银染操作步骤(精)
银染操作步骤
1. 固定:
电泳结束后,取凝胶放入约 100ml 固定液中,在摇床上室温摇动 20分钟,摇动速度为 60-70rpm 。固定 40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制:依次加入 50ml 乙醇、 10ml 乙酸和 40ml MilliQ级纯水或双蒸水,混匀后即成 100ml 固定液,可大量配制室温存放。
2. 30%乙醇洗涤:
弃固定液,加入 100ml 30%乙醇,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-
70rpm 。 30%乙醇的配制:70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 30ml 乙醇,混匀后即成 100ml 30%乙醇。
3. 水洗涤:(洗 2次
弃 30%乙醇,加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-70rpm 。
4. 增敏:(辅染现配现用
弃水,加入 100ml 银染增敏液 (1X,在摇床上室温摇动 2分钟,摇动速度为 60-
70rpm 。银染增敏液 (1X的配制:99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 1ml 银染增敏液 (100X,混匀后即为银染增敏液 (1X。银染增敏液 (1X配制后需在 2小时内使
用。
银染增敏液 (100X的配制:即 2.8%硫代硫酸钠溶液,需用黑袋包裹避光保存。
5. 水洗涤 (共 2次 :
弃原有溶液,加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 1分钟,摇动速度为 60-70rpm 。
弃水,再加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 1分钟,摇动速度为 60-70rpm 。
6. 银染:
弃水,加入 100ml 银溶液 (1X,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-
70rpm 。银溶液 (1X的配制:99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 1ml 银溶液 (100X,混匀后即为银溶液 (1X。银溶液 (1X配制后需在 2小时内使用, 最好是现配现用。
银溶液(100 X的配制:称取 5g 硝酸银,加水溶解并稀释至 500ml ,摇匀即得 1%的硝酸银溶液,需用黑袋包裹避光保存。
7. 水洗涤:
弃原有溶液,加入 100ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 1-1.5分钟,摇动速度
为 60-70rpm 。
注意:水洗涤的时间不能超过 1.5分钟。
8. 显色:
弃水,加入 100ml 银染显色液,在摇床上室温摇动 3-10分钟,直至出现比较理想的预期蛋白条带,摇动速度为 60-70rpm 。
银染显色液的配制:90ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 10ml 银染基本显色液(10X,再加入 0.05ml 银染显色加速液 (2000X, 混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在 20分钟内使用。
银染基本显色液 (5X的配制:称取碳酸钠 60g ,加水溶解并稀释至 500ml ,摇匀即得 12%碳酸钠溶液。
9. 终止:加适量 EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠终止
弃银染显色液, 加入 100ml 银染终止液 (1X, 在摇床上室温摇动 10分钟, 终止时有气体产生属正常现象,产生的气体为二氧化碳。
银染终止液 (1X的配制:95ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 5ml 银染终止液(20X,混匀后即为银染终止液 (1X。银染终止液 (1X配制后宜当天使用。
10. 水洗涤:
弃银染终止液,加入 100ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 2-5分钟,摇动速度为 60-70rpm 。
11. 保存:
可在 MilliQ 级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。
常见问题:
1. 背景太深:
a. 显色时间过长。通常显色反应会在 10分钟内结束,显色反应时间过长会导致背景很深。
b. 洗涤不充分。洗涤时间过短,或洗涤液加入的量不足,或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合, 或摇动速度过慢, 导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间,摇床的推荐速度为 60-70rpm 。
c. 凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量,另一方面对于不是最常用的 Bis-Tris 缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分,以降低背景。
d. 水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。
2. 蛋白条带非常浅:
a. 蛋白的半胱氨酸 (Cysteine残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于银染非常重要,半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。
b. 银染后水洗涤时间过长。在银溶液染色时需严格控制水洗涤的时间,水洗涤的时间不能超过 1.5分钟,否则会导致过多的银离子被洗去,导致检测灵敏度下降。
c. 上样量不足。本试剂盒检测 BSA 的灵敏度可以达到 0.3ng , 对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于 1ng 的蛋白量才能被检测到。
d. 固定步骤后的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留,影响后续检测。确保 30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间,可以适当延长洗涤时间。
3. 凝胶上出现小点或或其它非蛋白的痕迹:
a. 凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器,并加入足量的各种溶液,同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。
b. 用于银染的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤,随后用自来水充分冲洗, 最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于银染, 并注意避免各种可能的蛋白污染。为确保充分洗涤干净,对于耐硝酸的容器,例如玻璃容器,可以在上述洗涤剂及自来水洗涤后用 50%硝酸洗涤,随后用高纯度水充分洗涤。
c. 指纹或其它压痕。请注意戴手套操作,切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。
d. 有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。 4. 在 60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景:
皮肤上脱落的角蛋白 (keratin污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作, 另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开, 甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。
5. 在凝胶的顶端处出现黄色背景:
a. 样品中 DTT 浓度很高。采用其它适当的还原试剂,或者在许可范围内适当减少 DTT 的用量。
b. 采用 Tris-Glycine-SDS 电泳体系。 Tris-Glycine-SDS 电泳体系中的 Glycine 会导致背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。换用 Tris-Tricine-SDS 电泳体系则可显著消除此黄色背景。 6. 银在染色器皿中出现沉淀:
染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次银染时的残余试剂。需确保把染色器皿洗涤干净。
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)
DNA银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：50ml乙醇 2、前处理液（敏化液）：5ml HNO3 3、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制） 4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml 5、终止液：50ml 冰醋酸 二、银染步骤（摇床设置52rpm左右） 1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min； 2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min； 3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S； 4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min； 5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S； 6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min； 7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S； 8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止； 9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min； 10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。 三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板） 1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA 1、尿素：7.2g 2、30%聚丙酰胺，4.68ml 3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L) 4、30%AP，35ul 5、TEMED,4ul 四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳 12h Treatment24h Treatment M CT 0 5 10 200 5 10 20 Protein银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸 2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入） 3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）
SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项
SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项 银染注意事项: 1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。 2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。 3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。 4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm. 5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。 7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。 8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。 9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。 10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。 11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。 12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。 13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。 14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。 15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。 我们做蛋白质电泳的人都知道，银染色很灵敏，有很强的说服力，但通常胶背景较深，不易扫描。在这里介绍一下低背景的蛋白质银染方法。 AgNO3, 0.075% HCHO(现用现加) 20 min -15 min ：说明，此步中洗涤过程要控制好，时间太长，可能显色时间太长甚至染不出色；反之，时间太短，银没有洗干净，背景变深。但做几次以后就很快掌握了。
考染与银染
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。 蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。 我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。 试剂 固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。 仪器 IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。 细胞总蛋白质的提取 取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。 单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15μl 上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。 双向电泳 取300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45 分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
银染操作步骤
银染操作步骤 1. 固定： 电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为 60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液，可大量配制室温存放。 2. 30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。 3. 水洗涤：（洗2次） 弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 4. 增敏：（辅染）现配现用 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。 银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。 5. 水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。 弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为 60-70rpm。 6. 银染： 弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。 银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。 7. 水洗涤： 弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度
醇的制备方法总结
醇的制备方法总结 彭杰 一、烯烃的水合 二、硼氢化——氧化反应 硼氢化反应的特点是步骤简单，副反应少和生成醇的产率高，该反应是实验室制备醇的一种有用的方法。通过骗人那感情化反应所得的醇恰巧和烯烃直接催化与水加成得到的醇相反，相当于水和碳碳双键的反马氏规则加成产物，这是用烯烃为原料的任何其他方法所难以获得的。 三、羟汞化——脱汞反应 此反应相当于烯烃与水按马氏规则进行加成，反应具有高度的位置选择性，而且，此反应速率快，反应条件温和，无重排产物且产率高。 四、醛、酮与格氏试剂反应 1、格氏试剂与甲醛作用得到伯醇 2、格氏试剂和其他醛作用，得到仲醇 3、格氏试剂与酮作用生成叔醇 五、醛、酮与水加成 六、由醛、酮还原 醛加氢还原成伯醇 酮加氢还原成仲醇 七、格氏试剂与环氧乙烷作用 H C OH H R O R +R /MgX R R C OMgX R R /H 2O H R C OH R R /
生成比格氏试剂多两个碳的伯醇 八、环氧乙烷与水反应 九、由卤代烃水解 对仲和叔卤代烃来说，为避免在碱性条件下容易失去卤化氢生成烯烃，在水解时常用像碳酸钠、悬浮在水中的氧化银等较缓和的碱性试剂。 在一般情况下，醇比卤代烃容易得到，因此常用醇来合成卤代烃，只有在相应的卤代烃比醇容易的到时才采用这种方法。 十、醚的水解 十一、坎尼扎罗反应 十二、酯的水解、醇解、氨解 十三、酯与格氏试剂反应 十四、酯的还原 总结：制备醇的方法多种多样，一般实验室制备醇所用的方法有：1、由烯烃制备（1）烯烃的水合（2）硼氢化——氧化反应乙硼烷和烷基硼在空气中可自燃，一般不预先制好.2、由醛、酮、环氧乙烷制备（1）醛、酮与格氏试剂反应在进行反应时，卤代烃、醛、酮和用作溶剂的醚必须仔细的干燥。在实验开始前，一起必须完全干燥，同事使反应系统与空气中水气、氧和二氧化碳隔绝。最后水解一步用稀的无机酸（硫酸、盐酸），因为这样可将难处理的胶状物质转变成水溶性的镁盐。（2）环氧乙烷与格氏试剂反应（3）由醛、酮还原
银染方法总汇及注意事项
ptotocol是这样的，请看哪里不妥： 蛋白银染步骤 步骤溶液时间 固定甲醇100ml 冰醋酸25ml 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 敏化甲醇75ml 戊二醛（25%w/）1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/) 10ml 醋酸钠（17g） 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml 甲醛(37%w/) 0.1ml 加双蒸水至250ml 20min 冲洗双蒸水2次 显色碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min 终止EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min 冲洗双蒸水3次 建议使用silia的方法！！ 简单，快！ 本人的银染方法： 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟； 2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟； 3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟； 4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒； 5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟； 6. 水洗：同上； 7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟； 8. 水洗：同上； 9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。 以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！ 5.2.2.3 银染色 1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％ 甲醇500ml 冰醋酸120ml
蛋白质染色(银染法)标准操作规程
蛋白质染色（银染法）标准操作规程（编号：041） 1、目的及适用范围 检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。 2、主要仪器 摇床、避光盒 3、试剂及配制方法 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛，去离子水 固定液：100mL乙醇（40%乙醇），25mL冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250mL； 致敏液：75mL 乙醇（30%乙醇）17g 乙酸钠，28.2g 三水乙酸钠（34g乙酸钠），0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250mL； 银染液：0.625g AgNO3，100 uL37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 显色液：6.25 g Na2CO3，50 μL 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 终止液：3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250mL 保存液：1% 冰醋酸 4、操作步骤 4.1固定：50mL固定液中固定30min或者更长时间 4.2致敏：50mL致敏液中致敏30min 4.3水洗：3 x 10min 4.4银染：50mL银染液中染20min （保持避光） 4.5水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色) 4.6显色：50mL显色液中显色，时间视显色程度而定 4.7终止：50mL终止液中终止10min 4.8保存：1% 冰醋酸，4 ℃ 5、注意事项 88
醇的制备方法总结
一、烯烃的水合 二、硼氢化——氧化反应 硼氢化反应的特点是步骤简单，副反应少和生成醇的产率高，该反应是实验室制备醇的一种有用的方法。通过骗人那感情化反应所得的醇恰巧和烯烃直接催化与水加成得到的醇相反，相当于水和碳碳双键的反马氏规则加成产物，这是用烯烃为原料的任何其他方法所难以获得的。 三、羟汞化——脱汞反应 此反应相当于烯烃与水按马氏规则进行加成，反应具有高度的位置选择性，而且，此反应速率快，反应条件温和，无重排产物且产率高。 四、醛、酮与格氏试剂反应 H 2C CH 2 + H 2O CH 3CH 2OH H 2C CHCH 3 (BH 3)2 H O HO CH 3CH 2CH 2OH H 2C CHCH 2CH 3 22CH3CH2CHCH 2HgOAc OH NaBH 4 CH 3CH 2CHCH 3 OH
1、格氏试剂与甲醛作用得到伯醇 2、格氏试剂和其他醛作用，得到仲醇 3、格氏试剂与酮作用生成叔醇 五、醛、酮与水加成 六、由醛、酮还原 醛加氢还原成伯醇 O H + R MgX H C OMgX H H 2O H H C OH H R O H + R /MgX R R C OMgX H R / H 2O H R C OH H R / O R + R /MgX R R C OMgX R R / R C OH R R / O R /+ H 2O R OH R / OH R O C H H + H 2O C OH OH H H C O R H + H 2 Ni R CH 2OH C O R R / + H 2 Ni R C H R / OH
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次 摘要: 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品,上生物帮 >> >> 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高 5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。 用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
银染步骤及注意事项
银染步骤是1 固定10冰乙酸min。2 清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。3 染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。现配染色30min。4 清洗迅速洗凝胶次。 5 显影30g 碳酸钠1.5mL37甲醛200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括 1 用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。2 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。3 在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。 4 甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。 5 在使用前及时配染色液。银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D 凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有
关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o 100ml 乙醇40 乙醇o 25ml冰醋酸10 冰醋酸o 加水到250ml 致敏30min o 75ml 乙醇30 乙醇o 17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗3 x 10min 银染20min o 0.625g AgNO3 o 100 ul 37甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 水洗2 x 1 min 注意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37 甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 终止10min o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸o 加水到终体积250ml 保存1 冰醋酸4 ℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3 最好多配制一份显色液第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液显色到点清晰。 4 显色过程很快要注意把握时间避免染色过度。5银染液和显色液需要预冷。 6 所用器皿要很洁净不用手直接接触以免杂蛋白污染7 清洗用水尽量用高纯度去离子水蒸馏水更佳可以减少背景着色。
药剂学---制备方法总结
药剂学---制备方法总结： 一、软膏剂： 1、研和法：小剂量 2、熔和法：大剂量 3、软化法 二、栓剂 1、热熔法 2、冷压法 三、软胶囊剂 1、滴制法 2、压制法 四、小丸 1、沸腾制粒法 2、喷雾制粒法 3、包衣锅法 4、挤出滚圆法 5、离心抛射法 6、液中制粒法 五、气雾剂 1、压灌法 2、冷灌法 六、膜剂
均浆制膜法 热塑膜法 复合制膜法 七、混悬剂 1、分散法 2、凝聚法 ①、物理凝聚法 ②、化学凝聚法 八、微囊 ①物理化学法：单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法、改变温度法、液中干燥法 ②物理机械法：喷雾干燥法、喷雾冻凝法、空气悬浮包衣法、多孔离心法、锅包衣法 ③化学法：界面缩聚法、辐射交联法 九、包合物 ①饱和水溶液法（重结晶法、共沉淀法） ②研磨法（捏合法） ③冷冻干燥法——注射用包合物 ④喷雾干燥法——工业大生产饱和水溶液法（重结晶法、共沉淀法） ⑤研磨法（捏合法） ★背记技巧★冷喷饱研 包合物的验证
相溶解度法 X-射线衍射法 热分析法 红外光谱法 核磁共振法 荧光光谱法 十、固体分散物 ①熔融法：热敏药物、熔点较低载体 ②溶剂法：共沉淀物 ③溶剂-熔融法：小剂量或液态药物 ④溶剂-喷雾/冷冻干燥法：热敏药物 ⑤研磨法：小剂量药物 固体分散物的验证 热分析法 X-射线衍射法 红外光谱法 核磁共振法 溶解度与溶出速度法 包合物的验证 相溶解度法 X-射线衍射法 热分析法
红外光谱法 核磁共振法 荧光光谱法 十一、糖浆剂 溶解法 混合法 十二、芳香水剂 溶解法 稀释法 十三、甘油剂 溶解法（碘甘油） 化学反应法（硼酸甘油）十四、醑剂 溶解法 蒸馏法 十五、溶胶剂 1.分散法： ①机械分散法 ②胶溶法 ③超声分散法 2.凝聚法： ①物理凝聚法
SDS-PAGE电泳操作流程—含考染 银染 碘染
SDS-PAGE操作流程——考染 1、准备溶液 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】 各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml 29%Acrylamide(丙烯酰 290g 29g 胺) 10g 1g 1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰 胺) 【配制方法】 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 名称用量备注 Tris 12.1g 去离子水80ml 浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】 4℃保存。 【注意事项】 对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5MTris-HCL 名称用量备注
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
我们实验室用的银染方法
我们实验室用的银染方法 1.50%甲醇浸泡15分钟（置于摇摆床上，以下省略，本步骤两次，每15分钟更换一次） 2.10%甲醇浸泡10分钟 3.水漂洗3次，每次数秒 4.2 gM DTT溶液浸泡20分钟 5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟 6.水漂洗3次，每次不超过15秒（每次约150ML） 7.显色液漂洗3次，每次不超过15秒（每次约100ML） 8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带（约200ML） 9.10G柠檬酸定影 显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水，用前加入250 g L福尔马林搅拌均匀 水用双蒸水就可以，纯度越高越好，其他试剂用分析纯，据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏 此方法岀自冷泉港蛋白质技术指南（实际上是其蛋白质技术会议的总结）灵敏度稍低于分子克隆上老方法，但是非常方便，也比其他方法快速，只需要1.5小时，我染岀来的胶非常漂亮，有需要的话可以上传给大家看看 一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。 其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净 大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白 1.取下凝胶，蒸馏水冼胶30秒. 2.0.1% 硝酸银染色10分钟. 3.弃去染色液，蒸馏水洗胶1分钟. 4.显色液显色15秒，换用新的显色液，显清条带为止. 显色液配方：10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液，定溶到500ml. 这个染色方法挺好的，我用过.注意染色时间不能长 材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。 液体的量一般是胶体积的5倍，比如13X13X 0.1cm的胶，用一百ml 一定够，80也行
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明 货号:G7210 规格:1L 保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。 试剂盒内容：G7210 染色液A200ml 染色液B1ml 染色液C100ml 显色液D100ml 试剂E2g 注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。 产品说明: 蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。 操作步骤: 一、染色液配制(无水乙醇自备) 需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。
1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀； 2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀； 3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。 4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。 5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。 二、染色： 1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。 2.将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min。可置于摇床上缓慢摇晃 3.弃去敏化液，用去离子水漂洗三次，每次10min。 4.将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min。 5.将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃，该显色一般在10min 左右。 6.再选择合适的时间进行终止，弃去显色液，加入终止液即可。最后可进行信号收集保存。注意事项： 1.银染主要出现在PAGE胶的表面，使用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。 2.对于考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。考染过程中的乙酸会干扰银染，因此要确保将PAGE凝胶中残留的乙酸彻底洗净。 3.不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。 4.染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60rpm.
高纯氧化镁的制备方法汇总
高纯氧化镁制备方法 1．卤水制备氧化镁 1.1石灰法 将氯化镁溶液与煅烧石灰石（或白云石）灰乳反应生成氢氧化镁，煅烧得氧化镁。 此法会产生1t镁砂会产生2.76吨CaCl2，如果不能对其进行有效利用，会造成新的废物堆积，只是生产不能扩大。 1.2碳铵法 碳酸氢铵（或二氧化碳和氨）同氯化镁溶液反应生成碱式碳酸镁，经煅烧得到氧化镁。
该法以碳酸氢氨为原料，蒸发水量大，势必耗能较大，生产成本较高。如果能够利用合成氨工厂排放的二氧化碳及中间产品氨为原料，可降低其成本。 1.3氨法 将水氯化镁石（或老卤）与液氨加入晶种沉镁，沉淀经洗涤、烘干、煅烧得到氧化镁产品。 此法沉镁效率可达80%-85%，氨转化率可达80%,产品中氧化镁质量分数在99%以上，副产品NH4Cl可作为化肥化工原料，而且无三废，基本无污染。如在沉镁过程中添加特殊晶种核心，可产生超细氧化镁、磁性氧化镁和空气氧化镁等等。 1.4纯碱法 将卤水与纯碱反应，生成碱式碳酸镁沉淀，洗涤脱水后煅烧，制得氧化镁。 此法制得的氧化镁产品纯度较高，工艺简单，能耗小，但使用纯碱会使成本过高。
以上方法都在液相中反应，通过加入沉淀剂、洗涤剂和化学精制等方法除去杂质离子，保持碱式碳酸镁或氢氧化镁的纯度，最终高纯镁砂纯度可达99.9%以上。但是卤水生产高纯镁砂成本过高，能源消耗大，生产工艺复杂，存在很多难点. 1.5水氯镁石直接热解 含水氯化镁直接在空气（或热气流）中加热，随着温度升高能逐步失去结晶水。反应方程式如下： 该法工艺流程较简单，不需消耗任何辅助原料，使生产成本降低，更易实现镁的高值化和产业化。现行方法主要有喷雾法和沸腾炉法。 1.5.1喷雾热解法 将卤水直接喷入热分解反应炉中进行热分解，煅烧后得粗氧化镁，多次水洗除去未完全分解的可溶性氯化物，粗氧化镁完全水化生成氢氧化镁，煅烧至轻质氧化镁，再重烧得到高纯镁砂，纯度可达99%以上。 喷雾法工艺流程用此法生产氧化镁具有工业规模的厂家是以色列Mishor Rotem的死海方镁石公司。此工艺的热解时间短，生产成本较低，但回收率比较低，氯化氢尾气腐蚀性强，对设备的要求很高，而且对氯化氢尾气的吸收和浓缩有很大难度。 1.5.2沸腾炉热解法 将原料经沸腾炉脱水，热解和焙烧，产品由出料管自动溢入集料缶储存。 矿石沸腾炉炉体散热较大，应采用适当的隔热保温措施，才能较低散热，提高炉子的有效热利用率。 2.固体矿制备氧化镁 2.1煅烧菱镁矿法 菱镁矿中含90%以上的碳酸镁，以及少量碳酸钙和其他微量杂质，直接煅烧便能得到纯度较
材料制备方法 考点总结
材料制备方法重点整理 第1章单晶材料的制备 1.单晶材料的四种制备方法 ①气相法生长单晶vapor phase ②溶液法生长单晶aqueous phase ③熔体法生长单晶melt ④熔盐法生长单晶molten flux 2. 气相法生长单晶 ①升华Sublimation- Condensation：将固体沿着温度梯度通过，晶体在管子的冷端从气相中 生长的方法。【常压升华（约1atm)：As、P、CdS 减压升华（<1atm): ZnS、CdI2、HgI2】②蒸气运输法Vapor transport growth：在一定的环境相下，利用载气来帮助源的挥发和输运， 从而促进晶体生长的方法。（常用载气：卤素W+3Cl2→WCl6） ③气相反应法Vapor reaction growth：各反应物直接进行气相反应从而生成晶体的方法。 例：GaCl3+AsCl3+H2→3GaAs + 6HCl 3. 溶液法生长单晶 ①溶液蒸发法：通过溶剂挥发的手段促进晶体析出 ②溶液降温法：在较高温度下制备出饱和溶液，利用溶解度随着温度下降而降低的 原理，促进晶体析出 ③水热法：在高温高压下的过饱和水溶液中生长单晶的方法。主要装置为：高压釜。 例子：水晶，刚玉，方解石，氧化锌以及一系列的硅酸盐，钨酸盐和石榴石等。 ④温差水热法：高压釜内部因上下部分的温差产生对流，将高温的饱和溶液带至籽 晶区形成过饱和溶液而结晶。冷却析出部分溶质的溶液又流向高温区，溶解原料。 循环往复至单晶生长完成。（图见右） 4. 熔体法生长单晶 ①提拉法Czochralski method（会画示意图） 提拉法是将构成晶体的原料放在坩埚中加热熔化，在 熔体表面接籽晶提拉熔体，在受控条件下，使籽晶和 熔体在交界面上不断进行原子或分子的重新排列，随 降温逐渐凝固而生长出单晶体。提拉法的生长工艺首 先将待生长的晶体的原料放在耐高温的坩埚中加热熔 化，调整炉内温度场，使熔体上部处于过冷状态；然后在籽晶杆上安放一粒籽晶，让籽晶接触熔体表面，待籽晶表面稍熔后，提拉并转动籽晶杆，使熔体处于过冷状态而结晶于籽晶上，在不断提拉和旋转过程中，生长出圆柱状晶体。 优点：1）可以直接观察晶体的生长情况，为控制晶体外形提供了有利条件。 2）晶体在熔体的自由表面处生长，不与坩埚接触，能够显著减小晶体的应力，并防止坩埚壁上的寄生成核。 3）使用定向籽晶或得特定取向的单晶体，降低位错密度，提高晶体的完整性。 缺点：1）一般要用坩埚做容器，导致熔体有不同程度的污染。 2）当熔体中更含有易挥发物时，则存在控制组分的困难。 ②坩埚法Bridgeman method（会画示意图） 熔体在坩埚中逐渐冷却而生长单晶，坩埚可以垂直 或水平放置。制备过程为，在一定的温度梯度场中 移动坩埚，或者坩埚固定，移动加热炉或者降温。 优点：设备相对简单，生长很大直径单晶，形状可 通过设计坩埚来限制，可以在封闭体系中进行，防 止挥发性物质挥发。