴随着超氧阴离子的产生[2]。当体内XO活性过高, 引起尿酸生成过多, 将导致高尿酸血症, 进而引发痛风[3, 4]。黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇通过抑制体内XO的活性而减少尿酸生成, 对高尿酸血症和痛风产生良好的防治效果[5]。近年又发现, 黄嘌呤氧化酶抑制剂对缺血再灌注损伤[6]、内皮损伤[7]和心功能衰竭[8]具有明显的保护作用, 有可能成为治疗心血管系统疾病尤其是心衰的药物。虽然XO抑制剂具有现实和潜在价值, 但临床应用的该类药物品种极少, 而且别嘌醇作为嘌呤类似物, 对人体正常嘌呤代谢也会产生不良影响[9], 限制了其应用, 因此发现和寻找具有新结构的XO抑制剂具有重要的现实意义。
在正常状态下, O2?－自由基作为新陈代谢的活性中间体, 在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身具有一定的O2?－清除能力。细胞色素c[10]、超氧化物歧化酶等可以将其转化为无害物质。当细胞受到外界刺激或发生病变时会产生过量的O2?－引起氧化应激, 引起多种生理病变[11]。在痛风患者体内, 次黄嘌呤和黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶作用被氧化成尿酸过程中会产生大量的超氧阴离子[12], 继而引起氧化和抗氧化体系失衡, 故痛风患者发生心脑血管疾病的可能性也大为提高[13]。因此, 异常状况下O2?－的清除对于维持正常的生理活动具有重要意义。
近年来, 陆续报道了关于评价黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的方法。黄嘌呤氧化酶抑制剂活性的测定可以通过定量测定酶的反应产物尿酸以及超氧阴离子的含量。尿酸的含量可以通过分光光度法[14]或液相色谱法[15]的方法来定量。超氧阴离子可通过化学发光方法[16]或光谱法进行定量。电子自旋共振法也可用于检测和量化超氧阴离子[17]。这些方法有时也被用来评估超氧阴离子清除活性化合物。然而, 上述方法不能同时测定化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧化物清除活性, 且一些方法容易得到假阳性和阴性结果。刘书等[18]利用UHPLC- TQ-MS方法实现了黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的同时检测, 这种方法虽然灵敏, 但操作较复杂, 且成本较高, 不能满足快速大量的高通量筛选的要求。
本研究利用自动加样器和384微孔板, 通过酶标仪检测紫外与可见光吸收, 可以实现化合物黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧阴离子清除活性的双重评价。
材料与方法
试剂丹酚酸A (salvianolic acid A, SAA), 中国医学科学院药物研究所新药筛选中心自制, 批号20101109; 黄嘌呤 (xanthine, Xan), 批号95490, 购自Fluka公司; WST-1, 生产批号EQ756, 购自日本Dojindo Laboratory公司; 焦磷酸钠, 批号L590L06, 购自Amethyst Chemicals公司; 别嘌呤醇 (allopurinol, Allo), 批号A8003, 购自北京华迈科生物技术有限责任公司; 黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO), 批号SLBB1570V, 购自美国Sigma Aldrich公司; EDTA, 生产批号20120412, 购自国药集团化学试剂有限公司。
仪器SpectraMax M5连续光谱酶标测试仪 (MD 公司); Corning 384孔紫外板 (Corning Incorporated公司); Mini Sharkeer (MH-1, Kylin-Bell Lab Instruments 公司); Purelab Plus型超级应用型超纯水器(美国PALL公司)。
试剂配制
0.1 mol·L?1焦磷酸钠缓冲液 (Buffer) 用双蒸水配制0.1 mol·L?1焦磷酸钠溶液, 含0.3 mmol·L?1 EDTA, 超声溶解, 调pH 8.3, 现用现配。
WST-1工作液双蒸水配制WST-1储备液 (6.51 g·L?1), 避光4℃保存; 取WST-1储备液288 μL+Buffer 6912 μL混匀, 避光, 现用现配。
黄嘌呤 (Xan) 工作液取双蒸水配制黄嘌呤储备液 (100 mmol·L?1), 避光4℃保存; 将黄嘌呤储备液稀释为梯度浓度为30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.1 mmol·L?1的工作液。
黄嘌呤氧化酶工作液将母液 (7.2 U·mL?1) 稀释至浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.01 mU·mL?1的工作液。
阳性药黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇(10mmol·L?1); 超氧阴离子清除剂丹酚酸A (1 mmol·L?1)。
反应体系的优化
黄嘌呤氧化酶浓度的确定黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸, 伴随着超氧阴离子的产生。WST-1与超氧阴离子反应生成水溶性的染料甲臜, 该反应步骤可以被黄嘌呤氧化酶抑制剂抑制, 也可被超氧阴离子清除剂抑制。通过在450 nm处检测甲臜的光吸收可以定量反映体系中超氧阴离子的含量, 从而用于氧自由基清除剂的筛选。尿酸是黄嘌呤氧化酶的
谢 涛等: 黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立
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终产物, 在295 nm 处有特异性光吸收, 可以通过定量检测尿酸含量, 评价黄嘌呤氧化酶的活性, 用于筛选样品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。黄嘌呤氧化酶 设置工作浓度梯度分别为100、30、10、3、1、0.3、0.1 mU·mL ?1, Xan 浓度为1 mmol·L ?1, WST-1为400 μmol·L ?1。各组分体积见表1的标准孔, M5酶标仪双波长检测吸光度 (OD 295, OD 450), 以OD 295的动态变化斜率 (k 295) 来表示XO 的酶反应速率 (v )。绘制反应曲线, 选取酶反应速率动态曲线为直线部分的酶浓度为反应最佳酶浓度。
底物黄嘌呤浓度的确定 底物黄嘌呤设置工作浓度梯度分别为30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 mmol·L ?1, XO 浓度10 mU·mL ?1, WST-1 400 μmol·L ?1。各组分体积见表1的标准孔, M5酶标仪双波长检测OD 295和OD 450, 以k 295来表示XO 的酶反应速率, 连续测定15 min 。绘制反应曲线, 选取在15 min 内产物生成曲线进入平台期之前的浓度为反应最佳底物浓度。
体系Z ' factor 与信噪比计算 分别建立黄嘌呤氧
化酶反应孔和不加黄嘌呤氧化酶的对照孔各100个, 各组分见表1的标准孔和对照孔。同时进行反应, 反应孔的测定值为信号值, 对照孔的信号值为体系检测背景值, 检测反应体系的Z ' factor 和信噪比S/N 。
Z ' factor = 1 ? 3 × (SD 信号 ? SD 背景) / |M 信号 ? M 背景|
S/N = M 信号 / M 背景
其中SD 为样本标准差; M 为平均值。
阳性药确证 取384孔酶标板, 以黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇和超氧阴离子清除剂丹酚酸A 为阳性药。双蒸水稀释别嘌呤醇成梯度浓度为10 000、3 000、1 000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.03 μmol·L ?1; 双蒸水稀释丹酚酸A 成梯度浓度为300、100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.03 μmol·L ?1, 将阳性药物加入到体系中进行反应, 计算其黄嘌呤氧化酶抑制作
用和自由基清除作用。反应体系见表1。
Table 1 Component of reaction assay. Xan: Xanthine; Allo:
Allopurinol; SAA: Salvianolic acid A; XO: Xanthine oxidase
tion
Conc.
well/μL well/μL well/μL
4×Xan 1 mmol·L ?1
12.5 12.5 12.5 4×WST-1 400 μmol·L ?1
12.5 12.5 12.5
Buffer 0.1 mol·L ?1 5
25
10×Allo/SAA ? 0 5 0
2.5×XO
10 mU·mL ?1
20 20 0
计算公式 黄嘌呤氧化酶活性用OD 295在15 min 内的动态变化斜率k 295表示: I (%) = (k 标准 ? k 检测) / (k 标准 ? k 空白) × 100%; 自由基清除能力用反应15 min 后产物的OD 450表示: I (%) = (OD 标准 ? OD 检测) / (OD 标准 ? OD 空白) × 100%。
结果
1 反应体系的优化
1.1 黄嘌呤氧化酶浓度优化 50 μL 体系中底物Xan 工作浓度为1 mmol·L ?1, WST-1工作浓度400 μmol·L ?1, 不同梯度浓度XO 反应15 min, 在0.01～30 mU·mL ?1内, 反应速率随XO 浓度升高而升高; 当酶浓度达到100 mU·mL ?1时反应速率下降, 产物不再增加, 形成S 形曲线 (图1), 表明反应15 min 时, 此浓度下XO 已将体系中的底物 (1 mmol·L ?1) 全部耗竭。XO 浓度达到30 mU·mL ?1时反应速率最大 (图1A), 底物被完全消耗 (图1B)。选取S 形曲线线性部分的中点即10 mU·mL ?1为体系最佳酶浓度。 1.2 底物黄嘌呤浓度优化 50 μL
体系中底物黄嘌
呤氧化酶工作浓度为10 mU·mL ?1, WST-1工作浓度400 μmol·L ?1, 加入梯度浓度底物黄嘌呤, 动态监测反应产物尿酸和超氧阴离子的产量。Xan 浓度小于
Figure 1 Relationship between XO concentration and XO activity (A) and radical production (B). Different concentrations of XO
(100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 mU·mL ?1) is added in the system. The velocity (k 295) represents the activity of XO, while OD 450 represents the amount of superoxide anion. k 295 and OD 450 are continuously monitored for 15 min
?450?药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (4): 447?452
1 mmol时, 反应速率(图2A) 和产物(图2B) 均随底物浓度增加而迅速增加, 当底物浓度大于 1 mmol 时, 反应速率(图2A) 和产物(图2B) 增速减慢, 进入平台期。故50 μL反应体系中, 10 mU·mL?1 XO反应15 min, Xan的最佳浓度为1 mmol·L?1。
Figure 2 Relationship between Xan concentration and XO activity (A) and radical production (B). Different concentrations of Xan (100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 mmol·L?1) is added in the system. k295 and OD450 are continuously monitored for 15 min. The velocity (k295) represents the activity of XO, while OD450 represents the amount of superoxide anion
2 体系Z' factor与信噪比计算
参照优化条件, 建立黄嘌呤氧化酶反应孔 (XO 10 mU·L?1, Xan 1 mmol·L?1) 以及对照孔 (Xan 1 mmol·L?1) 各100个, 检测反应体系的Z'-因子和信噪比S/N。黄嘌呤氧化酶活性检测体系的指标k295的Z'-因子为0.5374>0.4, S/N为47.5199>3.5; 指标OD450的Z'-因子为0.5074>0.4, S/N为5.3889>3.5, 表明模型稳定可靠(图3)。
3 阳性药验证
别嘌醇对反应速率和反应产物自由基的产生均表现出良好的抑制作用; 丹酚酸A只对自由基产生浓度依赖性抑制作用。别嘌醇抑制XO活性的IC50为(3.28±1.15) μmol·L?1, 同时减少氧自由基的生成, 其IC50为 (3.31±1.20) μmol·L?1 (图4A-1, A-2); 丹酚酸A 对黄嘌呤氧化酶反应速率没有抑制作用, 但可以清除反应产生的氧自由基, 其对氧自由基清除的IC50为 (1.44±0.32) μmol·L?1 (图4B-1, B-2)。说明该体系
Figure 3 Evaluation of XO inhibitory and radical scavenging assay. In the 50 μL reaction system, standard poles (XO 10 mU·L?1, Xan 1 mmol·L?1) and comparison poles (Xan 1 mmol·L?1, XO 0 mU·mL?1) were established for a number of 100. k295 and OD450 are continuously monitored for 15 min
可以反映黄嘌呤氧化酶抑制剂的活性以及自由基清除剂的清除情况, 用于XO抑制剂和自由基清除剂的筛选。
讨论
高尿酸血症和痛风的生化基础是体液中尿酸浓度过高, 而体内黄嘌呤氧化酶活性异常增高是主要机制, 因此黄嘌呤氧化酶是高尿酸血症和痛风的良好治疗靶点。并且, 黄嘌呤氧化酶活性异常增高会引起超氧阴离子等一些活性氧的大量产生, 进而引起一些并发症的出现。故研发黄嘌呤氧化酶抑制剂以及超氧阴离子清除剂具有很大的临床应用价值。
黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选通过直接检测化合物对XO的抑制活性, 评价其对XO的抑制活性。黄嘌呤氧化酶反应产生的氧自由基, 与WST-1反应生成的产物甲臜在450 nm处有最大光吸收, 这是一个常规的评价自由基清除剂的体系。而XO催化生成的产物尿酸, 则在295 nm有最大光吸收。化合物作用在该反应体系后, 双波长检测OD295和OD450, 可以同时检测化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性和氧自由基清除能力, 一个反应检测两个指标, 极大节省了资源, 具有经济高效的特点。根据此特点, 本研究建立黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂复合筛选模型,
谢 涛等: 黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立
? 451 ?
Figure 4 XO inhibitory and radical scavenging activity of Allo (A-1, A-2) and SAA (B-1, B-2). In the group of Allo, different concentrations of Allo were added into the reaction system. In the group of SAA, different concentrations of SAA were added into the reaction system
并对反应条件进行摸索。
在本实验的黄嘌呤氧化酶反应体系中, 反应速率用单位时间内产生的尿酸 (检测波长295 nm) 的变化来反映, 即OD 295在一定时间内变化的斜率k 295。在一定温度和pH 下 (本实验中体系温度为37 ℃, pH 为8.3), 当体系中底物浓度大大超过酶浓度时, 酶反应速率与酶浓度成正比, 作用曲线呈线性。而随着时间延长, 体系中底物的消耗导致反应速率逐渐减慢。因此酶反应初速度的测定应该控制在反应初期, 以反应速率?酶浓度作图, 可以准确反映酶反应速率的点在该曲线的线性部分。XO 浓度在3～30 mU·mL ?1内反应速率曲线表现为线性, 在此浓度区间内酶反应速率可以真实反映酶活性的大小, 选取较低的酶浓度10 mU·mL ?1, 足以保证反应体系结果的准确性, 同时避免高浓度酶的浪费。同时, 在酶浓度过高、短时间内即将体系中底物耗竭, 由于尿酸不再增加, 表现出反应速率随着时间延长而下降。因此, 当XO 浓度达到100 mU·mL ?1时, 反应速率反而下降。
确定酶浓度后需要确定酶反应所需最佳底物浓度。在酶浓度不变的情况下, 当底物浓度很低时, 反应速率随底物浓度增加迅速增加; 当底物浓度超过一定范围、反应速率的增幅逐渐下降至底物将酶完全饱和时, 反应速率不再加快。因此在反应速率?底物浓度曲线图上, 选择反应速率进入平台期前的拐点,
作为底物浓度即保证了底物量充足, 又避免了浪费。
在反应体系中, WST-1为超氧阴离子生成量的探针, 反应体系中标识性产物尿酸为黄嘌呤氧化酶活性指示剂。在正常的酶促反应中, 尿酸的生成与超氧阴离子的生成具有一致性。如果化合物具有酶抑制 活性没有超氧阴离子清除活性, 则表现为尿酸的减少量与超氧阴离子的减少量一致, 在反应指标上体现为酶活性抑制的IC 50与超氧阴离子清除的IC 50一致; 如果化合物既具有酶抑制活性又具有超氧阴离子清除活性, 则尿酸减少量少于超氧阴离子减少量, 在反应指标上体现为酶活性抑制的IC 50大于超氧阴离子清除的IC 50; 如果化合物只具有超氧阴离子清除活性, 则只能计算出超氧阴离子清除的IC 50; 如果化合物只具有黄嘌呤氧化酶抑制活性, 则只能计算出酶活性抑制的IC 50。综上, 本模型可以实现化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性以及超氧阴离子清除活性的双重评价。
References
[1]
Parks DA, Granger DN. Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and physiology [J]. Acta Physiol Scand Supple, 1986, 548: 87?99. [2]
Enroth C, Eger BT, Okamoto K, et al. Crystal structures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:
? 452 ? 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (4): 447?452
structure-based mechanism of conversion [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 10723?10728. [3]
Kong LD, Cai Y, Huang WW, et al. Inhibition of xanthine oxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout [J]. J Ethnopharmacol, 2000, 73: 199?207.
[4] Liu X, Chen R, Shang Y, et al. Superoxide radicals
scavenging and xanthine oxidase inhibitory activity of magnesium lithospermate B from Salvia miltiorrhiza [J]. J Enzyme Inhib Med Chem, 2009, 24: 663?668. [5]
Tausche AK, Jansen TL, Schroder HE, et al. Gout ? current diagnosis and treatment [J]. Dtsch Arztebl Int, 2009, 106: 549?555. [6]
Peglow S, Toledo AH, Anaya-Prado R, et al. Allopurinol and xanthine oxidase inhibition in liver ischemia reperfusion [J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2011, 18: 137?146.
[7] Kelkar A, Kuo A, Frishman WH. Allopurinol as a cardio-vascular drug [J]. Cardiol Rev, 2011, 19: 265?271.
[8] Higgins P, Dawson J, Lees KR, et al. Xanthine oxidase inhibition for the treatment of cardiovascular disease: a systematic review and meta-analysis [J]. Cardiovasc Ther, 2012, 30: 217?226.
[9] Dogan A, Yarlioglues M, Kaya MG, et al. Effect of long-term and high-dose allopurinol therapy on endothelial function in normotensive diabetic patients [J]. Blood Press, 2011, 20: 182?187.
[10] Pasdois P, Parker JE, Griffiths EJ, et al. The role of oxidized
cytochrome c in regulating mitochondrial reactive oxygen species production and its perturbation in ischaemia [J]. Bi-ochem J, 2011, 436: 493?505.
[11] Wang Z, Zhang LM, Tian Y. Progress on electrochemical
determination of superoxide anion [J]. Chin J Anal Chem (分析化学), 2014, 42: 1?9.
[12] Wu XJ, Wang YP, Wang W, et al. Free radical scavenging and
inhibition of lipid peroxidation by magnesium lithospermate B [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2000, 21: 855?858.
[13] Janssens HJ, Van De Lisdonk EH, Bor H, et al. Gout, just a nasty event or a cardiovascular signal? A study from primary care [J]. Fam Pract, 2003, 20: 413?416.
[14] Lin CM, Chen CS, Chen CT, et al. Molecular modeling
of flavonoids that inhibits xanthine oxidase [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 294: 167?172.
[15] Nagao A, Seki M, Kobayashi H. Inhibition of xanthine oxidase by flavonoids [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1999, 63: 1787?1790.
[16] Greenway GM, Leelasattarathkul T, Liawruangrath S, et al.
Ultrasound-enhanced flow injection chemiluminescence for determination of hydrogen peroxide [J]. Analyst, 2006, 131: 501?508.
[17] Takanami Y , Nakayama T. Evaluation of superoxide anion
radicals generated from an aqueous extract of particulate phase cigarette smoke by electron spin resonance using 5, 5-dimethyl- 1-pyrroline-N -oxide [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2011, 75: 34?39.
[18] Liu S, Xing J, Zheng Z, et al. Ultrahigh performance liquid
chromatography-triple quadrupole mass spectrometry inhibitors fishing assay: a novel method for simultaneously screening of xanthine oxidase inhibitor and superoxide anion scavenger in a single analysis [J]. Anal Chim Acta, 2012, 715: 64?70.
降尿酸的药物及分类
降尿酸的药物及分类 第一类为抑制尿酸合成的药。其代表药是别嘌醇(别嘌呤醇)。别嘌醇可用于各种年龄的原发性和继发性痛风病人，不受肾功能的限制，故痛风病人合并肾功能不全、肾结石及尿酸排出过多应首选本药。与促尿酸排泄药合用有协调作用。因药源充足、廉价，是较理想的降尿酸药之一。 别嘌醇为黄嘌呤氧化酶抑制剂，其结构类似次黄嘌呤，有较强的抑制黄嘌呤氧化酶作用，从而阻断次黄嘌呤向黄嘌呤、黄嘌呤向尿酸的代谢转化，可减少尿酸的生成，降低血尿酸浓度。该药能在PRPP(5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶)存在时转变成相对应核苷酸，消耗PRPP使IMP(次黄嘌呤核苷酸)合成减少，从而可迅速降低血尿酸值，抑制痛风石和肾结石形成，并促进痛风石溶解。 适应证：⑴尿酸合成过多而导致的高尿酸血症。⑵肾功能严重损害而不能使增大的尿酸负荷排出者。⑶大剂量尿酸排泄促进剂无效或过敏，或不能耐受者。⑷肾尿酸结石反复形成者。⑸每日尿酸排泄超过5.9毫摩尔(1000毫克)者，易发生尿酸性肾结石的危险。⑹有较大的多部位痛风结节者(需要两种药联用以阻断尿酸的产生和增加尿酸的排泄)。⑺继发于骨髓增殖性疾病的高尿酸血症，特别是细胞毒制剂治疗前的患者，否则大量尿酸从肾排出，可发生急性肾小管阻塞。 用法：别嘌醇开始每天100毫克，每日2～3次口服，可逐渐增至每次200毫克，每日3～4次，每日最大剂量不超过600毫克为宜。血尿酸浓度正常后逐渐减至维持量，每次100毫克，每日1～2次。其副作用为过敏性皮疹、药物热、肠胃不适、白细胞及血小板减少、肝功能损害等。 注意事项：①需从小剂量开始，逐渐增加剂量，以免血尿酸浓度急剧下降而诱发痛风急性发作。②定期复查周围血象、肝功能等。 第二类是促进肾脏排泄尿酸药。主要用于无明显肾功能损害、60岁以下的痛风或高尿酸血症病人，尤适用于痛风结节较多者。用药后尿液酸碱度(pH值)迅速下降者要大量饮水并同服碱性药，以减少尿酸盐在肾脏沉积，防止结石形成。常用的促肾排尿酸药有苯溴马隆(痛风利仙)、丙磺舒(羧苯磺胺)，属磺胺类药，对磺胺过敏者禁用，长期应用要定期查全血细胞，防止骨髓抑制现象发生。磺吡酮(苯磺唑酮)，可作为磺胺过敏者丙磺舒的替代物。 适用于尿酸排泄低下型高尿酸血症，如果肾功能有轻度损害也可应用，有时在促进尿酸排泄增多后，肾功能也可得到改善。该类药物主要通过抑制近端肾小管对尿酸的重吸收而促进尿酸的排泄。 药物和用法： (1)丙磺舒(羧苯磺胺)：是一种有效的尿酸排泄促进剂,每天1克可使肾对尿酸的排泄平均增加50％，血尿酸平均下降30％。开始时每次0.25克，每日2次，2周内递增至每次O.5克，每日2～3次，如果血尿酸明显高于正常，可每1～2周再增加0.5克，直至血尿酸降至正常水平。每日最大剂量2克以下。高尿酸血症控制后可再逐渐减量维持。约5％患者有皮疹、发热、胃肠刺激、肾绞痛及激发急性痛风发作等副作用。
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用_尚雁君
第二军医大学学报Acad J Sec M il M ed Univ 2006Feb ;27(2) 189 论 著 迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用 尚雁君1,黄才国1*,蒋三好2,朱大元2,魏善建1,焦炳华1 (1.第二军医大学基础医学部生物化学和分子生物学教研室,上海200433,2.中国科学院上海药物研究所,上海201203)[摘要] 目的:研究迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。方法:将20、40、60μg /ml 迷迭香酸或1μg /ml 阳性对照别嘌呤醇,分别加入黄嘌呤溶液(测尿酸生成量:1mmol /L ;测超氧离子:50μmol /L )和0.1U /ml 黄嘌呤氧化酶中,用生化仪测定5min 尿酸生成量和超氧离子生成(NBT 显色法)。在1ml 2×105/ml HL -60细胞悬液中加入100μl 6mo l /L 黄嘌呤、100μl 0.1U /ml 黄嘌呤氧化酶、500μg /ml 迷迭香酸,分别以Annexin Ⅴ-P I 双标试剂盒法(以1μg /ml 别嘌呤醇为阳性对照)或细胞周期法(以100U /ml SO D 为阳性对照)测定细胞凋亡率。结果: 迷迭香酸显著抑制尿酸生成和超氧离子引起的N BT 显色,两种方法测得其IC 50分别为56μg /ml 和21μg /ml ;对细胞凋亡的抑制率均在40%以上。 结论: 迷迭香酸是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂。 [关键词] 迷迭香酸;黄嘌呤氧化酶;尿酸;超氧离子;细胞凋亡 [中图分类号] R 285.5 [文献标识码] A [文章编号] 0258-879X (2006)02-0189-03 Inhibition of xathine oxidase by rosmarinic acid S HA N G Y an -jun 1,HU A NG Cai -guo 1*,JI AN G San -hao 2,Z H U Da -y uan 2,W EI Shan -jian 1,JIAO Bin -hua 1(1.Depar tme nt of Bio chemistry and M o lecular Bio log y ,Co llege of Basic M edical Science s ,Second M ilitary M edical U niver sity ,Shanghai 200433,China ;2.Shanghai I nstitute of M ateria M edica ,Shanghai 201203) [ABSTRACT ] Objective :T o study the inhibito ry effect of rosmarinic acid on x anthine ox idase.Methods :Xanthine ox idase (0.1U /ml )w as incuba ted with xa nthine (1mmol /L for determining for ma tion of uric acid ;50μmo l/L fo r de te rmining super -o xide anions )in the presence of 20,40and 60μg /ml rosmarinic acid o r allo purino l as positiv e contro l.T he forma tion o f uric acid w as deter mined by automatic bio chemical analyzer 5min after reactio n and the production of supero xide anio ns w as meas -ured by N it ro Blue Btetr azo lium (NBT )reduction.HL -60cells (1ml ,2×105/ml )wer e pretrea ted w ith xanthine (100μl ,6mol /L )and xanthine o xidase (100μl ,0.1U /ml ),then ro smarinic acid (500μg /ml )o r allopurinol (1μg /ml ,a s positive con -trol )(A nnexin Ⅴ-P I kit )was added to de te rmine the cell a po pto sis rate.H L -60cells (1ml ,2×105/ml )w ere also pre treated with xanthine (100μl ,6mo l/L )and x anthine ox idase (100μl ,0.1U /m l ),then ro smarinic acid (500μg /ml )or SO D (100U /ml ,a s positive contro l )(cell cycle me tho d )was added to de te rmine the cell apopto sis rate.Results :Ro smarinic acid obvio usly inhibited the production of uric acid and supero xide anion -induced reaction in N BT assay ,with their IC 50being 56μg /ml and 21μg /ml ,respec tively.T he rates of apoptosis inhibitio n by ro sma rinic acid w ere bo th o ver 40%by Annexin Ⅴ-PI kit and cell cy -cle me tho d.C onclusion :Rosmarinic acid is a competitive inhibito r of x anthine o xidase.[KEY WORDS ] rosmarinic acid ;xanthine oxidase ;uric acid ;super oxide anio ns ;apo pto sis [A cad J Sec M il M ed U niv ,2006,27(2):189-191] [基金项目] 国家自然科学基金(29632050).S upported b y National Natural Science Foundation of China (29632050).[作者简介] 尚雁君,硕士生.E -m ail :syjsmm u @https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html, *Corres ponding autho r.E -mail :hu angcaig @h https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html, 丹参是临床上常用的活血化瘀药,是唇形科植 物丹参Salvia miltiorrhiza Bung e 的根,常用于妇科病、冠心病、缺血性脑卒中、动脉粥样硬化等症的治疗。临床上丹参制剂对冠心病、脑血栓、肝炎、肝硬化等有显著的疗效。丹参的活性成分主要分为脂溶性和水溶性两类。中医传统用药方法是用其水煎剂,即丹参的水溶性部位,所以研究丹参的水溶性成分更有意义[1] 。研究表明其水溶性成分主要是丹参素、原儿茶醛、丹酚酸。丹酚酸是一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木脂素骨架的水溶性成分。丹酚酸类化合物包括丹酚酸A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H 、I ,迷迭香酸(ro smarini acid ),紫草酸(litho spermic acid ) 等,其中迷迭香酸是由1分子丹参素和1分子咖啡 酸缩合而成。黄嘌呤氧化酶是人体内产生尿酸过程中的关键酶,同时也是治疗痛风时药物的作用靶点,本文研究其对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。1 材料和方法 1.1 试剂 H L -60细胞株,购自上海中国科学院细胞所;Annexin Ⅴ-PI 双标试剂盒购自晶美公司;黄
超氧阴离子产生速率测定
超氧阴离子产生速率测定 羟氨氧化法 (王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理 植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·ˉ、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。 二、材料、仪器设备与试剂 (一)材料 植物叶片、花瓣等器官 (二)仪器设备 低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、 研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架 (三)试剂 (1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的 Na2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH) (2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷) (3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500mL，(冷，磁) (4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全) 三、试验步骤 (1)制做亚硝酸根标准曲线 2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线 (2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨
如何清除体内自由基
如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由
黄嘌呤氧化酶抑制剂_超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立_谢涛
黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立 谢涛?, 秦至臻?, 周睿, 赵赢, 杜冠华* (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室, 北京 100050) 摘要: 本文建立了适用于同时筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的双靶点高通量复合筛选模型。在黄嘌呤氧化酶超氧阴离子生成体系中,加入WST-1作为超氧阴离子生成量的探针,以反应体系中标识性产 物尿酸为黄嘌呤氧化酶活性指示剂, 采用SpectraMax M5酶标测试仪, 同时检测两种指示剂的浓度变化, 通过 对反应体系中的影响因素进行优化建立双靶点HTS筛选模型, 并利用阳性药物对该模型进行评价。在反应体系 中, 反应终体积50 μL, 黄嘌呤氧化酶4 mU·mL?1、黄嘌呤250 μmol·L?1、WST-1浓度为100 μmol·L?1, 黄嘌呤氧 化酶抑制剂筛选模型的Z'-因子为0.5374, S/N为47.5199; 超氧阴离子清除剂筛选模型的Z'-因子为0.5074, S/N 为5.3889。结果表明, 本文建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/氧自由基清除剂高通量筛选模型具有稳定性好、成本较 低和重复性高等特点, 可以广泛应用于药物筛选。 关键词: 高通量筛选方法; 黄嘌呤氧化酶; 超氧阴离子清除剂; 抗氧化; 药物评价 中图分类号: R965 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2015) 04-0447-06 Establishment of double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers XIE Tao?, QIN Zhi-zhen?, ZHOU Rui, ZHAO Ying, DU Guan-hua* (Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identification and Drug Screening, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China) Abstract: A double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers was established. In the reaction system of xanthine oxidase, WST-1 works as the probe for the ultra oxygen anion generation, and product uric acid works as xanthine oxidase activity indicator. By using SpectraMax M5 continuous spectrum enzyme sign reflectoscope reflector, the changes of these indicators’ concentration were observed and the influence factors of this reaction system to establish the high throughput screening model were studied. And the model is confirmed by positive drugs. In the reaction system, the final volume of reaction system is 50 μL and the concentrations of xanthine oxidase is 4 mU·mL?1, xanthine 250 μmol·L?1 and WST-1 100 μmol·L?1, separately. The Z'-factor of model for xanthine oxidase inhibitors is 0.5374, S/N is 47.5199; the Z'-factor of model for superoxide anion scavengers is 0.5074, S/N is 5.3889. This model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers has more common characteristics of the good stability, the fewer reagent types and quantity, the good repeatability, and so on. And it can be widely applied in high-throughput screening research. Key words: high throughput screening method; xanthine oxidase; superoxide anion scavenger; antioxidant; drug evaluation 收稿日期: 2014-10-20; 修回日期: 2014-12-22. 基金项目: 重大新药创制科技重大专项 (2012ZX09101); 国际合作项目 (2012DFH30070). ?并列第一作者. *通讯作者 Tel / Fax: 86-10-63165184, E-mail: dugh@https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html,
超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究
网络出版时间：2012-12-19 08:52 网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html,/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html 2012-11-20 超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其 应用研究 赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3 (1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广 东广州 510300； 3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085) 摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶 亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。 利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系 产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。测 定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol?L-1浓度范围内 与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。应用该方法对L-抗坏 血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol?L-1。 关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用 Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian (1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China； 2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou 510300, P.R.China； Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085, P.R.China) Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde based on nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test, elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radical detection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and time of reaction system was 8.2,40 oC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were as follows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relative fluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship, y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid was evaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol?L-1. Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application 中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号： 活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide, 收稿日期：2012 基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海 洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002) 作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：zhaoyq1122@https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html, *通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：laihaoli@https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html,
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展 张海枝，刘鹏，李川，刘长鹰 天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193 摘 要：酶抑制剂类抗糖尿病药物是目前药物研究的热点，而药物筛选技术是制约此类抗糖尿病新药研发速度的关键步骤。主要从分子水平总结近年来报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类候选药物的筛选方法，包括传统方法和前沿方法，着重介绍极具潜力的毛细管电泳法、质谱法、生物传感法和微通道筛选方法等。 关键词：抗糖尿病药物；酶抑制剂；分子水平；药物筛选方法 中图分类号：R977.3 文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2014)08 - 0947 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.08.028 Research progress on drug screening methods at the molecular level for enzyme inhibitors used as anti-diabetic drugs ZHANG Hai-zhi, LIU Peng, LI Chuan, LIU Chang-ying Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract: Various enzyme inhibitors have been demonstrated to be a hotspot in the research area of anti-diabetic drugs, whose development has been greatly limited by the efficiency of diverse drug screening methods. This paper concerns on different types of drug screening methods in the molecular level for enzyme inhibitors used in diabete treatment, including both traditional and advanced methods. Importantly, several screening methods with great potential have been emphasized here, such as capillary electrophoresis, mass spectrometry, biosensors, screening methods based on microchannel and so on. Key words: anti-diabetic drugs; enzyme inhibitors; molecular level; drug screening methods 糖尿病是全世界发病率最高的疾病之一，是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢性疾病。现有报道证实，体内参与血糖调节的多种酶已经成为抗糖尿病药物作用的关键靶点，可为研制治疗糖尿病的药物提供新途径。以靶标酶为作用对象的酶抑制剂可有效抑制血糖的升高，减缓糖尿病并发症的发生和发展，是抗糖尿病药物研发的希望所在[1-2]。目前报道的可用于治疗糖尿病的酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶（AR）抑制剂、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B （PTP-1B）抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、环氧酶-2（COX-2）抑制剂、二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂等[3]。 近年来，组合化学的快速发展已经解决了酶抑制剂类候选药物的大批量合成问题，而如何快速高效准确地筛选出此类抗糖尿病新药是药物研发中的关键难题。现有报道中关于酶抑制剂类候选药物的筛选方法较多，根据所选用的材料和药物作用的对象以及操作特点，可将这些方法大致分为4个水平：整体动物水平、组织器官水平、细胞水平和分子水平。其中，基于分子水平的酶抑制剂类药物筛选方法具有反应体积小、筛选速度快、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等优点，在药物筛选方面具有广阔的应用前景。基于此，本文详细综述了酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法，力图为此类药物的高通量筛选提供借鉴和参考，以期提高抗糖尿病新药的研发速度。目前文献中报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类药物分子水平筛选方法主要 收稿日期：2014-06-28 作者简介：张海枝（1985—），女，湖北黄冈市人，博士，助理研究员，研究方向为分析化学。Tel: (022)23006859 E-mail: zhanghz@https://www.360docs.net/doc/6f17595879.html,
体外筛选具黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然产物
体外筛选具黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然产物近年来,随着人们生活水平的不断提高,痛风的发病率也呈逐渐上升趋势。痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱,产生尿酸过多或尿酸排泄过少而导致血中尿酸升高,尿酸盐结晶沉积在组织中引起的反复发作性炎症疾病。 临床上治疗痛风的方法主要包括促进尿酸排泄和抑制尿酸生成。其中,通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少尿酸的生成被认为是治疗痛风的最有效的方法之一。 体内次黄嘌呤可在黄嘌呤氧化酶的催化下生成黄嘌呤,进一步生成尿酸,故抑制黄嘌呤氧化酶的活性可显著降低尿酸的生成。目前临床应用的抗痛风药物的不良反应越来越突出,人们开始倾向于从天然产物中筛选具有抗痛风活性的化学成分。 我国中药资源丰富、中药的化学成分结构多样,作用靶点众多,因此从中药中筛选高效、低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有良好的应用前景。黄嘌呤氧化酶抑制剂的体外筛选方法包括紫外分光光度法、电化学法、超高效液相色谱法等,但都存在不同的缺点,因此,本课题拟基于高效液相色谱(HPLC)建立一种简单、快捷、准确的体外筛选方法,并利用建立的方法筛选中药及天然产物中具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的先导化合物,为抗痛风新药的研究提供理论依据。 目的建立基于HPLC体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的新方法;利用该方法考察具有抗痛风活性中药的黄嘌呤氧化酶抑制活性;选择活性最好的中药作为研究对象进行活性追踪分离,以期获得活性较好的先导化合物。方法通过HPLC测定酶促反应体系中底物黄嘌呤在反应前后含量的变化,建立体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。 色谱条件如下:Agilent SB-C18柱,4.6 mm′250 mm,5mm;流动相,0.02
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子