转基因大豆论文转基因食物论文

基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第6期，第1177－1183页

Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.6,1177－1183

技术改进

Upgrated Technology

转基因大豆GTS40－3－2转化事件特异性PCR检测

王恒波1,2陈平华1,2郭晋隆1陈如凯1*许莉萍1

1福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室,福州,350002;2农业部甘蔗及制品监督检验测试中心转基因生物产品检测室,福州, 350002

*通讯作者,phcemail@https://www.360docs.net/doc/7512720692.html,

摘要GTS40－3－2是抗草甘膦转基因大豆，为建立GTS40－3－2大豆转化体特异性PCR检测方法，本研究以GTS40－3－2标准品为实验材料，根据已公布转基因大豆GTS40－3－2基因与大豆基因组连接序列信息，利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物，对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测，结果显示，5对特异性引物均能够从GTS40－3－2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp 的预期产物，可用于特异性检测转基因大豆GTS40－3－2转化事件。以转基因大豆GTS40－3－2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测，结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较，最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

关键词转基因大豆,GTS40－3－2,转化事件,特异性PCR检测

Specific PCR Validation of Transformation Event for Transgenic Soybean GTS40－3－2

Wang Hengbo1,2Chen Pinghua1,2Guo Jinlong1Chen Rukai1*Xu Liping1

1Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2Quality Supervision,Inspection and Testing Center for Sugarcane and Derived Products of Ministry of Agriculture,Fuzhou,350002

*Corresponding author,phcemail@https://www.360docs.net/doc/7512720692.html,

DOI:10.3969/gab.029.001177

Abstract GTS40－3－2is a glyphosate-tolerant transgenic soybean.In order to establish a specific PCR validation method for transgenic soybean GTS40－3－2,in this research,we employed GTS40－3－2standard sample as the ex-periment material,and designed five specific PCR primers based on the junction sequence published between transgenic soybean gene GTS40－3－2and soybean genome by using Primer5.0software to PCR validation the Tm value,specific and the amplification efficiencies from each primer.The results showed that the products size of five primers was in accordance with expected one which was279bp,238bp,470bp,490bp and257bp respec-tively from the standard reference GTS40－3－2and they can be used for specific validation of transformation event in transgenic soybean GTS40－3－2.Further,we utilized the content of5%,2%,1%,0.5%and0.1%transgenic soy-bean GTS40－3－2as the sample to carry out PCR sensitivity validation,the results demonstrated the sensitivity of the five primers could reach0.1%.Finally,we selected out RRS2primer was the best primer for specific validation of transformation event in transgenic soybean GTS40－3－2by using fluorescent quantitative PCR in comparison with Ct values and the melting curves among five specific Primers.The results of this paper would provide a scien-

基金项目：本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(nycytx－24)、国家948项目(2006－G37,2010－S19)、国家基金项目(310 70330)、国家“863”计划项目(2007AA100701)、福建省科技计划重点项目(2007I0036)、福建省自然科学基金项目(2009J05050)和福建科技项目备案(F2007AA100701)共同资助

基因组学与应用生物学

Genomics and Applied Biology

tific and reasonable experiment refference for validating the composition of genetic modified organisms in the fu-ture in our country.

Keywords Transgenic soybean,GTS40－3－2,Transformation event,Specific PCR validation

自从世界第一例转基因烟草1983年在美国问世以来，国际上已有三十多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类达四十多种。其中转基因大豆是世界上商品化最早、推广应用速度最快的转基因作物(余永亮等,2010)。国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)2010年2月24日公布的年度报告显示，2009年全球转基因作物的种植面积达到了1.34亿ha，比2008年增长了7%，1996年至2009年间转基因作物种植面积空前增长了80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。其中转基因大豆种植面积占全球9000×104ha大豆的3/4，占转基因作物总种植面积的50%，分布国家从2个增至10个(James,2008)，在所有转基因作物中种植面积最大，是全球最重要的转基因作物(钟金传等,2005)。

中国作为WTO的成员国之一，已经从国外大量进口转基因大豆。为了保护我国大豆种质资源安全，保证我国在进口大豆产品贸易过程中的利益，国务院颁布《农业转基因生物标识管理办法》等法律法规，要求实行转基因标识制度。我国政府对转基因生物产品的标识制度为定性标识，即零阈值。转基因标识制度能否被顺利执行，关键在是否有稳定、准确和高灵敏度的检测技术作保障(王恒波等,2008;李晓丹和王世平,2003,食品研究与开发,24(5):106-109)。转基因检测通常是针对外源DNA和外源蛋白的检测，一是应用PCR和杂交法(徐景升,2004)；二是应用ELISA检测表达的外源蛋白。PCR法能够高效地扩增低拷贝数的外源DNA，是核酸现行首选的检测方法。针对PCR方法又分为筛选检测、基因特异性检测、结构特异性检测和转化体特异性检测(李飞武等,2009)。李飞武等(2009)以lectin基因作为内参照基因建立了转基因大豆RR2Y转化体特异性定性PCR检测方法；李飞武等(2010)对转基因大豆MON 89788转化体特异性进行了定性PCR检测；袁磊等(2010)建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。转化体特异性检测是以外源基因与植物基因组相连接区域为检测对象，这样连接区域对不同转基因株系都是其特异的，并且在基因组上是单拷贝，因此该类检测方法具有高度的特异性(李飞武等,2009)。目前已经建立转化体特异性检测方法的转基因转化体包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513和MON1445 (Berdal and Holst-Jensen,2001;Christer et al.,2004; Hernández et al.,2003;2004;Huang and Pan,2004; Pan et al.,2006;Taverniers et al.,2005;Yang et al., 2005)等。而推广面积较大的抗草甘膦大豆(GTS40－3－2)未见有品系特异性检测引物及相关检测标准，本文通过NCBI查找已公布该大豆的旁侧序列信息，设计5对特异性引物进行PCR验证检测，从引物的退火温度、特异性、灵敏度及引物与模板的结合优先性方面进行检测，筛选该品系大豆特异的PCR反应的最佳条件，从而建立转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测方法，为规范我国转基因标识制度提供强有力的技术支撑。

1结果与分析

1.1基因组DNA质量分析

高质量的基因组DNA是PCR检测的前提条件，核酸浓度与纯度测定的结果显示所有样品的A260/280均在2.0左右，说明所获得的DNA都比较纯，可进行进一步实验。按照标准规定对物种的内源单拷贝基因进行PCR检测，可以判定提取的DNA是否适合进行PCR扩增，可以避免假阴性检测结果的出现，因此，通过扩增大豆的内源单拷贝Lectin基因，可以判断提取的大豆DNA是否符合PCR检测要求(图1)。由图1结果可以看出，所有样品的PCR

图1大豆Lectin基因的电泳检测

注:M:100bp DNA Ladder Marker;1,2,3:5%含量转基因大豆GTS40－3－2;4,5,6:1%含量转基因大豆GTS40－3－2;7,8,9: 0.5%含量转基因大豆GTS40－3－2;10,11,12:0.1%含量转基因大豆GTS40－3－2

Figure1Electrophoresis validation of Lectin gene in soybean Note:M:100bp DNA Ladder Marker;1,2,3:5%transgenic soy-bean GTS40－3－2;4,5,6:1%transgenic soybean GTS40－3－2; 7,8,9:0.5%transgenic soybean GTS40－3－2;10,11,12:0.1% Transgenic soybean GTS40－3－

2

1178

产物均能获得与预期大小118bp 的片段相符合，表明所提取的DNA 质量符合PCR 扩增要求。1.2PCR 产物测序分析

根据外源基因与大豆基因组之间的连接区域序列设计引物，引物对RRS1、RRS2、RRS3、RRS4、RRS5获得的实际扩增产物大小与预期的扩增产物大小约279bp 、238bp 、470bp 、490bp 、257bp 相符合，说明可用于特异性检测转基因大豆GTS40－3－2转化事件。然后将所得PCR 产物进行序列测定，再利用DNAMAN 对所得序列进行序列同源性分析，结果显示同源性为100%，表明PCR 扩增产物与设计引物时预期序列片段大小一致，再经过网上Blast 序列比对，发现结果与GenBank 登录号为AJ308515、AJ308514和AB209952的基因完全一致。1.35对特异性引物退火温度的优化

本文通过梯度PCR 对5对特异性引物从50.2~60℃10个温度梯度进行退火温度的优化。按照定性PCR 反应体系进行扩增(图2)，从图2可以得出，随着退火温度的升高，5对特异性引物都能检测出相应的目的条带，且几乎没有非特异性条带出现，说明5对特异性检测引物适宜的退火温度范围均较广，其中8号(58℃)扩增产物在5对特异性引物中的均显示出浓度较高、条带较亮，即通过引物的筛选和反应条件的优

图2特异性引物退火温度优化

注:A,B,C,D,E:分别为5个引物对的扩增结果;M:100bp DNA Ladder Marker;1:50.2℃;2:50.7℃;3:51.6℃;4:52.7℃;5:54.0℃;6:55.4℃;7:56.8℃;8:58.1℃;9:59.2℃;10:60℃Figure 2Optimization of primers at different annealing temper-ature

Note:A,B,C,D,E:Amplification results of 5primer pairs,respec-tively;M:100bp DNA Ladder Marker;1:50.2℃;2:50.7℃;3:51.6℃;4:52.7℃;5:54.0℃;6:55.4℃;7:56.8℃;8:58.1℃;9:59.2℃;10:60

℃

化，确定了最适退火温度为58℃。1.4转化体特异性引物的PCR 特异性检测

对表1中5对引物对RRS1、RRS2、RRS3、RRS4、

RRS5所用供试的转基因生物材料按照优化后的退火温度58℃进行进行定性PCR 扩增，特异性检测结果如图3所示，只有转基因大豆品系GTS40－3－2出现了279bp 、238bp 、470bp 、490bp 和257bp 的目的片段，其它材料均未扩增出任何片段，结果表明该5对引物具有较高的特异性和准确性。

1.5转化体特异性PCR 灵敏度检测

将转基因大豆GTS40－3－2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%标准品DNA 溶液(100ng/μL)，按照优化以后的退火温度58℃进行定性PCR 扩增(图4)，从图4可知，当DNA 含量为0.1%时，5个特异性引物对仍然能分别检测出279bp 、238bp 、470bp 、490bp 、257bp 的目的条带，说明转基因大豆GTS40－3－2的品系特异性引物RRS1、RRS2、RRS3、RRS4、RRS5最低检测极限(灵敏度)可以达到0.1%，比欧盟转基因产品最低标识阈值(0.9%)，高出近十倍。其中RRS2、RRS3、RRS4引物对的PCR 扩增产物较多，且这3个泳道的扩增条带亮度比另外2对引物大，说明这3

个

图3转化体特异性引物的PCR 特异性检测

注:A,B,C,D,E:分别为引物对RRS1、RRS2、RRS3、RRS4、RRS5对12个材料的PCR 检测;M:100bp DNA Ladder Marker;泳道:1:GTS40－3－2;2:MON89788;3:A2704;4:A5547－127;5:MON810;6:MON863;7:NK603;8:T25;9:TC1507;10:Bt11;11:Bt176;12:GA21

Figure 3PCR specific detection of transformants by specific primers

Note:A,B,C,D,E:PCR validation of 12materials by primers RRS1,RRS2,RRS3,RRS4,RRS5,respectively;M:100bp DNA Ladder Marker;Lanes:1:GTS40－3－2;2:MON89788;3:A2704;4:A5547－127;5:MON810;6:MON863;7:NK603;8:T25;9:TC1507;10:Bt11;11:Bt176;12:GA21

转基因大豆GTS40－3－2转化事件特异性PCR 检测

Specific PCR Validation of Transformation Event for Transgenic Soybean GTS40－3－2

1179

基因组学与应用生物学

Genomics and Applied Biology

引物对的扩增产物量高，引物与模版结合效率高。1.65对特异性引物的退火温度与溶解曲线比较

由于定性PCR 是终点定量，无法进一步说明引物与模板的扩增效率及引物的特异性。为了在5对特异性引物间选择出最适宜的引物对，本文按照定量PCR 反应程序将1%含量的DNA 样品进行定量

PCR 扩增，分别添加5对不同引物进行相互间比较，通过比较5对引物在相同反应条件下起峰时Ct 值的大小、溶解曲线及溶解曲线高度等，选择出转基因大豆GTS40－3－2最佳的检测引物，进而可为该方法提升为国家标准或行业标准提供更加严谨的实验依据。从图5可以看出，引物对RRS2最早起峰，Ct 值为35.2、峰值最高为0.24，其次RRS5、RRS4、RRS3和RRS1，Ct 值分别为35.5、36.4、36.4和37.4。从5对引物各自的溶解曲线分析(图片未显示)，只有RRS2引物成单峰型曲线，且峰值较高，说明PCR 扩增的产物量较多，而引物对RRS5、RRS1的溶解曲线都有双峰出现，说明产物不纯，有非特异性产物；RRS4的溶解曲线单一，但产物的Tm 值太低；RRS3的溶解曲线呈多峰，同样的样品扩增产物量过低。综合以上实验结果可以得出，引物对RRS2不仅特异性强，

且图4转化体特异性引物灵敏度检测

注:A,B,C,D,E:引物对RRS1、RRS2、RRS3、RRS4、RRS5对GTS 40－3－2标准品DNA 含量的检测;M:100bp DNA Ladder Mark-er (Tiangen);1:5%;2:2%;3:1%;4:0.5%;5:0.1%;6:空白对照Figure 4Sensitivity transformants by specific primers

Note:A,B,C,D,E:Detection for the content of standard sample DNA of GTS40－3－2by RRS1,RRS2,RRS3,RRS4and RRS5primer pairs,respectively;M:100bp DNA Ladder Marker (Tian-gen);1:5%;2:2%;3:1%;4:0.5%;5:0.1%;6:Blank control

PCR 扩增效率较高，为转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测最适引物对。

2讨论

为了贯彻我国的转基因标签制度的顺利执行，以及保护我国大豆种质资源，转基因检测部门需要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。随着越来越多的转基因生物及其产品流向市场，原有的检测方法已不能满足现有的检测任务，必须建立更加灵敏、准确、特异的检测方法。监管者与消费者对现有的转

基因生物制品检测提出更高的要求，不仅要知道该生物制品是否为转基因制品，而且还要进一步确定为哪个转基因品系，以防止有些转基因生物品系未经我国进行审批和危险评估而流入我国，此外，进行转基因品种鉴定，可以准确而有利地解决贸易上不可预知的纠纷。

PCR 检测方法中最核心的就是特异性引物，引物的特异性从根本上决定了检测方法的特异性。本文用到的引物是根据在已经公布的转基因大豆GTS40－3－2的外源基因整合大豆基因组的基础上，通过在外源基因序列5'端和3'与大豆基因组连接区域，设计了5对品系特异性引物，从不同温度的重现性、特异性、灵敏度以及在相同条件下不同引物与模

板的结合性方面，进行严谨而周密的测试，进而筛选出最适转基因大豆GTS40－3－2品系检测引物，

另一

图55对转基因大豆GTS40－3－2品系特异性引物荧光定量PCR 扩增曲线

注:RRS2引物对(蓝色曲线);RRS5引物对(红色曲线);RRS4引物对(绿色曲线);RRS3引物对(黄色曲线);RRS1引物对(黑色曲线)

Figure 5Quantitative real-time PCR detection of GTS40－3－2soybean references with five primer pairs

Note:RRS2primer pair (blue curves);RRS5primer pair (red curves);RRS4primer pair (green curves);RRS3primer pair (yel-low curves);Primer pair (black curves)

1180

方面，退火温度从一定程度上也决定着引物的特异性，为了使引物具有适宜的退火温度，必须对引物进行筛选和反应条件的优化。通过筛选优化本文最终确定了58℃为最适退火温度。

在对转化体特异性PCR灵敏度检测中，我们发现转基因大豆GTS40－3－2的品系特异性引物最低检测极限(灵敏度)可以达到0.1%，比欧盟转基因产品最低标识阈值(0.9%)高，且引物对RRS2扩增产物量、引物与模版结合效率都比其它引物对高。而定量PCR检测结果也显示RRS2引物能形成单峰型曲线，且峰值较高，即说明该引物对不仅特异性强，且PCR扩增效率较高，为转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测最适引物对。本文是在前人研究的基础上进行的进一步检测，筛选出的引物不仅适宜作为定性PCR检测引物，且还可以作为定量PCR检测引物，从而可为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考依据。

3材料与方法

3.1供试材料

转基因大豆GTS40－3－2标准品(BF410)，购自Fluka公司，转基因大豆MON89788、A2704、A5547－127和转基因玉米MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21等12种，由农业部科技发展中心提供。

3.2主要试剂与仪器

PCR反应试剂SYBR Premix Ex Taq、Ex Taq酶、dNTPs、buffer购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；100bp Ladder DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。Centrifuge5810R台式离心机(美国)，MLtrospec2100核酸蛋白分析仪(日本)，Mastercy cler EP PCR热循环仪(德国)，ABI公司3500定量PCR 仪(美国)，EPS301电泳仪(瑞典)，BIO-RAD公司凝胶成像系统(美国)。

3.3大豆种子DNA提取

根据NY/T674－2003/GB/T19495.3－2004规定，采用其标准方法从12个供试材料种子中提取基因组DNA，用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度和浓度，将GTS40－3－2的DNA溶液稀释到100ng/μL，4℃保存备用。

3.4PCR检测引物

查阅NCBI网站上GenBank数据库中相关的基因AJ308515、AJ308514和AB209952，再根据外源基因与大豆基因组之间的连接区域序列，利用Primer5.0引物设计软件分别设计5对转化体特异性检测引物，利用梯度PCR仪对5对引物进行筛选和优化。大豆内参照Lectin基因引物参照标准NY/T675－2003，所有的引物均由上海鼎新生物工程有限公司合成，其引物序列和扩增产物长度见表1。引物稀释成10μmol/L备用。

3.5PCR反应体系与程序

定性PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer (含Mg2+)2.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，引物5μmol/L各1μL，Ex Taq酶0.125μL，模板DNA (100ng)1μL，加灭菌双蒸水18.875μL。扩增程序：95℃5min；95℃30s，56~60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸7min后，4℃保存备用，电泳时加入6×Loading buffer1μL，取6μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。退火温度的优化是在PCR上设置50~60℃退火温度范围，取10个温度设置梯度，分别为50.2℃、50.7℃、51.6℃、52.7℃、54.0℃、55.4℃、56.8℃、58.1℃、59.2℃和60℃。

定量PCR反应体系：使用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供的荧光定量试剂盒，按照说明书进行反应。扩增条件：50℃2min；95℃10min；60℃40s；40个循环。熔解曲线温度范围为65.0~95.0℃，

基因

Gene

Lectin

RRS－1

RRS－2

RRS－3

RRS－4

RRS－5

引物(5'－3')

Primer(5'－3')

F:GCCCTCTACTCCACCCCCATCC

R:GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG

F:AACCCTTCAATTTAACCGATG

R:CTTTTTCCACGATGCTCCTC

F:GGGAACCCAAATGGAAAAGG

R:GGAAGGGTCTTGCGAAGGAT

F:GGTTTTTATGATTAGAGTCCCG

R:CGCAATTATACATTTAATACGCG

F:GGTTTTTATGATTAGAGTCCCG

R:CAGTAACAGCAGAGATCCCCA

F:ACCAGTGACCCTAATAGGCAA

R:GAGAAAATGGACGTGGAGAGA

产物

大小(bp)

Product

sides(bp)

118

279

238

470

490

257

表1大豆Lectin基因与GTS40－3－2转化体特异性引物及产物大小

Table1specific primers of soybean Lectin gene and GTS40－3－2 transformants and product sizes

转基因大豆GTS40－3－2转化事件特异性PCR检测

Specific PCR Validation of Transformation Event for Transgenic Soybean GTS40－3－2

1181

基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology

每间隔0.5℃读数一次，每次1s，连续记录荧光信号的变化，可以得到产物的Tm值。每对引物试样均做3个重复。

3.6产物序列测定

将5对不同的PCR引物所扩增的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，所得序列用DNAMAN6.0.40分析，并提交NCBI与其它物种转基因转化体的同源性方面与原来设计引物时所用的模板序列(AJ308515,AJ308514和AB209952所拼接序列)进行比对。

3.7GTS40－3－2转化体特异性PCR检测

以材料中的12种转基因品种为测试对象，用RRS1、RRS2、RRS3、RRS4和RRS55个引物对分别进行PCR扩增。电泳检测PCR产物并分析GTS40－3－2转化体特异性。

3.8GTS40－3－2转化体特异性PCR灵敏度检测

以提取的转基因大豆GTS40－3－2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品DNA为模板，PCR扩增初始模版浓度定为100mg/L，用RRS1、RRS2、RRS3、RRS4和RRS55个引物对分别进行PCR扩增，再对PCR产物进行电泳检测并分析GTS40－3－2转化体特异性。

参考文献

Berdal K.G.,and Holst-Jensen A.,2001,Roundup ready soybean event-specific rea1-time quantitative PCR assay and estima-tion of the practical detection and quantification limits in GMO analyses,European Food Researth and Technology, 213(6):432-438

Christer R.N.,Knut G.B.,and Arne H.J.,2004,Characterisation of the5'－integration site and development of an event-spe-cific real-time PCR assay for NK603maize from a low start-ing copy number,European Food Research and Technology, 219(4):421-427

Hernández M.,Esteve T.,Prat S.,and Pla M.,2004,Develop-ment of real-time PCR systems based on SYBR R Green I, Amplifluor TM and TaqMan R technologies for specific quan-titative detection of the transgenic maize event GA21,Jour-nal of Cereal Science,39(1):99-107

Hernández M.,Pla M.,Esteve T.,Prat S.,Puigdomènech P.,and Ferrando A.,2003,A specific real-time quantitative PCR de-tection system for event MON810in maize YieldGard based on the3'－transgene integration sequence,Transgenic Re-

search,12(2):179-189

Huang H.Y.,and Pan T.M.,2004,Detection of genetically modi-fied maize MON810and NK603by multiplex and real-time polymerase chain reation methods,Journal of Agrieuhural and Food Chemistry,52(11):3264-3268

James C.,ed.,2008,Global status of commercialized biotech/GM crops:2008,ISAAA Brief No.39.ISAAA,Ithaca,New York,pp.1-20

Li F.W.,Li C.C.,Dong L.M.,Xing Z.J.,and Zhang M.,2010,Es-tablishment of event-specific qualitative PCR method for transgenic soybean MON89788,Anhui Nongye Kexue(Jour-nal of Anhui Agricultural Sciences),38(13):6679-6682(李飞武,李葱葱,董立明,邢珍娟,张明,2010,转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测,安徽农业科学, 38(13):6679-6682)

Li F.W.,Li C.C.,Xing Z.J.,Li N.,Kang L.S.,Song X.Y.,Shao G.

G.,and Zhang M.,2009,Establishment of an event-specific

qualitative PCR method for detection of roundup Ready2 YieldTM,Dadou Kexue(Soybean Science),28(2):296-300 (李飞武,李葱葱,邢珍娟,刘娜,康岭生,宋新元,邵改革,张明,2009,第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究,大豆科学,28(2):296-300)

Pan A.H.,Yang L.T.,Xu S.C.,Yin C.S.,Zhang K.W.,Wang Z.Y., and Zhang D.B.,2006,Event-specific qualitative and quan-titative PCR detection of M0N863maize based upon the 3'－transgene integtation sequence,Journal of Cereal Sci-ence,43(2):250-257

Taverniers l.,Windels P.,Vaitilingom M.,Milcamps A.,Van Bockstaele E.,Van den Eede G.,and De Loose M.,2005, Event specific plasmid standards and real-time PCR meth-ods for transgenic Btl1,Bt176,and GA21maize and trans-genic GT73canola,Journal of Agricultural and Food Chem-istry,53(8):3041-3052

Wang H.B.,Chen P.H.,Chen R.K.,and Guo J.L.,2008,A high-throughput procedure for PCR-based detection of Roundup Ready soybean,Jiangxi Nongye Daxue Xuebao (Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensisi),30(4):633-637 (王恒波,陈平华,陈如凯,郭晋隆,2008,转基因大豆Roundup Ready的高通量PCR检测,江西农业大学学报, 30(4):633-637)

Xu J.S.,2004,Preparation of DNA microarray for the detection of primary product,Dissertation for Ph.D,Fujian Agricul-ture and Forestry University,Supervisor:Chen R.K.,and Zhang M.Q.,pp.1-120(徐景升,2004,转基因农产品检测基因芯片研制,博士学位论文,福建农林大学,导师:陈如凯,张木清,pp.1-120)

Yang L.T.,Xu S.C.,Pan A.H.,Yin C.S.,Zhang K.W.,Wang Z.Y., Zhou Z.G.,and Zhang D.B.,2005,Event-specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of ge-

1182

netically modifled MON863maize based on the5'－trans-gene integration sequenee,Joumal of Agricuhural and Food Chemistry,53(24):9312-9318

Yu Y.L.,Liang H.Z.,Wang S.F.,Lian Y.,Wei Y.L.,and Wang T.

F.,2010,Research progress and commercialization on trans-

genic soybean in China,Dadou Kexue(Soybean Science), 29(1):143-150(余永亮,梁慧珍,王树峰,练云,位艳丽,王庭峰,2010,中国转基因大豆的研究进展极其产业化,大豆科学,29(1):143-150)

Yuan L.,Sun H.W.,Yang C.L.,Shang Y.F.,Lu X.B.,and Zhao L.,

2010,Analysis of junction sequence in the transgenic maize MON88017and the method of qualitative PCR de-tection,Zuowu Xuebao(Acta Agronomica Sinca),36(2): 361-364(袁磊,孙红炜,杨崇良,尚佑芬,路兴波,赵蕾, 2010,转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR 检测,作物学报,36(2):361-364)

Zhong J.C.,Wu W.L.,and Xia Y.F.,2005,Overview of develop-ment of genetically modified soybean,Shengtai Jingji(Eco-logical Economy),(10):203-206(钟金传,吴文良,夏友富, 2005,全球转基因大豆发展概况,生态经济,(10):203-206)转基因大豆GTS40－3－2转化事件特异性PCR检测

Specific PCR Validation of Transformation Event for Transgenic Soybean GTS40－3－2

1183