常用大肠杆菌基础信息及使用说明

菌株目录

BL21 (2)

BL21(DE3) (4)

BL21(DE3)pLysS (6)

BL21 Star(DE3) (8)

BL21(AI) (10)

OverExpress C43(DE3) (13)

M15(pREP4) (15)

CopyCutter EPI400 (16)

Rosetta(DE3) (18)

XL10 (20)

Mach1-T1 (22)

DH5a (23)

TOP10 (24)

BL21

基因型

F- dcm omp T hsd S(r B- m B-) gal

产品说明

作为E.coli B宿主菌，主要用来进行蛋白表达，细胞内缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，能够有效避免目的蛋白的降解；当使用CE6噬菌体启动子时，BL21感受态细胞对目的蛋白在未诱导情况下的蛋白表达严密控制；用于非T7启动子驱动的基因表达，表达水平极高。

操作方法

1.BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced

control samples.

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

BL21(DE3)

基因型

F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm(DE3)

产品说明

BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，所以称为

BL21(DE3)。可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达107cfu/μg DNA。

操作方法

1.BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA （质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced control samples.

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).

IPTG

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2mM均可）。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

BL21(DE3)pLysS

基因型

F-omp T hsd S(r B-m B-) gal dcm(DE3)pLysS Cam r

产品说明

BL21(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)。BL21(DE3)pLysS 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。

操作方法

1. BL21(DE3)pLysS感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 μg/ml 氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1.Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2.Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3.Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4.Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

5.(Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced control samples.

6.Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7.Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8.Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9.Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素

Chloramphenicol 34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 μg/ml.

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

6. BL21(DE3)pLysS 菌株携带pLysS质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34 μg/ml氯霉素，以防质粒丢失。

BL21 Star(DE3)

基因型

F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm rne131 (DE3)

产品说明

BL21 Star(DE3)菌株源于BL21(DE3)菌株，含有rne131突变（RNaseE基因），RNaseE基因的突变降低了內源RNase的积累，增强菌株细胞内mRNA的稳定性，从而提高异源蛋白的表达水平。主要适用于T7启动子表达载体(如pET系列)的高水平蛋白表达，同时含有大肠杆菌RNA聚合酶，也可用于非T7启动子表达载体（pGEX，pMAL等）的蛋白表达。由于

BL21 Star(DE3)菌株的异源基因基础表达水平较高，所以不适合毒性蛋白的表达。BL21 Star(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达108cfu/μg DNA。

操作方法

1. BL21 Star(DE3) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be

better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2mM均可）。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

BL21(AI)

基因型

F-omp T hsd S B(r B-m B-) gal dcm ara B::T7RNAP-tet A

产品说明

BL21(AI)是大肠杆菌B/r型菌株(E.coli B/r)。BL21(AI) 来源于BL21菌株，为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解。在培养基中添加L-阿拉伯糖可诱导araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而促进目的蛋白的表达。在培养基中添加葡萄糖可抑制araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而抑制目的蛋白的表达。BL21(AI) 感受态细胞适用于任何以T7启动子为基础的表达载体，能够进行高水平的重组蛋白表达。因为菌株能够对体内的T7 RNA聚合酶水平进行高效调节，BL21(AI) 感受态细胞能够表达对其他BL21细胞有毒性或抑制生长的蛋白。普通重组蛋白在BL21(AI) 菌株中获得产量和其他BL21菌株产量相当；对大部分毒性蛋白，在

BL21(AI) 菌株中获得的产量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。BL21(AI) 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108cfu/μg DNA。

操作方法

1. BL21(AI)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA （质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm 复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含抗生素的2YT 或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意

1. Brian Caliendo (Voigt 实验室)报道过pCP20质粒比较难于转化到这个感受态细胞中，而pCP20转化到其他菌株中都很正常，但是菌体原因未知。

2. 不加葡萄糖，BL21(AI) 细胞的araBAD启动子下游的本底蛋白表达水平仍然很低，加入葡萄糖后能够进一步的降低本底蛋白的表达水平。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1. Pick 3-4 transformants for overnight culture in 5 mL LB medium containing antibiotic to select for your expression plasmid. Grow overnight at 37°C with shaking until the OD600 reaches 0.6-

1.0.

https://www.360docs.net/doc/7710622971.html,e the overnight cultures to inoculate fresh LB medium containing antibiotic to an OD600 of 0.05-0.1 (~1:20 dilution of the overnight culture). This dilution allows the cells to quickly return to logarithmic growth and reach the appropriate cell density. Use a volume appropriate for taking time points, if desired.

https://www.360docs.net/doc/7710622971.html,e the remainder of each overnight culture to create glycerol stocks. Once you have identified the clone that best expresses your protein, you can use the glycerol stock to perform additional expression experiments.

4.Grow the cultures until they reach mid-log phase (OD600 ~0.4; 2 to 3 hours).

5.Induce the cultures (see below), and culture for an additional 2-3 hours. You may also take time points to analyze for optimal expression of your protein.

For T7 expression vector containing the lacI gene (e.g. Invitrogen’s pET vectors), induce by adding L-arabinose to a final concentration of 0.2% AND IPTG to a final concentration of 1 mM.

For T7 expression vector with no lacI gene (e.g. Invitrogen’s pCR?T7 vectors), induce by adding L-arabinose to a final concentration of 0.2%. Culture for an additional 2-3 hours.

6.Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

7. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable). IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside / thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2mM均可）。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

建议选择该菌株进行蛋白表达的条件如下：

1. 使用T7启动子载体（高拷贝或者低拷贝都可以）进行蛋白表达。

2. 使用其他BL21菌株进行蛋白表达时，观察到明显的细菌生长的抑制作用。

3. 表达一个已知的毒性蛋白。

OverExpress C43(DE3)

基因型

F–omp T hsd S B (r B- m B-) gal dcm (DE3)

产品说明

OverExpress C43(DE3)、OverExpress C41(DE3)两个菌株均起源于BL21(DE3)，其优点是可以高效表达毒性蛋白或疏水性蛋白。OverExpress C41(DE3)跟BL21(DE3)的区别在于其基因组含有至少一个未知突变，这个未知突变使其获得了高效表达毒性蛋白(1-5)的能力，此突变位点参与大肠杆菌表达毒性蛋白时的细胞死亡途径；OverExpress C43(DE3)来源于OverExpress

C41(DE3)，是通过筛选OverExpress C41(DE3)对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株获得。OverExpress C43(DE3)菌株具有比OverExpress C41(DE3)更强的表达毒性蛋白和疏水性蛋白的能力，所以说OverExpress C43(DE3) 菌株与BL21(DE3)相比拥有至少两个未知突变，正是这两个未知突变使其获得了更广泛的表达毒性蛋白或疏水性蛋白的能力。此菌株含有DE3区，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。OverExpress C43(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达5×108 cfu/μg DNA。

操作方法

1. OverExpress C43(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化.

M15(pREP4)

基因型

M15[pREP4] derived from a strain K12

genotype: Nal s str s rif s thi- lac- ara- gal+ mtl- F- recA+ uvr+ ion+ [pREP4 KanR]

resistance: kanamycin

source: Qiagen

产品说明

抗性：Kan

培养基：LB

菌株类别：大肠杆菌

培养条件：37℃，有氧，LB

质粒转化：42℃热激

保存方式：20%甘油，-20℃

基本应用：pQE系列载体的蛋白表达

备注：IPTG诱导表达

M15菌株细胞含有包含反式lac 抑制子的pREP4质粒，保证高度调控的表达。M15[pREP4]菌株携带有阻抑质粒pREP4,该质粒高水平的表达lac抑制子,在IPTG诱导前反式抑制蛋白表达. 通过卡那霉素抗性筛选可以保持pREP4质粒在菌株中的稳定性。对M15使用LB，在37℃有氧的环境下培养，42℃热激处理可将质粒成功转入M15中，通常的情况下，使用IPTG可使菌株进行高效的蛋白表达。

CopyCutter EPI400

基因型

F–mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK λ– rpsL nupG tonA

ΔpcnB dhfr

产品说明

CopyCutter? EPI400? Chemically Competent E. coli* cells were developed to significantly lower the copy number of a wide variety of common vectors so that you can more readily clone unstable DNA sequences. Moreover, following a short incubation in the presence of the CopyCutter Induction Solution, you can subsequently raise copy number to improve plasmid yields without compromising stability.

The CopyCutter EPI400 cell line was derived from our high-transformation efficiency phage T1-resistant TransforMax? EC100? E. coli strain by manipulating a gene that controls the copy number of vectors containing ColE1 or pMB1 origins of replication (e.g., pUC and pET type vectors). This constitutively expressed gene, pcnB (plasmid copy number), was deleted from the TransforMax EC100 strain and replaced with a modified pcnB gene linked to an inducible promoter, creating the CopyCutter EPI400 strain.

Additional Benefits:

?High transformation efficiency with clones of all sizes.

?Supports blue/white screening of vectors.

?Restriction minus [mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)] for efficient cloning of methylated DNA. ?Endonuclease minus (endA1) to ensure high yields of plasmid clones.

?Recombination minus (recA1) to ensure the stability of large cloned inserts.

操作方法

Standard Transformation Procedure

1. Prepare 250 μl of SOC medium [Hanahan, D., (1983) J. Mol. Biol., 166, 557] for each transformation to be performed. Maintain the media at room temperature.

2. Heat a water bath or other temperature-controlled apparatus to 42°C.

3. Thaw the appropriate number of tubes of CopyCutter EPI400 Chemically Competent E. coli cells on ice. Mix by gentle tapping. Use the cells immediately.

4. Transfer 1-5 μl of DNA or ligation reaction into each tube. Cap the tubes a nd incubate on ice for 5-30 minutes.

5. Transfer the tubes to 42°C and heat shock for 30 seconds.

6. Transfer the cells back to ice and cool for 2 minutes.

7. Remove the cover of the tubes and add 250 μl of SOC Media.

8. Recover the cells by incubating at 37°C for 60 minutes with horizontal shaking (e.g. 225 rpm).

9. Plate the cells on the appropriate media and antibiotic, and grow overnight at 37°C.

Inducing CopyCutter EPI400 Clones to High Copy Number

1. To prepare inocula for the induction process, add 5 ml of LB + antibiotic to a 15 ml tube. Inoculate with an isolated colony or use 5-10 μl from Part C, Step 6. Shake overnight at 37°C.

2. The induction process can be done in any culture volume desired depending on user need. Dilute the overnight culture 1:10 and measure the OD600. Based on this reading, dilute the overnight culture to a final OD600 of 0.2 in LB + antibiotic + 1X CopyCutter Induction Solution. For example, if the undiluted overnight culture has an OD600 of 2.70 then add

3.7 ml of the overnight to 50 ml of LB + antibiotic + 1X CopyCutter Induction Solution.

3. Incubate at 37°C for 4 hours with vigorous shaking.

Important: Vigorous shaking is crucial for the best possible induction of copy number. Aeration of the induction cultures is critical. Therefore, to maximize the surface area of the culture solution in the tube, perform the induction in the largest volume tubes that reasonably meets your needs and resources. Induce clones to high copy number in a 5 ml cultures in at least 15 ml tubes, and 50 ml cultures in at least 125 ml flasks.

4. Isolate plasmid DNA from the induced culture by your method of choice.

Rosetta(DE3)

基因型

F-omp T hsd S B(r B-m B-) gal dcm(DE3)

pRARE(arg U, arg W, ilex, gly T, leu W, pro L) (Cam r)

产品说明

Rosetta(DE3)菌株具有氯霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。

操作方法

1. Rosetta(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT 或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference

only )

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is alsoacceptable).

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素

Chloramphenicol 34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 μg/ml.

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

XL10

基因型

Tet rΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F′proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (Tet r) Amy Cam r]

产品说明

XL10-Gold是目前转化效率最高的感受态细胞，由Stratagene开发的特异性用于大质粒或珍贵连接产物转化或构建文库的超级感受态细胞。XL10-Gold菌株为Hte(high transformation efficiency)基因型，Hte是Stratagene开发的特异性提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型，已成功应用于40kd质粒的构建。[Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173]赋予XL10-Gold缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性；Tet r，Cam r赋予菌株四环素和氯霉素抗性；lacI q ZΔM15的存在使XL10-Gold可用于蓝、白斑筛选。XL10-Gold感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>2×109 cfu/μg DNA。

常规操作方法

1. XL10-Gold感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA (质粒或连接产物) 并用手拨打EP管底轻轻混匀 (避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激35秒（非常重要——Efficiency decreases sharply when cells are heat-pulsed for <30 seconds or for >40 seconds.），迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Stratagene standard protocol

1. Pre-chill a 14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes on ice. Preheat NZY+ broth to 42℃.

联合站实时监控管理系统设计与实现

联合站实时监控管理系统设计与实现从2000年开始，孤岛采油厂先后建设完成了联合站三相分队计量系统及自动监控系统，在各个联合站实现了来液的分队自动计量和联合站生产流程的自动实时监控。在此基础上，进而有效的运用计算机软件和网络技术，构建分队计量及联合站信息综合应用平台，使生产现场的自动数据采集与后台的信息应用融为一体。《联合站实时监控管理系统》正是为满足这一生产需求而提出的。该系统充分利用采油厂网络、数据库资源，依托现场自动监控系统，在全厂范围内实现分队计量及自动监控生产数据资源的共享，建立基于Web的可视化信息平台。该系统建成后可以从整体上提高集输生产系统的管理水平，为采油厂领导、科研人员及各单位管理、技术人员提供查询、分析、决策等全方位的服务。系统背景和目的采油厂联合站生产主要包括如下几个环节：原油来液计量(对各采油队来液进行计量，分析出来液中油、水、气的含量) 、原油处理(通过一系列的流程将各队来液进行油、水、气的分离)、污水处理(将污水中的含油进行过滤、实污水含油降低到最低的水平)、原油外输。在建设计量及监控自动化系统之前，各个生产环节的工作主要由人工实行现场管理，难免出现误差和工作失误。自动化系统建成之后，整个联合站原油生产基本实现后台的管理和监控，联合站主要的生产环节都有相应的自动化设备实现了生产实时数据的动态采集与反馈，部分环节实现了后台自动化控制，从而提高了整个联合站生产的安全性、稳定性、科学性，为进一步构建软件系统平台，实现集输生产管理自动化打下基础。整个系统由：网络、数据库和相应的软件系统构架。系统不但可以使联合站实时生产信息的网上共享，而且实现了图形化的计算机后台管理与监控，以图形、曲线和报表等形式提供多功能生产信息的分析与查询，为决策、管理和科研服务。该系统会从以下几个方面达到为企业创新增效的目的：

大肠杆菌基因型及遗传符号说明系列一DXY

大肠杆菌基因型及遗传符号说明系列一点击次数：982 作者：佚名发表于：2009-09-27 00:00转载请注明来自丁香园来源：丁香园实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp,基因间的平均间隔为118bp （基因Ⅷ）。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型（Phenotype），把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec, et, al. 1966）：一、一般规则： 1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3个小写斜体字母来表示。例如：D NA Adenine Methylase→dam。 2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。例如：Recombination→recA、recB、recC。 3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE44（sup基因座E的44位突变）。

如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“ -”代替大写字母，如trp-31。 4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。 5、对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以F因子为例，F-:F因子缺失；F+:自主性F因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F':携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性F因子；Hfr:整合到染色体上的F因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）“或”/“等以区别。例如：/F' [traD3 6、proAB、lac I q、lacZ. M 15] 6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“ ”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为（lac-proAB）。 7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin抗性→Str +或Str r，Ampicilli n敏感性→ Amp-。（第一个字母要大写，“+”或“r”表示有抗性，“-”表示无抗性或敏感）。 8、根据某些特异性蛋白的变异及其导致的结果变化进行表示。例如：TH2菌株上有一种基因型表示如下：hsdS20 （rB-、mB-），其中S20代表特异性识别蛋白发生变异，（）中的rB-、mB-表示由于 S20的变异而导致B株来源的hsdR和hsdM的功能缺失。 9、蛋白质的名称与对应的基因或等位基因相同，但不用斜体，且首字母大写，如，UvrA、UvrB。二、基因符号和意义（见表1）

java基础知识

一.set,list 区别 List和Set都是接口。他们各自有自己的实现类，有无顺序的实现类，也有有顺序的实现类。最大的不同就是List是可以重复的。而Set是不能重复的。 List适合经常追加数据，插入，删除数据。但随即取数效率比较低。 Set适合经常地随即储存，插入，删除。但是在遍历时效率比较低。二.ArrayList与LinkedList区别。 List: 有顺序的，元素可以重复遍历：for 迭代排序：Comparable Comparator Collections.sort() ArrayList：底层用数组实现的List 特点：查询效率高，增删效率低轻量级线程不安全遍历： ArrayList al=new ArrayList(); al.add("winsun"); al.add("weixin"); al.add("mybole"); for(int i=0;i

软件架构设计说明书完整版

软件架构设计说明书 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

架构设计说明书版本1.0.0

1.引言 [对于由多个进程构成的复杂系统，系统设计阶段可以分为：架构设计（构架设计）、组件高层设计、组件详细设计。对于由单个进程构成的简单系统，系统设计阶段可以分为：系统概要设计、系统详细设计。本文档适用于由多个进程构成的复杂系统的构架设计。] [架构设计说明书是软件产品设计中最高层次的文档，它描述了系统最高层次上的逻辑结构、物理结构以及各种指南，相关组件（粒度最粗的子系统）的内部设计由组件高层设计提供。] [系统：指待开发产品的软件与硬件整体，其软件部分由各个子系统嵌套组成，子系统之间具有明确的接口；组件：指粒度最粗的子系统；模块：指组成组件的各层子系统，模块由下一层模块或函数组成；] [此文档的目的是： 1）描述产品的逻辑结构，定义系统各组件（子系统）之间的接口以及每个组件（子系统）应该实现的功能； 2）定义系统的各个进程以及进程之间的通信方式； 3）描述系统部署，说明用来部署并运行该系统的一种或多种物理网络（硬件）配置。对于每种配置，应该指出执行该系统的物理节点（计算机、网络设备）配置情况、节点之间的连接方式、采用何种通信协议、网络带宽。另外还要包括各进程到物理节点的映射； 4）系统的整体性能、安全性、可用性、可扩展性、异常与错误处理等非功能特性设计； 5）定义该产品的各个设计人员应该遵循的设计原则以及设计指南，各个编程人员应该遵循的编码规范。 ] [建议架构设计工程师与组件设计工程师共同完成此文档。] [架构设计说明书的引言应提供整个文档的概述。它应包括此文档的目的、范围、定义、首字母缩写词、缩略语、参考资料和概述。]

HSZ联合站工艺设计

HSZ联合站工艺设计 1.1课题的目的和意义联合站是转油站的一种。站内包括有原油处理系统，转油系统，原油稳定系统，污水处理系统，注水系统，天然气处理系统等它是油气集中处理联合作业站的简称。主要包括油气集中处理（原油脱水、天然气净化、原油稳定、轻烃回收等）、油田注水、污水处理、供变电和辅助生产设施等部分。联合站（库）是油田原油集输和处理的中枢。联合站（库）设有输油，脱水，污水处理，注水，化验，变电，锅炉等生产装置，主要作用是通过对原油的处理，达到三脱（原油脱水，脱盐，脱硫；天然气脱水，脱油；污水脱油）三回收（回收污油，污水，轻烃），出四种合格产品（天然气，净化油，净化污水，轻烃）以及进行商品原油的外输。联合站是油田油气集输过程中的重要生产环节，是集油气分离、原油脱水、原油计量、稳定外输、油田注水、污水处理、消防即热力系统等为一体的综合生产过程。目前我国大多数联合站的原油计量自动化水平还很低，还停留在人工手动状态，对物为、液量、压力和温度的过程参数都需要靠人工检测，人为误差大，严重影响生产效率及产品质量。针对联合站实际状况，以满足联合站原油外输计量生产要求，开发一套原油外输计量系统，能对生产现场实现原油计量高精度的远程集中化科学管理和实时在线监控、实现流程操作全自动化。联合站的研究具有重大的意义和前景。根据联合站的功能和规模，搞好优化设计，不断提高联合站设计水平、争取达到开发方案的优化、油田总体布局优化、工艺流程优化、自动控制系统优化、联合站总图优化、配套系统优化，以合理有效的利用石油能源，提高能源的开发率和利用率，使联合站能够安全高效的生产。 1.2国内外研究现状目前，我国各种规模的联合站中油水分离的控制过程大多数还采用手动或半自动控制防水。即一次仪表加手操器方式或根据经验来控制手动阀门的开启度。在这个环节上自动化程度很低，急待解决。而在发达国家，基本上实现了全自动控制，即脱水、加药、污水处理、平稳外输过程的全自动调节及控制。在这方面，我国处于落后状态的主要原因是传感器及调节仪表的性能质量均达不到要求，过去开发的一类型的自动控制系统无法使用等。近年来，随着各类先进控制产品的引入及操作人员的素质不断提高，采用先进的全自动控制系统来控制脱水过程已经实现，并在不断推广。