实验四.重组质粒载体的构建
重组质粒的构建经验 [技巧]
重组质粒的构建经验 [技巧] 重组质粒的构建经验~~~ 昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法 1.cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul ×2 模版 1 5‘引物 1 3‘引物 1 dNTP 1 10×buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2．PCR产物纯化 1、加5倍体积的PB 2、将Spin柱放于2ml收集管上 3、加样液，14Krpm，离心1min 4、弃去排出液 5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 3．双酶切 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）： 4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解 3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4.加样液，14Krpm，离心1min 5.弃去排出液 6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 7.弃去排出液,14Krpm,离心1min 8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 5．连接 上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下： 载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6．转化 取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。 7．菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将 细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版)
合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。 服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、
重组质粒的构建
重组质粒构建 生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切 为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。） 双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。） 二、连接反应 载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。 载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。 三、质粒转化到感受态大肠杆菌中 从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养
载体构建经验
做酶切要注意的问题 重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下： 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题 在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN 段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。 下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3
SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4 XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。 现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。 二、载体酶切的问题 1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。 2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DN段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和DN段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DN段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。 实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样
重组质粒的构建与转化
实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶
切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化
重组质粒的构建.
重组质粒的构建实验流程—质粒构建 基因提取—1、2、3 基因提取—1、2、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 DNA片段回收—5、3 DNA片段回收—5、3 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 测序 测序 重组质粒提取—2、 3 重组质粒提取—2、 3 菌种保藏—7 菌种保藏—7 目的片段与载体连接及转化—6 目的片段与载体连接及转化—6
实验操作 1、 LB培养基配置 LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。 【试剂】 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar） 【实验步骤】 1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）
胰蛋白胨（Tryptone） 1g 酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g NaCl 1g 琼脂（Agar） 1.5g 单蒸水 100ml 蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外， 称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或 在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药 品，瓶盖也不要盖错。 2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。 3、包扎 用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 4、灭菌 将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。 5、 LB固体培养基倒板 配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。 抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。 保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。 二、质粒的提取（protocol）
腺病毒载体的构建
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1 腺病毒载体的构建 由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。 4.1材料 4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株 脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。 4.1.2 主要试剂 限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。 4.2 试验方法 4.2.1 SOCS2基因克隆 4.2.1.1组织中总RNA提取
重组质粒构建(protocol)
重组质粒的构建（beta版） 一、引物设计: 1.选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。 2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。 1，使用word 2，设计引物：primer-up Primer-down 3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。引物长度约20个碱基。 4，核对----送公司合成。 5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。 二、PCR（P出目的片段）： （一）、PCR P出目的片段： 2,pcr: cDNA 1ul 10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5min dNTP 1ul ℃ 30sec F’-Primer 1ul ℃ 30sec R’-Primer 1ul ℃ X min PFU 0.5ul ℃ 5min dd2H2O 18ul （X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃） 3，跑胶、回收: （1），配胶： 0.6g 琼脂糖 60ml 1X TAE 0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)
25分钟后，即可点样跑胶。 （2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。 （3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩） 4，胶回收（胶回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。 对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。 三、酶切、链接： 1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活） insert (胶回收产物) 10ul 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 6ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 2，载体酶切：（1~2小时） Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug） 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 11ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 为方便以后使用，载体可以一次性多切点。 3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。 4，连接： 10x T4 Ligation Buffer 1ul Vector 1ul 10ul体系insert 3ul（2～3ul） T4 DNA Lignase 1ul dd2H2O 4ul 附：Ligation system DNA片段克隆到质粒载体上 载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA 和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量： [实例]: 载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体构建中常见问题及解决方法 重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。所涉及内容如下： 1)克隆基因的酶切位点问题 2)目的片段的扩增 3) 载体酶切的问题 4) 连接片段浓度比的问题 5）菌液的提取 6）酶切鉴定 7）表达鉴定 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释： 1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。 2．切割率：正确识别并酶切的效率 3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基 二目的片段的扩增 目的片段扩增失败的原因和可采取措施：
1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度； 2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度； 3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。 三载体酶切的问题 酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项： 1）酶切质粒浓度和纯度要好 2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切 四连接片段浓度比的问题 1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5； 2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率； 3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。 五菌液的提取及菌落PCR 挑菌时选择个头较大的单克隆，摇菌培养时间不宜过长。 为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以双蒸水为模板）。 出现的问题和可采取措施： 1）多次PCR均无阳性克隆存在：假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换培养皿； 2）阴性对照组也有条带：可能是因为引物或其他试剂被模板污染了，建议所有试剂全部换掉； 3）阳性对照也无条带：酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加，重
2020版腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书
A contract is generally a legal act of both parties and can only be established if the parties reach an agreement. Protect the legal rights of both parties after signing. （合同范本） 甲方：___________________ 乙方：___________________ 日期：___________________ 2020版腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书
2020版腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技 术服务合同书 说明：合同一般是双方的法律行为，只有双方当事人达成协议才能成立。签订合同后依法保护双方的合法权益，避免很多不必要的争议。可用作电子存档或实体印刷，使用时请详细阅读条款。 服务方（甲方）：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ e-mail：_________ 开户银行：_________ 帐号：_________委托方（乙方）：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ 甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的
原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买；2．合同总价_________元，（大写）_________。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。 3．保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的的研究。 4．所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、
如何构建载体
如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造
重组腺病毒构建,扩增及纯化基本技术操作
重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作
一目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例） 1. 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。 2. 重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。 3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。 4. 用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。 5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。 二共转化 1 大肠杆菌BJ5183电转感受态制备 2从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。 2接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4。 2迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。 2将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。 2以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。 2加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ ml (1.0 OD600约2.5×1010个细胞/ml)。分装，-80℃或液氮保存待用。 2 病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。 3 将1-5μl (约1μg) 线性化的穿梭质粒及1μl（约100ng/μl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40μl BJ5183 电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。 4 将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。 5 电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。 6 取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。 7 次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。 8 碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb）,及一条小片段（约3.0或4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本 确定为阳性克隆。 9 取1-5μl 阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue 菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增细菌并纯化质粒。 三重组病毒质粒转导293细胞 1 293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×106 293细胞于25cm2方瓶，使生长密度约50-70%。（也 可以使用6孔或96孔板） 2 以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm2方瓶约需4μgDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20 μl ddH2O 溶解。
重组质粒的构建与转化
姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者 科目分子生物学实验题目重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定学号 实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载 体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技 术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
一步法构建同源重组载体
一步法构建同源重组载体 王海艳 （中国农业大学） 同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体， 费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的 HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上， 现将实验过程及结果分享如下： 1. 目的片段引物的设计 用NEB builder（https://https://www.360docs.net/doc/7712838716.html,/watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genome compiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依 次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。 引物序列列表 Primers Seq Tm GC(%) Len Fragment dDNA-P1 attgggtaccgggccctctagATATACTCGACAGGGCCCGC 73.5 61 41 3'-flank dDNA-P2 gtcactgtacGTGTGGCATTGCCCAGTCA 64.3 55 29 dDNA-P3 aatgccacacGTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG 66.8 51 35 5’-flank dDNA-P4 atcggtgcTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG 65.7 59 29 dDNA-P5 atctccactcgaGCACCGATGTCGCCACGC 68.5 63 30 Marker fragment dDNA-P6 aagggaacaaaagctggagctGTAGTAGAGAACTTGGACTTCGGCG 70.8 50 46 2. 目的片段的扩增 反应体系 DNA(248ng/μL) 1 μL