真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。
本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定
???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求
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实验内生真菌的分离及鉴定
实验学时：18
实验类型：综合
实验要求：选修
一、实验目的
1.了解真菌形态的基本特征。
2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。
二、实验内容
采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。
三、实验原理、方法和手段
（一）实验原理
根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。
（二）实验手段和方法
1、内生真菌分离纯化方法
1.1样品的表面消毒及预处理
分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。
老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。
对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：
75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块
将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。
灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
底。在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
1.2内生真菌的分离与纯化
将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27℃恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生长情况及污染情况。培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。
2、真菌的形态学鉴定方法
对分离到的内生真菌的分类鉴定主要根据宏观的培养性状（菌落形态），微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分类研究。
2.1 培养性状（菌落形态）
培养基：查氏培养基（Czapek agar）、沙氏培养基和PDA培养基。
方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于25-28℃培养一定时间（通常为7天或14天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。
观察的要点：
大小：以菌落的直径（mm）表示。
颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。
菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。
菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。
菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。
菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。
渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。
2.2个体形态
菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等
分生孢子梗：分支情况--简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光
滑等。
产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）
分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）
2.3真菌制片方法——粘片法
胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。
2.4显微摄影照片
在Motic数码显微镜下，观察并选取具典型性状特征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。
2.5菌种的鉴定
根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。
3、真菌的分子生物学鉴定方法
3.1真菌菌丝的获得
（1）固体培养基培养菌丝体
对于气生菌丝较多的真菌可以选择PDA固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸，27℃培养5-7天。将3-4个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行DNA提取。在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取DNA造成影响。
（2）液体培养基培养菌丝体
培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。121℃，蒸汽灭菌20min。
将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27℃、120rpm 培养5-7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40℃下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行DNA的提取。
3.2基因组DNA的提取
DNA提取采用CTAB法。CTAB（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB 法的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的DNA。
用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：
(1) 将CTAB buffer在65℃水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；
(2) 取0.1g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL预热的提取液及10μLβ-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转入1.5mL离心管中700μL/管；
(3) 于65℃水浴保温0.5-1h，时间不能超过1.5h。保温期间要轻轻振摇几次；
(4) 冷却至室温后，加入等体积(700μL)的饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀后静置10min。
(5) 离心(12000rpm，10min，室温)，去沉淀，将上清液转入干净离心管中。
(6) 根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；
(7) 加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次以去除饱和酚，离心(12000rpm，10min，室温)；
(8) 将上清液逐滴加入两倍体积的-20℃预冷无水乙醇，以沉淀出DNA。室温放置10-20min，可以过夜；
(9) 挑取或离心去上清液(10000 rpm，5min)的方法取出DNA；用75%乙醇洗涤两次；
(10) 37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4℃备用。
3.3多聚酶链式反应(PCR扩增)
3.3.1引物
ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC
3.3.2扩增条件
扩增体系
PCR反应体系为50μL体系，包括：
10×PCR buffer：1/10
MgCl2 ： 1.5mM，
dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）：各200μM，
Primer1 0.2μM，
Primer2 0.2μM，
Taq酶：1~2.5U，
DNA模板：约100ng。
扩增条件
预变性95℃5min
变性95℃1min
复性51℃1min 30~35个循环
延伸72℃1min
延伸补齐72℃10min
3.3.3扩增产物的纯化及序列的测定
送测序公司。
4、保存方法
将所分离的所有纯化菌株采用两种方法保存。
①斜面低温保藏法：
将菌株接种至PDA固体斜面培养基上于27℃下培养，待菌落长满斜面，观察没有污染后，放于4℃的冰箱中保存。这种保藏方法适合本实验条件下各菌种的保藏，保藏时间为三个月到六个月，传代次数过多时容易导致菌种变异退化。
②无菌水保存法：
在柱形Eppendorf离心管中加入2/3体积的蒸馏水，蒸汽灭菌，将带有菌丝的琼脂小块放入无菌水中，4℃的冰箱中保存。此法保存菌株的时间要长于斜面保存。用这种保藏方法可以保藏1-2年。比较而言这种方法是较好的菌种保藏方法。四、实验组织运行要求
采用“集中授课，学生自主训练为主的开放模式组织教学。”
五、实验条件
仪器设备：高压蒸汽灭菌锅，培养箱，调温电炉、摇床、磁力搅拌器、15W紫外灯、超
净工作台、离心机等。1.5mL eppendorf 离心管，研钵，解剖刀，镊子，纱布，滤纸，三角瓶等；胶带，剪刀，镊子，解剖刀，纱布，滤纸，脱脂棉，三角瓶，9或10cm培养皿，玻璃棒，接种钩，接种环
药品和试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
六、实验步骤
（一）培养基配置
1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基
马铃薯汁 1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g
（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。）
2、察氏琼脂培养基
蔗糖30g，NaNO
33g，MgSO
4
.7H
2
O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO
4
.7H
2
O 0.01g，K
2
HPO
4
1g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，自然pH
3、沙氏培养基
蛋白胨 1g，葡萄糖或麦芽糖 4 g，琼脂 1.5克，水 100 ml。
制法：1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115℃20分钟。趁热斜好，凝固备用。
4、马丁氏培养基
葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4?7H2O 0.5g，1%孟加拉红3.3mL，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。
抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45℃左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。
乳酸石炭酸棉蓝染色液
棉蓝（苯胺蓝或甲基蓝）0.025g，乳酸（比重1.20）10g, 石炭酸（结晶）10g，甘油（比重1.25）20g，蒸馏水10 mL。
（二）实验步骤
1、采样
2、内生真菌分离、纯化并保存菌种
3、菌种形态鉴定
（1）将4℃保存菌种活化2次；
（2）将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复3；
（3）25℃恒温培养箱培养7天；
（4）然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态；
（5）另两个平行继续培养至14天，取出；
（6）重复步骤4，作为最终描述结果；
（7）根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。
4、分子生物学鉴定
（1）菌种培养，获取菌丝体
（2）提取基因组DNA
（3）PCR扩增ITS序列
（4）测序
（5）序列分析
（6）结合形态特征对菌株进行初步鉴定
八、实验报告
基本内容详见附件。
附件1
实验报告的基本内容及要求
1．实验预习
在实验前每位同学都需要对本次实验进行认真的预习，并写好预习报告，在预习报告中要写出实验目的、要求，需要用到的仪器设备、物品资料以及简要的实验步骤，形成一个操作提纲。对实验中的安全注意事项及可能出现的现象等做到心中有数，但这些不要求写在预习报告中。
2．实验记录
学生开始实验时，应该将记录本放在近旁，将实验中所做的每一步操作、观察到的现象和所测得的数据及相关条件如实地记录下来。
实验记录中应有指导教师的签名。
3．实验总结
主要内容包括对实验数据、实验中的特殊现象、实验操作的成败、实验的关键点等内容进行整理、解释、分析总结，回答思考题，提出实验结论或提出自己的看法等。
贵州大学实验报告（小三号，加黑）
学院：专业：班级：
注：各学院可根据教学需要对以上栏木进行增减。表格内容可根据内容扩充。
真菌的常规检验法
真菌的常规检验法 实验室检查： ?标本采集分离培养 ?直接镜检生化反应 ?染色镜检免疫学试验 一、临床标本的采集 ?1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。 ?3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。 二、检验方法 （一）标本直接检查法
不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定 ①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。 微生物学检查步骤： 取患部标本
（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化 →镜检（观察菌丝和孢子） 直接镜检的意义 ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； ③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。 2. 染色标本检查 ?（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 ?（2）乳酸酚棉蓝染色
?（3）糖原染色： ?又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。 ?（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色 ?（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 ?（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 （二）培养检查法 ?本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 ①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； ③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
真菌学实验报告
真菌学实验报告 一.实验目的： 1.1了解真菌形态的基本特征。 1.2掌握丝状真菌制片方法。 1.3掌握内生真菌的分离方法 1.4掌握真菌的鉴定方法。 二.前言： 真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。 当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的
分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。 植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。 三.材料与方法： 3.1.1材料： 在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。 3.1.2.药品与试剂： 葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双
真菌细菌大不同,全面解读真菌的实验室检查
真菌细菌大不同，全面解读真菌的实验室检查 真菌为自然界中存在的微生物，单细胞酵母样或者分枝丝状。环境中有5000多种的真菌，但与人类疾病有关的不到200种，常见导致感染的仅20到25种。 真菌感染常由一种或几种真菌侵入组织造成，可导致浅部皮肤感染或严重的深部组织感染，血、肺部或全身感染。 浅部真菌感染较常见，可导致指甲感染或者发痒红斑的皮肤感染，如众所周知的“脚癣”、皮肤发痒、皮肤癣，或酵母菌感染导致的口腔中的白斑（鹅口疮），或阴道发痒及分泌物增多。根据疾病预防和控制中心（CDC）报道，大约75%的女性一生中至少有一次真菌感染。 少见情况下，真菌可以从它们最初所在的位置蔓延到或侵入到深部组织，可侵犯机体的任意器官，可能导致严重的肺部感染、败血症或全身性感染。典型的真菌肺部感染通常是由于吸入微小的真菌孢子导致。任何人群都有可能得严重的肺部或全身性真菌感染，但是大多数感染只表现为轻微到中度的流感样的症状。但是免疫缺陷的患者，如HIV/AIDS、器官移植术后，和有基础疾病如糖尿病、肺部疾病等的患者发生严重肺部真菌感染、全身性感染或反复感染的危险性较高。 真菌检查试验可检测和鉴定真菌，以协助诊断感染并指导治疗。经典的真菌检查试验包括标本涂片显微镜检查，有时用前处理或者染色来帮助检查真菌。镜检可以为真菌感染的诊断提供充分的依据，若为浅部感染，就不需要进行进一步的试验了。但对于持久的、深部的或全身性的等需要明确诊断的感染，还需要进行其它检测，如培养、敏感性试验、抗原和/或抗体试验。 真菌感染VS细菌感染
真菌感染常常需要与其他微生物引起的感染相区分，如细菌感染。某些感染病例，真菌和细菌都存在。需要一些试验来进行鉴别诊断： 革兰染色 - 用显微镜检测标本中的细菌和/或真菌的一种快速试验 细菌培养 - 用于排除细菌感染或确定是否合并有细菌感染 抗酸杆菌涂片和培养–怀疑分枝杆菌感染如结核病 血培养–怀疑为菌血症 真菌在潮湿的环境中生长旺盛，如公共游泳池和体育馆的储物柜，有汗的鞋子、紧身衣服和皮肤皱褶里。可以通过穿拖鞋或凉鞋以减少直接暴露，勤换袜子，烘干鞋子，保持身体易潮湿的部位干燥清洁等来减少皮肤真菌感染的机会。 测试样本如何采集？ 根据所怀疑的感染部位来采集标本。对于浅部感染，可采取皮肤刮屑、剪下或削下的指甲或头发，用无菌拭子采取阴道分泌物，或者尿标本。对于深部组织、器官或全身性感染，可采取静脉血液标本、来自肺部的痰标本、和/或活检组织标本。若怀疑脑膜炎，可采取脑脊液标本。 有何用途？ 真菌检查试验用于检测和诊断真菌感染、协助指导治疗、有时也可用于监测治疗效果。对多数浅部皮肤感染和酵母菌感染，根据临床检查和标本显微镜检查即可诊断是否存在真菌感染，通常不要求把微生物鉴定到种。医生根据实习指南和他的经验进行局部或者口服抗真菌药物治疗。 真菌培养可用于鉴定侵入深部组织的、感染肺部的、或系统性感染的持久真菌感染中的真菌。许多真菌生长缓慢。特殊营养琼脂能特异性的抑制细菌生长，但必
浅谈常见病原性真菌感染及实验室检查方法
浅谈常见病原性真菌感染及实验室检查方法 发表时间：2019-08-14T13:28:12.163Z 来源：《健康世界》2019年7期作者：王祥 [导读] 真菌是一类具有完整细胞结构和内含物（如典型的细胞核和完整的细胞器），不含叶绿素，没有根、茎、叶的真核细胞型微生物。王祥 达州市宣汉县第三人民医院 636150 真菌是一类具有完整细胞结构和内含物（如典型的细胞核和完整的细胞器），不含叶绿素，没有根、茎、叶的真核细胞型微生物。真菌在自然界中种类繁多，分布广泛。多数真菌对人体无害，甚至有利，如食用、发酵、酿酒及生产抗生素等，仅有少数真菌可引起人类感染性、中毒性及变态性疾病，特别是本来属于人体正常菌群的某些真菌，当机体免疫力低下或长期使用免疫抑制剂、广谱抗生素、激素及化、放疗药物时，导致真菌机会性感染的几率明显增加。真菌感染严重时，可累及全身组织器官，在ICU重症患者、气管插管患者、全静脉营养患者、白血病或其他恶性肿瘤患者的治疗过程中，真菌是医院感染病例中的重要病原菌。由于真菌感染具有治愈率低、治疗周期长、死亡率高等特点，因此越来越受到临床医生的关注和重视。 在真菌的分类方面，临床多根据真菌侵袭肌肤组织程度的不同而分为肌肤浅表感染性真菌和深部感染性真菌。深部感染性真菌主要包括白假丝酵母菌又称白色念珠菌、曲霉菌、隐球菌、耶氏肺孢子菌、马尔尼菲青霉、毛霉目真菌、组织胞浆菌病及镰刀菌8个菌属，主要侵犯人体深部组织、粘膜及脏器，引起深部真菌感染，甚至全身播散性感染。其中以白色念珠菌感染最为常见，当各种原因导致机体菌群失调或抵抗力降低时，可侵犯人体组织器官，引起多部位的念珠菌机会性感染，常见的有女性外阴炎、念珠菌性阴道炎，男性包皮炎、念珠菌性龟头炎、膀胱炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、肾盂肾炎及婴幼儿体质虚弱时易患的鹅口疮口角糜烂等，白色念珠菌侵犯中枢神经系统时，还可引起脑膜脑炎、脑膜炎、脑脓肿等。 肌肤浅表感染性真菌主要包括皮肤癣菌、暗色真菌、角层癣菌及孢子丝菌4个菌属。皮肤癣菌有称之为皮肤丝状菌，主要侵犯人体和动物的皮肤、毛发及指（趾）甲，一般不侵犯皮下等深部组织及内脏，常可引起手癣、头癣、甲癣及足癣等多种皮肤癣病；暗色真菌常在患者外伤后感染，高发于四肢暴露部位，暗色真菌感染可引起丘疹、红斑等多种皮损，继发感染时，皮损结痂、反复发作，感染经久不愈，严重时可引起象皮肿，甚至致畸、致残或癌变，机体免疫功能低下时可侵犯中枢神经系统或经血流扩散，对机体造成严重损害；角层癣菌主要寄居于人体毛发、皮肤的最表层，很少引起宿主细胞的炎症反应或较轻微的炎症反应；孢子丝菌感染可导致皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统发生慢性感染，引起孢子丝菌病。 感染性真菌的病原学检查是确证真菌感染的重要措施，实验室检查方法有直接镜检、染色镜检、真菌分离培养、组织病理学检查、免疫血清学检查及分子生物学检查等，其中直接镜检和分离培养是真菌病原学检查中最为常见的两种检查手段。 直接镜检是临床真菌检验最快捷、有效的常用方法。10%KOH溶液（可促进角质蛋白的溶解及杀菌作用）涂片镜检，主要适用于毛发、指甲、鳞屑等致密的难以透明的材料检查，显微镜下查见特征性菌丝及孢子体，是初步诊断皮肤癣菌感染的重要依据；用生理盐水替代KOH溶液涂片镜检，可观察真菌的出芽现象，也可用于尿液、胆汁及粪便标本的直接镜检查；无颗粒或杂质的优质墨汁（如印度墨汁）涂片镜检，主要用于新生隐球菌等有荚膜真菌的检查；水合氯醛-石碳酸-乳酸溶液的穿透力较强，仅限于不透明标本的检查。 染色标本镜检具有能够更清楚观察到真菌形态和结构的优点，有助于提高标本阳性检出率。革兰染色是最为常用的染色方法，革兰染色后各种真菌均呈深紫色，常用于假丝酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌及酵母菌等染色；乳酸酚棉蓝染色适用于各种真菌的培养物涂片检查、直接涂片检查及小培养标本等，该法染色后，真菌呈现蓝色；糖原染色是真菌染色最常用的方法之一，又称过碘酸Schiff染色（简称PAS或PASH），PAS染色后的真菌菌体为红色，细胞核为蓝色，背景为淡绿色，可用于标本直接涂片及组织病理切片的染色检查；嗜银染色（GMS）的原理与糖原染色原理相似，主要区别在于嗜银染色是用铬酸代替过碘酸，GMS染色后真菌呈现黑色，菌丝呈现旧玫瑰红色，背景为淡绿色，可用于组织病理切片检查和标本直接涂片；黏蛋白卡红染色（MCS）主要适用于新生隐球菌的荚膜染色，MCS染色后细胞壁和荚膜呈红色，细胞核为黑色，背景为黄色；荧光染色法是利用荧光染液对直接涂片、培养涂片及组织切片标本染色后，借助荧光显微镜观察荧光反应结果，其区别在于直接涂片标本阳性只表示有真菌存在，不能确定菌种，而培养涂片和组织切片标本则可以根据荧光反应颜色的不同而确定菌种，如白假丝酵母菌为黄绿色，新生隐球菌为红色等。 分离培养检查法是根据绝大多数真菌可以人工培养的特性和真菌对营养要求的差异及培养目的性不同，选择不同的常用培养基（如沙保培养基、马铃薯葡萄糖琼脂及尿素琼脂等）接种培养出真菌，从而为真菌的鉴定及临床确定诊断提供重要依据。 组织病理检查是将疑似真菌感染组织经封蜡、切片、脱水、染色及镜检等一系列复杂过程，观察机体器官、组织中是否存在真菌感染的病理形态学改变或特征，能为病原性真菌感染提供确切的诊断依据。免疫血清学检查主要利用生化、免疫学手段检测真菌的抗原抗体及代谢产物，目前常通过糖（醇）如葡萄糖、甘露醇等发酵试验，免疫学手段检测隐球菌荚膜多糖抗原、Cand-Tec抗原等，可用于多种真菌的鉴别。分子生物学检查方法的原理是借助靶基因（即适当的特异性基因片段），利用PCR扩增技术扩增痰液、血清（浆）、尿液、脓液、支气管肺泡灌洗液等中的真菌成分，从而确定病原性真菌的有无及种类的一种检查方法。 随着现代医疗水平的提高和真菌感染研究的不断深入，将会促使我们对病原性真菌及感染有更多、更新的认知和掌握，相信会有更多先进、快捷的检查方法不断成熟、完善和应用，为病原性真菌感染疾病的早期诊断、治疗提供更加科学、有效的辅助依据。
《人类对细菌和真菌的利用》教学反思
《人类对细菌和真菌的利用》教学反思 本节课是《生物学》人教版第五单元第五章第二节的第一课时内容，教学目标是举例并尝试发酵技术在食品制作中的应用；通过发酵实验和尝试制作甜酒、酸奶等食品，提高动手实践和理论联系实际的能力。内容涉及的是细菌和真菌对人类有益的方面，与实际生活的联系极为密切。学生不仅对本节课内容感到新颖、好奇，而且对制作发酵食品还有一种跃跃欲试的冲动。本节虽然知识结构并不复杂，但从科学技术与生活实际的角度看，内容和形式不容忽视，因为它为提高同学的实践能力、体验知识与技术在实际生活中的应用提供了非常好的机会和素材。高效课堂的学习特别强调学生的经历，强调学生的学习体验，增加学生在高效课堂中的参与度。 授课过程中，在老师的引导下，通过小组合作、动手实验、表达交流等活动环节，看到了学生的反应积极踊跃，兴趣浓厚，并且能够联系生活经验利用发酵技术制作食品。由此不仅提高了学生语言表达、逻辑推理等多方面的能力，而且培养了学生的相互协作的精神，更重要的是使学生真正体验到知识与技术在实际生活中的应用。 在教学实施过程中，有下面几个方面处理的较好： 1、在教学中，我把“发酵现象”演示实验改成了学生分组实验，并进行了改进和拓展，教学效果很明显。分组实验进一步培养了学生的实践动手能力，增加了学生的感性认识和小组成员合作探究的意识。并且我对书上实验进行了适当的改进，把装好材料的瓶子放在保温桶中水浴保温，温度保持在40 ℃左右，让学生更快看到实验现象，提高了课堂的实验效率。而且拓展了实验，把气球收集的气体通向澄清的石灰水检验产生的气体成分，并请同学闻一闻产物的气味。通过上述处理，学生对“酵母菌发酵”所需要的原料、条件及产生的物质都有了较直观的认识和感受，比较容易理解课本上阐述的“酵母菌可以把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳”等相关内容，留下了深刻的印象。 2、甜酒的制作这一环节，充分利用了教学资源。课前把这一制作过程录成了教学短片，而不是利用网上下载的视频资源，这样更贴近学生生活，让学生在课堂上对甜酒的制作过程加以解说、品尝甜酒，大大激发了学生学习兴趣，增加感性认识，让学生充分体验知识与技术在生产生活中的作用。并且鼓励学生课下亲手制作酸奶，在课外活动中进一步发展自己的实践能力。 3、新旧知识的联系。本节知识性内容不多，但与前后知识联系很密切。在教学过程中，
临床医学检验高级职称题-真菌学
临床医学检验高级职称题-真菌学 1、慢性化率最高的病毒性肝炎是（） A.甲型肝炎 B.乙型肝炎 C.丙型肝炎 D.丁型肝炎病毒单独感染 E.戊型肝炎 2、马拉色菌毛囊炎属于（） A.细菌性皮肤病 B.微小棒状杆菌皮肤病 C.病毒性皮肤病 D.真菌性皮肤病 E.非感染性皮肤病 3、肠道病毒不包括（） A.脊髓灰质炎病毒 B.EV71 C.甲型肝炎病毒 D.HDV E.ECHO病毒
4、凝胶过滤法主要用于蛋白和核酸分离，又称为分子筛层析法，其常用介质是（） A.聚丙烯酰胺 B.琼脂糖 C.琼脂糖－聚丙烯酰胺 D.葡聚糖 E.琼脂糖－葡聚糖 5、具有急性肝炎临床表现的病人除去下列哪项均可以确诊为甲型肝炎（） A.抗HAVIgM B.抗HAVIgG C.粪便中检出HAV抗原 D.粪便中检出颗粒HAV E.粪便中检出HAVRNA 6、IFA是（） A.间接免疫荧光检测 B.玻片凝集试验 C.试管凝集试验 D.溶血空斑试验
E.间接凝集试验 7、女性，26岁，1周来发热，乏力，纳差，恶心呕吐，尿黄。近2天来热退，但黄疸迅速加重，嗜睡。查ALT660IU／L，AST450IU／L，总胆红素250μ;mol／L，下列各项检查中，哪一项你认为对进一步诊断最有价值（） A.抗HAv－IgM B.HBsAg C.HCV－RNA D.抗HEV E.凝血酶原活动度（PTA） 8、为预防乙型流感的主要措施是（） A.口服金刚烷胺 B.注射丙种球蛋白 C.接种疫苗 D.注意空气消毒 E.避免到公共场所 9、10月龄男婴，2007年10月突发水样便腹泻，10余次／天。伴呕吐、发热、轻度脱水。大便性状开始为蛋花状，后为水样。该患者所患胃肠炎的致病因子以下哪种最有可能（）
“细菌和真菌的分布”探究实验设计
“细菌和真菌的分布”探究实验设计 一、教材分析与设计思路 1、教材分析 本节的知识背景是，细菌分布极广，地球上人迹所到之处都有细菌。甚至在5m多深的土壤中，1000m以下的深海中，盐分很高的盐湖中，也都有细菌。空气中，各种物体的表面，包括人的外表，以及动物的消化道内，也都有细菌。深海中热泉口附近的水温可达300℃以上，竟也有细菌存在，它们和外周的其他生物组成一个特殊的没有日光的生态系统。关注学生的学习和生活经验。 本节的探究实验是在学生已有一定的探究性实验技能的基础上进行的。如学生会“提出问题，作为假设”。 2、设计思路 本节课着重体现从生物圈的角度认识细菌和真菌的思路。让学生按照从宏观到微观的顺序进行观察。即通过“探究实验”由学生亲自体验细菌和真菌的广泛分布入手，认识细菌的生活环境和生活特点。激发学生的学习兴趣，于无声处走进教学内容，乐于探索生命的奥秘，逐步养成良好的生活与卫生习惯，确立、健康的生活态度。在学法指导中，改变以往讲述细菌的知识内容的做法，侧重引导学生自己设计和探究，符合从感性到理性的规律。同时，让学生在探究实验过程中，学习接种和培养细菌和真菌的操作，为学生学习生物技术打下了一定基础。 3、教学中应注意的的问题 （1）培养基和培养皿要严格高压灭菌，这是探究实验成功的关键。 （2）鼓励学生大胆设计多种实验方案，珍惜实验机会。 （3）提示学生为什么要选取两套培养皿，目的是设置实验组和对照组。 （4）强调此探究实验是属于单因素。除采样地点是变量外，进行微生物培养的条件，如温度等要保持一致。 （5）做好标记，设计好实验方案之后，方可打开培养皿。 二、教学目标 1、知识目标 说出细菌和真菌的分布特点；尝试采用细菌和真菌培养的一般方法，探究细菌和真菌的分布；探讨细菌和真菌的分布条件。 2、能力目标
真菌标本检验标准操作规程
真菌标本检验标准操作规程 1.目的 规范真菌标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2. 适用范围 各类真菌检测的标本。 3. 标本采集及处理 3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。 3.2 标本采集与处理 3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。 3.2.2 尿液早晨中段尿10ml，离心取沉淀液1ml，作真菌涂片及培养。 3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠粘膜的标本应迅速放入内装1-2ml无菌蒸馏水的试管送检。常规KOH 涂片及SDA培养。 3.2.4 粪便无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。 3.2.5 脓液脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。 3.2.6 脑脊液采集于无菌试管3-5ml，立刻送检。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养
（SDA）25°C及37°一周。 3.2.7 血液分别于左右两侧无菌抽血3-5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。 3.2.8 体液支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检(注意颗粒)及培养。 3.2.9 组织标本置于无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或切成1-2mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.10 皮屑皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。取材前75%酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.11 甲屑用细锉或牙签研磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25°C-28°C培养3周，并同时作KOH涂片。 3.2.12 毛发取病发15根、75%酒精消毒，3-5根作直接镜检，5-10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。 3.3 标本拒收标准及处理参见《标本拒收程序》 4.试剂、培养基及仪器 4.1 接种针、电热灼烧器、显微镜、恒温培养箱、冰箱、全排式生物安全柜等。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，
28.真菌检验
1.真菌是真核细胞型微生物，属真菌界。有细胞壁（几丁质） 2.真菌分类学上，分为①有性孢子②无性孢子。优先考虑的是有性孢子的特征 3.真菌无性繁殖包括①出芽生殖②分裂繁殖③芽管繁殖④生隔繁殖 4.真菌常用沙保弱培养基进行培养，大部分真菌在25-28℃生长良好，少数需要在37℃培养 5.不染色直接镜检真菌是最简单的检查真菌方法，标本检查和培养检查需要使用氢氧化钾处理 6.假丝酵母菌菌落呈灰白色或奶油色，大多数可形成芽管，只有白假丝酵母菌可形成厚壁孢子，可形成较长菌丝，常用革兰染色 7.白假丝酵母菌（白色念珠菌）通常存在于人类呼吸道、口腔（鹅口疮）、肠道、阴道中，当机体免疫力下降时可引起感染 8.隐球菌有肥厚的荚膜，一般染色不易发现。用墨汁染色镜检，可见黑色背景中有圆形透明菌体。新型隐球菌在25℃、37℃均可生长，非致病性隐球菌在37℃不能生长 9.新型隐球菌尿素酶试验（+）白假丝酵母菌尿素酶试验（-） 10.新型隐球菌在免疫功能低下者体内可引起隐球菌性脑膜炎 11.卡氏肺孢菌主要在空气传播，健康人体内多为无症状的隐形感染，免疫力下降后，可导致PCP肺炎（间质性肺炎） 12.卡氏肺孢菌生活史有两种形态；包囊（感染型）和滋养体（繁殖型），采用镀银染色法检查 13.组织胞浆菌与马尔尼菲青霉菌为双向型真菌 14.毛癣菌属：易侵犯人体皮肤、指甲、毛发的角蛋白组织并繁殖生长，标本经10%KOH溶液消化后镜检，可见菌丝或孢子 15.试验 ①厚膜孢子形成试验：白假丝酵母菌 ②TZC反应：鉴定热带假丝酵母菌 ③尿酶试验：鉴别新型隐球菌（+）与白假丝酵母菌（-），荚膜组织细胞菌（+）与杜波组织细胞浆菌（-） ④毛发穿孔试验：须癣毛癣菌（+）与红色毛癣菌（-）
湖北省武汉市为明实验学校八年级生物《人类对细菌和真菌的利用》导学案(无答案) 新人教版
一、学习目标 1、举例说出发酵技术在食品制作的应用 2、说出食品腐败的原因，运用食品保存的一般方 和真菌与人类防治疾病的关系 、说明细菌在环境保护的作用。 5 、关注因技术在医药生产上的应用。 二、学习重难点 1、说出食品腐败的原因，运用食品保存的一般方法保存食品。 、举例说出细菌和真菌与人类防治疾病的关系 三、预习检查 、有的真菌体内含有大量的酶，可以把分解为，如曲霉；有的真菌可以把葡萄糖转化为并产生，如酵母菌。有的细菌含有的酶把转化为，如乳酸菌，还能使牛奶变成，使蔬菜变成酸味的泡菜。 2、食品的腐败主要是由于和引起的，它们可以从食品中获取，并在食品中和，导致食品腐烂，因此，食物保鲜中的一个重要问题就是，所依据的主要原理是。 3、科学家利用现代技术手段，把其他生物的某种转入一些细菌内部，使这些细菌能够生产药品，这种技术手段叫。 四、学习过程 学习任务一：认识细菌、真菌在食品的制作上的应用 1、展示“发酵实验”过程、现象及结论。讨论并表述出发酵的原理。 2、观察掰开的面包、馒头中的小孔就是二氧化碳形成的，思考课本P75练习第一题。 3、通过观察、讨论，列举日常生活中的发酵食品。总结发酵食品的制作原理。 4、制作：根据教材P72制作甜酒 学习任务二：认识细菌、真菌与食品保存的关系 1、观察教材第73页“观察与思考”，讨论并交流各种食品的保存方法。 2、补充归纳出保存食品的主要方法和原理，以及注意事项。 拓展反思：列举本地人们保存食品的一些方法，如腌制品、咸菜等，思考：怎样保存更有利于健康？ 学习任务三：列举细菌、真菌与疾病防治的关系 1、阅读课本76页“抗生素今昔”，然后讨论完成课本75页练习第2题。 2、结合教材P74，表述科学家是如何通过转基因技术进行胰岛素生产的。 学习任务四：认识细菌与环境保护 1、认真阅读教材，举例说明细菌是如何净化污水的。 2、各小组交流调查的本市有关生活污水和工业废水排放情况及垃圾处理情况。利用所学知识为家乡的建设和发展出谋划策。 五、系统总结： 1.细菌、真菌与食品的制作 有的真菌（如曲霉）含有的酶可以把淀粉分解成_________ 有的真菌（如酵母菌）可以把葡萄糖转化为酒精并产生________ 有的细菌（如乳酸菌）含有的酶可以把葡萄糖转化为_________ ___________可用于做馒头、面包；
深部真菌感染检验方法的比较
深部真菌感染实验室检验方法的比较 一、深部真菌感染的现状及其定义及引起深部真菌感染的因素 真菌与人类有着极为密切的关系，据统计自然界中真菌至少包括50，000种，但是与人类疾病密切相关的真菌种类仅几十种[1]。近年来,真菌感染尤其是深部真菌感染率呈逐年上升趋势[2]，深部真菌感染就是指由致病性真菌所引起的人体深部感染，如侵及到皮肤深层如内脏，如肺、粘膜、肌肉、脑、消化道等器官，危害性较大，已越来越严重地威胁着危重患者的健康与生命，成为住院患者感染及死亡的主要原因之一[3]。.据报道，在美国医院内菌血症／败血症病例中，真菌感染在血流感染常见致病菌中居第三或第四位，真菌感染可明显增加病人死亡率和住院率[4]。.由于深部真菌感染的早期诊断困难，治疗药物有限，感染所致病死率仍高达40％[5].因此深部真菌的诊断尤其是快速诊断日益受到临床的重视。深部真菌感染的危害已越来越突出。目前深部真菌感染已成为免疫功能低下患者发病和死亡的主要原因[6]。引起深部真菌常见的致病菌主有念珠菌、隐球菌、曲菌、毛霉菌及放线菌等[7]我们知道，真菌在人体中,与细菌之间起着重要的微生态平衡作用。近年来,随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用,器官移植、导管插管等普遍开展,深部真菌感染率越来越高。诱发深部真菌感染的因素主要有以下几个方面：1、慢性消耗性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿毒症等，可使机体免疫功能和抵抗力降低。2、长期使用广谱抗生素，敏感的细菌被抑制，消除了正常菌群中与真菌相拮抗的细菌，使真菌得以大量繁殖。3、肾上腺皮质激素破坏淋巴细胞，使抗体形成减少。4、大剂量X线照射、抗肿瘤药物和免疫抑制剂都能抑制骨髓，使中性粒细胞和巨噬细胞减少，机体的免疫功能和抵抗力降低。5、侵入性检查和治疗（如长时间静脉插管，留置导尿管和大手术）可引起局部损伤，成为真菌侵入的门户，在机体抵抗力低落时在体内繁殖致病。 二、深部真菌感染的危害性及临床预后 据统计，近30年深部真菌感染的发病率增加了3-5倍，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一[6]。据美国115家医院真菌感染调查显示2004年真菌感染率为1993年的近4.6倍[8]；在国内2003年北京协和医院深部真菌感染发生率为20世纪90年代的3.6倍。[9]， 深部真菌感染病主要包括深部皮肤真菌病，烧伤真菌病，妇科真菌病、恶性血液病患者的真菌的感染，肺部的真菌感染，外科的真菌感染，老年性真菌病，免疫缺陷患者与真菌感染，消化系统的真菌感染，骨髓移植患者的真菌感染，AIDS与真菌感染等。大量的文献报道表明，严重大面积烧伤患者，由于多次创伤和打击，病程冗长，体质严重耗竭，机体抵抗力下降，往往引起深部真菌感染，从而出现严重后果。据报道，近年烧伤真菌检出率有上升趋势，烧伤病人真菌感染死亡率可达47.4%［10］。在医院的ICU病房中，真菌的感染死亡率最高 [11 ,12]。据吴铁军等报道[13]在ICU病房中，肺部真菌感染后死亡率高达39%上述结果表明真菌已经成为医院感染的主要致病菌之一，是住院病人死亡的主要原因之一，因此要十分重视真菌感染的监测。深部真菌感染发病率高、病情进展快，死亡率高、治疗费用昂贵、临床诊断困难、容易产生耐药等，传统的诊断方法主要有培养、病理切片等方法。但培养耗时长、阳性率低、标本容易受到污染。如痰培养容易受到上呼吸道寄生真菌及空气中的真菌的污染影响培养结果。组织病理很难被病人接受因而在临床工作中开展比较困难。面对持续高烧、抗生素治疗无效的病人，因缺乏快速的客观的实验室诊断依据，贻误治疗。很多医生采用经验性抗真菌治疗，但由于缺少有力的实验室证据、抗真菌药物昂贵等病人家属很难理解，容易激化医患矛盾。目前急需一种能够早期快速诊断深部真菌感染的方法。正是由于诸多的原因及深部真菌感染对患者造成的严重危害程度，对于真菌特别是深部真菌的快速检验愈来愈受到临床医生的重视。 三、实验室检验真菌的常见方法
微生物实验室真菌检查质量控制流程
微生物实验室真菌检查质量控制流程 一、目的 规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。 二、适用范围 微生物实验室的各类真菌检测。 三、职责 实验室检验人员均必须熟知并遵守本程序。 四、程序 (一)临床样本的采集与处理 1.皮屑边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH 涂片。 2.甲屑用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，作KOH涂片。 3.毛发取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5 根作直接镜检。 4.脓液无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作革兰染色，常规的KOH涂片。 5.CSF 采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉 淀物1ml，作墨汁涂片镜检。 6.血液无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d 出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
7.体液、痰液、尿液、粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨 痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。 采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。 8.组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm的小块， KOH涂片培养。 (二)涂片染色和直接镜检的质控 1.氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加 热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。 2.胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带 在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。 革兰染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择革兰染色方法，染色后，以油镜观察。 3.染液的质量控制 （1）革兰染液每次新配置和使用中每周一次进行质控，并进行记录。 （2）氢氧化钾/复方氢氧化钾每周进行一次质控。 (三)真菌鉴定质量保证 1.对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基。 2.常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验
真菌的培养及形态观察
题目：真菌的培养及形态观察 动物科学1204班聂孝明 20121546 指导教师：邹玲 摘要：了解酵母菌和霉菌的菌落特征及在培养基中的生长表现，还有真菌的分离培养方法和载片培养，学习真菌水浸片的制备及形态观察。本实验通过真菌的固体培养，酵母菌水浸片旳制备观察及划线分离培养的方法进行形态观察。在固体培养基上，观察到A菌落成绿色比较光滑、有分生孢子、菌丝有横隔为青霉。D菌落有大量直立菌丝并且顶部发黑、有孢子囊、菌丝无横隔为根霉。B菌落大而光滑、显微镜下菌体较大、有假菌丝并且出芽生殖的为酵母菌。 关键词：酵母菌霉菌形态观察分离培养 引言：真菌在自然界中分布广、数量大、种类多。酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形，无性繁殖为出芽生殖，可以形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片可以观察期外形和区分细菌的死活。霉菌的营养体是分支的丝状体，较大，分为基内菌丝和气生菌丝，不同的霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子，细胞易收缩变形，孢子容易分散。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰，完整，保持自然状态的霉菌形态。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种：酵母菌，青霉，根霉的斜面培养菌种 1.1.2试剂：沙堡培养基、美蓝染色液、70%酒精、无菌水等 1.1.3其他：解剖针、玻片、盖玻片、接种环、显微镜等 1.2方法 1.2..1真菌的划线分离培养 培养基：将沙堡琼脂培养基融化后，冷却至45摄氏度，注入无菌平皿中，每皿15~20ml，做成平板备用。 接种：取待分离的材料少许，投入无菌水试管中，振荡，使分离菌悬浮于水中，将接种环火焰灭菌后冷却，取上述悬液，进行平板划线分离。 培养与观察：划线完毕后，置于28摄氏度温箱培养2~5天，待形成子实器官后，取单个菌落部分，制片镜检。若只有一种菌，既得纯培养物。如有杂菌可取培养物少许制成悬液，用作划线分离，有时反复多次可获得纯种。也可在放大镜下观察，用无菌镊子夹取一段分离的真菌菌丝，在平板上分离培养，即可得到真菌的纯培养物。 1.2.2真菌在固体培养基上的生长表现： 酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或蜡质状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈现粉粒状，粗糙或褶皱，菌落边缘整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色、红色等。将不同的霉菌在固体培养基上培养2~5d，可见霉菌有绒毛状、絮状、绳索状等。大小依霉菌种类而异，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。 1.2.3真菌的形态观察 1.2.3.1酵母菌水浸片的制备：将美蓝染色液或蒸馏水滴于干净的载玻片中央，用接种环以无菌及操作取培养48h的酵母菌少许，均匀涂于液滴中，染色2~3min后加盖玻片。注意切勿产生气泡，然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞。 1.2.3.2挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液，用灭菌滴管吸取
真菌检验带答案
第十六章医学真菌学 一、单5选1 1.真菌区别于细菌的本质特征是： A.具有高度分化的细胞核（有核膜、核仁） B.有单细胞和多细胞等不同形态 C.有多种增殖方式 D. 对抗生素不敏感 E.细胞壁中无肽聚糖 2.为真核细胞型微生物的是： A.细菌 B.真菌 C.支原体 D.衣原体 E.病毒 3.真菌的繁殖结构是： A.芽孢 B.孢子 C.包涵体 D.原体 E.始体 4.真菌细胞壁不含有的成分是： A.几丁质 B.葡聚糖 C.肽聚糖 D.蛋白质 E.脂质 5.真菌的致病性包括： A.真菌毒素中毒 B.条件致病性真菌感染 C.真菌过敏 D.真菌毒素的致癌作用 E.以上全包括 6.真菌感染率明显上升与下列哪种因素相关性最小： A.抗生素使用不当 B.抗癌药物使用增多 C.机体免疫力下降 D.激素使用增多 E.真菌发生耐药变异 7.培养真菌的最适pH是： A.2.0～4.0 B.3.0～4.0 C.4.0～6.0 D.5.0～7.0 E.6.0～8.0 8.培养真菌首选下列哪种培养基： A.普通琼脂平板 B.半固体培养基 C.玻片小培养 D.米汤培养基 E.沙保罗培养基 9.多细胞真菌的菌落类型是： A.酵母型 B.类酵母型 C.丝状型 D.类丝状型 E.混合型 10.关于条件致病性真菌感染，下列说法错误的是： A.引起的是内源性感染 B.致病性强，常造成AIDS或肿瘤等病人的致死性感染
C.是肿瘤、糖尿病及免疫缺陷性疾病治疗中的疑难问题 D.目前无特异预防措施 E.临床感染率呈明显上升趋势 11.检查新型隐球菌感染常用： A.革兰染色法 B.抗酸染色 C.墨汁染色 D.瑞氏染色 E.吉姆萨染色 12.以下哪种真菌不属于浅部真菌： A.红色毛癣菌 B.铁锈色小孢子菌 C.石膏样小孢子菌 D.卡氏肺孢菌 E.絮状表皮癣菌 13.*鹅口疮的病原菌是： A.衣原体 B.细菌 C.真菌 D.螺旋体 E.立克次体 14.真菌感染不用青霉素治疗，是因为真菌： A.缺乏细胞壁 B.真菌产耐青霉素的酶 C.长期使用青霉素已产生耐药 D.细胞壁缺乏肽聚糖 E.亲和力低 15.关于皮肤癣的描述是错误的是： A.主要侵犯皮肤、毛发和指（趾）甲 B.通过直接或间接触而感染 C.在沙保弱培养基上形成丝状菌落 D.一种皮肤癣仅能引起一种癣病 E.可以根据菌丝、孢子及菌落形成作出初步判断 16.下列何种真菌是我国主要的表面感染真菌： A.着色真菌 B.絮状表皮癣菌 C.许兰毛癣菌 D.红色毛癣菌 E.糠秕马拉色菌 17.表皮癣菌属不引起： A.毛发癣 B体癣 C甲癣 D足癣 E手癣 18.实验室诊断皮肤癣菌感染时，皮屑或病发须经哪种溶液处理后再镜检： A.10%Nacl B.70%乙醇 C.10%KOH D.25%KOH E.15%NAOH 19.具有假菌丝的真菌是：
临床微生物学检验(理论)真菌部分 重点整理
第一节概述 真菌的特点：种类繁多、分布极广、与人关系密切 一、定义：真菌(fungus)是一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的，单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。 细胞壁：不含肽聚糖，含几丁质及纤维素 二、分类 临床分类(按致病部位)：浅部真菌、深部真菌 形态学分类：单细胞真菌、多细胞真菌 真菌的形态与结构在鉴定上起重要作用 三、生物学形状 （一）形态与结构 1、单细胞真菌：圆形或卵圆形，包括酵母型和类酵母型真菌。 酵母型真菌以芽生方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体，不产生菌丝，其菌落与细菌菌落相似。 类酵母型真菌也以芽生方式繁殖，菌落与酵母型真菌相似，但它产生的芽体不从母细胞上脱落，而是延伸入培养基内形成假菌丝。 对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。 2、多细胞真菌：由菌丝和孢子两种基本结构组成 A.菌丝：在环境适宜情况下由孢子萌发长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。 按照功能分为： ①营养菌丝：伸入培养基；②气生菌丝：露出培养基向空气中生长；③生殖菌丝 按照结构分为： ①有隔菌丝：多数致病性真菌；②无隔菌丝。 菌丝的形态大小不一(螺旋状/球拍状/鹿角状)、菌丝间有无分隔、形状特征(绒毛状/絮状/粉末状) →鉴别真菌 B.孢子：由生殖菌丝产生的一种繁殖体，是真菌的繁殖结构。有有性孢子和无性孢子两类（a）有性孢子：同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成。包括：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担子孢子，多为非致病性真菌所产生。 （b）无性孢子：菌丝上的细胞分化或出芽生成，不经两性细胞的配合。病原性真菌大多形成无性孢子。 可分为三种 ①分生孢子：又可分为大分生孢子（其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据）、小分生孢子（真菌都能产生，诊断意义不大） ②孢子囊孢子 ③叶状孢子：又可分为：芽生孢子（一般芽生孢子生长到一定大小仍不与母体脱离，则形成假菌丝）、厚膜孢子（是真菌的一种休眠形态）、关节孢子 真菌种类不同，孢子形状大小也不同→鉴别真菌 （二）培养特性 1、培养条件 营养：一般细菌用培养基上都能生长，常用沙保(Sabouraud)培养基 温度：22 ℃~28℃(深部真菌：28 ℃/ 37℃) pH：4.0~6.0 (弱酸性) 需氧、湿度高