叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定

单位：

班级：

实验操作人：实验同组人：

实验地点:

指导老师：

实验操作时间：

叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定

一、实验目的

1．分析叶绿素铜钠的纯度，计算产率。

2．从绿色植物中提取叶绿素并算提取率。

3．利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征

4．初步研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的条件

二、实验原理

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色茎中，是植物进行光合作用的催化剂。叶绿素难溶于水，易溶于有机溶剂。

通常说的叶绿素是指由多种含镁卟啉化合物共存的混合物，有a,b两种R=CH3者为a型

R=CHO者为b 型

叶绿素一旦离开活性植物体，就很不稳定，；把叶绿素转化为叶绿素铜钠盐，就解决了上述问题。叶绿素铜钠盐也有a，b型。

b 型中的—CHO在多步反应中易被氧化，以钠盐形式存在。

将蚕沙中萃取的叶绿素粗品（无溶剂物称糊状叶绿素），经皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，就可得出叶绿素铜钠盐成品。

鉴别叶绿素铜钠盐的纯度要看它的吸光度（E1%1cm405nm），在

规定条件下，吸光度值大，叶绿素铜钠盐含量高。其中E1%1cm不低于568。

利用多波长分光光度法对产品叶绿素铜钠进行初步表征。测定叶绿素铜钠质

量的三项指标：吸光度比值、游离铜含量、干燥失重。

a和叶绿素b分子式如下：

叶绿素与碱发生皂化反应：

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：

C55H72MgN4O5+ 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2+ CH3OH + C20H39OH

在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：

C34H30O5N4MgNa2 + 4 H+→ C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+

叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：

C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+

C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O

蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］。

本实验采用稀碱性溶液从蚕沙中提取叶绿素.成分分析方法：叶绿素酸铜钠含量、产品酸碱度、产品干燥失重、游离铜均按GB 3262－82中规定方法进行测定。

三、仪器和试剂

（一）、试剂：

A、叶绿素铜钠合成

101.3g干竹叶，95%乙醇(>600)，5%固体NaOH，浓盐酸，丙酮，500-600mL石油醚，CuSO4，蒸馏水，40%乙醇，5%NaOH水溶液，5%NaOH-乙醇溶液，温度计

B、叶绿素铜钠质量分析

1、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合

（二）、仪器：

A、叶绿素铜钠合成

粉碎机，带温度计，搅拌器的烧瓶1个，回流冷凝管1支，恒温槽，100ml个烧瓶，冷凝管，1个抽滤瓶及漏斗，胶管若干，玻璃棒，100mL量筒1个，500ml圆底烧瓶，旋转蒸发器一台，台氏天平1台，试纸若干

B、叶绿素铜钠质量分析

751分光光度计1台，台式天平、分析天平各一台

四、实验步骤

（一）叶绿素铜钠的合成

1、蚕沙的浸泡及溶液的合成：

称取干燥蚕沙50g于500ml的烧杯中，加适量水润洗，加入150ml 80%的丙酮溶液使其完全浸没，置于30-40℃的恒温水浴中搅拌回流，3小时后取出并立即过滤，滤渣复浸一次。分离得墨绿色溶液转入500ml圆底烧瓶，于60-70℃水浴蒸出丙酮，当温度计读数骤然下降时，蒸发结束。回收的丙酮可循环用于下一批蚕沙的浸泡，将剩下的溶液从圆底烧杯移至布氏漏斗，抽滤浓缩、风干、称量。

2、皂化：

将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用2%到5%NaOH水溶液调节使其p H等于11，用水浴加热在60℃下皂化回流0.5到1小时，收取下层。

3、萃取：

将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取2-3次，除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取3次。

4、调酸铜代：

将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀（1：1）盐酸溶液调节pH值为7后，按卒取液：加入20ml10%的硫酸铜溶液，再加入10%的硫酸铜，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，60℃搅拌1小时。

趁热过滤，用95%乙醇洗涤4次后抽干。合并滤液和洗液，加入2-3倍的纯水，析出叶绿素铜，静置4小时后过滤，滤饼用适量石

油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+

Cl及残留的叶黄素和其他有机杂质。

5、成盐：

洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH为11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），过滤，滤饼用95%乙醇洗涤4次。取滤液于小烧杯在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。

（二）叶绿素铜钠质量鉴定

1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%

溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶

液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm 波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。

2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入

10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL 溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL ，摇匀，即为0.001%

溶液，此液最大吸收峰为405nm 与630nm ， 吸光比A405nm/A 630nm 为3.2～4.0。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定

称取烘干成品0.1克（精确至0.0002克），加水溶解，移入100 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2mL 溶液移入50mL 容量瓶，用pH7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm 与630nm 。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

计算

吸光比=A A

nm

nm

630405

五、注意事项：

1. 水浴加热时温度控制不宜加热过快；

2. 减压蒸馏时对压力的要求不能过高；

3. 保证浸润时间足够、提取完全；

4. 实验操作的规范及安全问题。

六、实验结果：

（一）产品的产率计算

1%水的PH=8.13

原料蚕沙的质量M=50.2g

滤纸的质量：1.0440g

滤纸加产品的质量：1.0704g

产品叶绿素铜钠的质量：M1 =1.0704g-1.0440g =0.0264g

产品叶绿素铜钠的外观：块状有墨绿色金属光泽固体；

叶绿素铜钠产率为W= M1 / M = 0.0264/50×100% =0.0528%

(二) 产品叶绿素铜钠纯度

由叶绿素铜钠盐标准曲线（见附表一）可得，其标准方程为

Y=83460x+0.00987

通过测定得0.001%叶绿素铜钠溶液在415nm、655 nm下的吸光度值分别为：

A 415＝0.403，A 655 =0.139

吸光比：吸光比=A A

nm

nm

655415=

139

.0403.0=2.9

故当A415nm=0.403时，百分含量：

x=(0.403-0.0987)/83460=0.00000365=0.000365%，

即在称取的样品叶绿素铜钠0.0157g 中实际含有的铜钠盐质量为：

m=0.00000365×100=0.000365

所以本次实验制备的产品纯度为η=0.000365/0.0157×100%=2.32%

表 1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）

溶液百分数（%）A

405

0.0005 0.291

0.001 0.543

0.0015 0.771

0.002 0.998

0.0025 1.150

叶绿素铜钠盐标准曲线

表 2 标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数

据表

波长/nm 吸光度A 波长/nm 吸光度A 波长/nm 吸光度A 350 0.407 470 0.150 590 0.140 355 0.432 475 0.136 595 0.145 360 0.464 480 0.127 600 0.152 365 0.502 485 0.119 605 0.162 370 0.545 490 0.114 610 0.179 375 0.609 495 0.112 615 0.212 380 0.677 500 0.112 620 0.250 385 0.756 505 0.110 625 0.280 390 0.818 510 0.106 630 0.297 395 0.888 515 0.099 635 0.290 400 0.939 520 0.096 640 0.264 405 0.966 525 0.094 645 0.227 410 0.939 530 0.093 650 0.197 415 0.820 535 0.094 655 0.166 420 0.637 540 0.094 660 0.140 425 0.487 545 0.094 665 0.121 430 0.325 550 0.096 670 0.108 435 0.323 555 0.097 675 0.094

440 0.280 560 0.099 680 0.084 445 0.247 565 0.103 685 0.066 450 0.221 570 0.110 690 0.066 455 0.201 575 0.119 695 0.059 460 0.181 580 0.128 700 0.054 465 0.164 585 0.135

绘制标准样品的叶绿素铜钠吸收曲线

表3 产品叶绿素铜钠的吸收曲线的测定数据表

产品叶绿素铜钠的吸收曲线

七、实验分析：

本实验根据相似相容原理，叶绿素是一种有机物，难溶于水，易溶于有机溶剂。将蚕沙中萃取的叶绿素粗品（无溶剂物称糊状叶绿素），经皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，由于叶绿素中的—CHO 在多步反应中易被氧化，以钠盐形式存在，这样就可得出叶绿素铜钠盐成品。

皂化反应生成钠盐：

C55H72MgN4O5+ 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2+ CH3OH + C20H39OH

在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：

C34H30O5N4MgNa2 + 4 H+→ C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+

叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶

于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：

C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+

C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O

误差分析：

实验中，由于叶绿素易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，在搅拌回流提取叶绿素时，加入的量不足、时间、温度等的影响，没有能使蚕沙中的叶绿素全部萃取出来，有部分叶绿素还留在滤渣中，使得到的结果偏低；在抽滤时，由于叶绿素没有过滤完全，部门还残留在滤纸上，这样也会使得到的结果偏低；在实验过程中，得到的滤液要从布氏漏斗转移到圆底烧瓶中，在转移过程中有部分叶绿素沾在容器壁，不能完全的转移，得到的结果也会使产品偏低；同理，在浓缩的同时，转移的同时不能使产品完全的转移，部分留在溶剂壁，也会使结果偏低；在皂化中，水浴加热时间不足，反应不能充分进行得到的产物会减少；在铜代过程中，由于铜钠盐易溶于水，在加水静置时，加入的蒸馏水不足，不能使叶绿素铜完全析出，得到的产品相对的降低，在过滤时，有部分为过滤完全，流到滤液中，使部分损失；在铜钠的滤渣清洗中，用了工业酒精，由于工业酒精含有4%的水，而叶绿素铜钠易溶于水，所以得到的产品有部分溶在水中，不能过滤得到溶于水中的叶绿素铜钠，所以得到的产品相应的减少，使产率降低。在反应中，搅拌回流需要3小时的时间，且滤渣要重复浸取，故是个漫长的过程，在试验中，每个环节多要有足够的时间，才能使反应得于充分进行，便于得

到更高的产率。

本实验有如下影响因素：1、浸提时间对提取效率的影响浸提时间对提取效率的影响极为显著。随着浸提时间的增加叶绿色的提取率并不是增加的，这可能是由于浸提提取的同时，还会有温度及其它因素对色素稳定性产生的影响；2、水浴温度对提取效率的影响不同的水浴温度对提取率影响差异较大，并且有随水浴温度升高，叶绿素提取效率逐渐提高的趋势。但在实际操作中如果水浴温度过高，不仅会影响到提取叶绿素的保存率，而且会因为温度的升高而增加成本以及提取液的逸失；3、固液比与提取效率间的关系固液比对提取效率的影响不是很明显，原因可能是因为固液比过高后在水浴浸泡和蒸馏的过程中由于温度的影响相对流失的溶解在提取液中的叶绿素较多；丙酮-石油醚比例丙酮-石油醚的比例对提取效率的影响没有温度和时间的影响显著，数据显示每增加相同单位的混合液比例，所提取到的叶绿色含量就更高。由此推测混合比例越大，提取率越高。

本实验的验证性试验初步确定的提取工艺参数组合对叶绿素的提取效率比较稳定甚至有超过前期试验结果的迹象。原因可能是前面实验时，是待所有的绿色素提取过程全部完成后，集中进行比色测定的；而验证性试验是在叶绿素提取完毕后立即进行比色滴定。这便可证明，提取的叶绿素会随其溶解在石油醚中的时间延长而发生分解。因此实验应尽快进行浓缩分离，以提高叶绿素的提取率。

实验心得：

本实验是从蚕沙中提取叶绿素及叶绿素铜钠的合成，提取溶剂浸泡蚕沙，提取叶绿素，通过对提取液中叶

绿索含量及稳定性的研究，确定最佳叶绿素提取方案。结果以丙酮：无水乙醇=2：1的混合溶剂提取效果最好，提取液最稳定。叶绿素是以蚕沙为原料提取而得的食用天然色素。作为天然绿色食品，色泽优良，性质稳定，安全性高。蚕沙的质量直接影响到叶绿素的产率和质量。生产叶绿素是，要选用优质的蚕沙，这样得到的产品率才比较高。蚕沙在提取叶绿素前，蚕沙要脱水，经软化后的蚕沙水分较多，影响产品的热减量、纯度及萃取溶液的浓度，为止要在萃取前脱水处理。用90%以上的丙酮脱水，丙酮的用量1:1.3（重量比体积），得到的效果比较好。丙酮脱水后就可以进行萃取，第一次萃取进液浓度要在90%以上，用量为1:3.5（重量比体积），25度以上萃取90分钟；第二次萃取丙酮浓度要在88%以上，用量为1：2.5，25度以上萃取60分钟；第三次条件与第二次相同，在35度到40度之间萃取40分钟，这样得到的叶绿素产率就相对较高。经萃取后的丙酮要进行回收，回收后的丙酮可以进行下一次实验的萃取。本实验对丙酮回收的方法是旋转蒸发回收，在旋转蒸发器中以60-70度蒸发回收丙酮。在对萃取液进行浓缩前，静置沉淀，过滤后就可以对萃取液进行浓缩。本实验浓缩是在旋转蒸发器中进行，温度为60-70度，浓缩30-60分钟。浓缩时，罐内伴有大量泡沫产生并逐步布满整个表面，注意不要等泡沫

上升，就可以停止加热，放冷。使用夹层浓缩罐时要注意不能用气相温度来判断终点，浓缩过程中不能有压力产生，否则会影响产品质量和产量。在静置分离时，当丙酮浓度浓缩到50%一下时，糊状叶绿素就会与浓缩液分离，但分离出的糊状产品又会部分溶在丙酮黄水相中，不同的丙酮浓度存在不同的溶解平衡。当丙酮浓度降至30-40%时，分离出来的糊状叶绿素产品纯度最高，呈绿色，热量低，收率高。因此，必须严格把握丙酮的浓缩程度。

叶绿素成品、半成品不能长期放置在容器中，与空气、阳光、热源接触时间不能超过24小时，否则得到的产品会偏低，产率降低。所以，本实验必须严格按照要求完成，搅拌回流、蒸发、浓缩等时间一定要足够，让反应得以充分的进行，才能使叶绿素和叶绿素铜钠比较完全的分离出来，得到的产品才多，产率才高。要是在实验过程，反应、静置等时间不足，提取出的叶绿素就比较少，在进行皂化、铜代等过程中就会少，又由于在浓缩、蒸发、过滤等过程中得到的产品有损失，最终得到的产品少，产率就很低。所以，实验的过程必须合理、严格进行。

参考读物

1 周维纯, 王金秋. 松针叶绿素铜钠盐的研制和运用［J］.北京：林产化学与工业，1986

2 李严巍, 邹昌淇, 林笃江. 苎麻天然绿色色素的研制［J］.上海：食品科学， 1993

3 甘廉生. 柑桔、荔枝、香蕉、菠萝优质丰产栽培法［M］.北京：金盾出版社， 1991.

4 南京林产工业学院主编. 栲胶生产工艺学［M］. 北京：中国林业出版社，1983.152.

5 林秀兰，高君强，陈亿远，等.黑荆树枝丫材、间伐材提炼栲胶可能性研究［J］.福建：福建林学院学报，1999

6 马自超, 吴伟志, 陈亿远,等.由竹叶制取叶绿素铜钠盐研究［J］. 南京：南京林业大学学报，1991