文献检索与利用综述作业

文献检索与利用综述作业

生物技术1201

于凤川

1020512129

检索课题名称：代谢工程改造酿酒酵母合成青蒿素

一、检索目的：青蒿素（artemisine）是从中药黄花蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药。被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。但目前青蒿素的生物合成途径仍未清晰。

二、文献检索范围及检索策略

检索结果序号所检索数据库名称检索的数据库收录时间

（篇）

1 中国期刊全文数据库（CNKI）1994-现在12

2 中文科技期刊数据库（重庆维普）1989-现在12

3 中国学位论文全文数据库（万方）1977-现在15

4 Calis外文期刊网CCC- 3

检索词：

中文：1、酵母 2、青蒿素 3、代谢 4、生物合成 5、基因工程 6、中间体

英文：1、Yeast 2、artemisinin 3、metabolism 4、biosynthesis 5、genetic engineering 6、midbody

检索式：

中文：酵母*青蒿素*（生物合成+代谢）

（基因工程菌+酵母）*青蒿素*中间体

英文：（Yeast or genetic engineering ) and artemisinin

三、检索结果

1、

篇名：酵母中青蒿素作用靶点的探索

作者：黄倩; 周兵;

文献来源：清华大学学报(自然科学版), Journal of Tsinghua

University(Science and Technology), 编辑部邮箱 2008年 03期

摘要：为了验证前人提出的青蒿素在疟原虫中靶点蛋白的可信性并寻找其直接作用的靶点,用酵母作为模式生物,对候选靶点在酵母中的同源蛋白进行基因改造,研究其对青蒿素抑制作用的影响,并利用与琼脂糖偶联的二氢青蒿素(DHA)寻找与之特异性紧密结合的酵母蛋白。研究发现酵母中的同源蛋白似乎没有在青蒿素抑制中起关健作用;并且未找到能与DHA特异性紧密结合的酵母蛋白。结果表明:过去提出的青蒿素作用靶点可能不正确,并暗示青蒿素可能没有特异专一的蛋白靶点或同时作用于多个靶点。

2、

篇名：青蒿素生物合成研究进展

作者：静一; 罗安才;

文献来源：安徽农业科学, Journal of Anhui Agricultural Sciences, 编辑部邮箱 2010年 04期

摘要：综述了青蒿素生物合成途径及其关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶、法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐-4,11-二烯合酶、紫穗槐-4,11-二烯P450单加氧酶。3、

篇名：酵母代谢工程菌生产青蒿素中间体的研究

作者：孔建强、王丽娜、朱平、程克棣、王伟

文献来源：2008全国药用真菌学术研讨会论文集

摘要：青蒿素是重要的抗疟药物,紫穗槐-4,11-二烯是其中间体。本论文构建了两种能生产紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌:整合体型和质粒型.以朱栾倍

半萜为标准品,对这两种酿酒酵母的代谢产物进行GC-MS检测,发现都能产生紫穗槐-4,11-二烯,而且整合体型酵母工程菌紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于质粒型,达到117 mg·L-1朱栾倍半萜当量。

4、

篇名：基因工程酵母全合成青蒿素的策略

作者：曾丽香、冯丽玲、ZENG Li-xiang 、FENG Li-ling

文献来源：中外医学研究 2010 08(14)

摘要：目的构建青蒿细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)和青蒿醛△11(13)双键还原酶(DBR2)基因酵母表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.方法采用PCR扩增、片段连接表达载体、转化大肠杆菌、双酶切和序列分析鉴定重组子,并将CYP71AV1-DBR2双基因表达载体导入酵母菌中.结果分别获得1488 bp的CYP71AV1基因和1246 bp的DBR2基因,构建了重组子pESC-CYP-DBR2,测序结果与GenBank上已登录的相应基因序列吻合,将其导入酵母菌后,已检测到它们的表达.结论成功构建了青蒿素前体合成基因的酵母表达载体,为下一步培育青蒿素全合成酵母工程菌打下了基础。

5、

篇名：紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代谢工程研究进展

作者：孔建强; 黄勇; 沈君豪; 王伟; 程克棣; 朱平;

文献来源：药学学报, Acta Pharmaceutica Sinica, 编辑部邮箱 2009年 12

期

摘要：紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯,是青蒿素生物合成途径中的关键酶。本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述。紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆。紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全长1641bp,编码546aa。紫穗槐-4,11-二烯合酶最适pH范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高。在紫穗槐

-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先进行的是1,6-合环,然后是1,10-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯。由于紫穗槐-4,11-二烯合酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入E.coli、S.cereviseae、烟草、拟南芥和A.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法。

6、

篇名：酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究

作者：孔建强; 沈君豪; 黄勇; 王伟; 程克棣; 朱平;

文献来源：药学学报, Acta Pharmaceutica Sinica, 编辑部邮箱 2009年 11

期

摘要：构建了两种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌,其中附加体型工程菌W303-1B[pYeDP60/G/ADS]含有表达载体pYeDP60/G/ADS。整合体型工程菌W303-1B[rDNA:ADS]是将ADS基因的表达盒序列通过同源重组的方式整合到酿酒酵母W303-1B基因组中。GC-MS检测发酵产物,结果表明这两种工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,但附加体型工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于整合体型工程菌的产量。Southern杂交检测表明,ADS基因以单拷贝的形式整合到W303-1B基因组中,低于附加体型工程酵母中的ADS基因拷贝数。这些结果表明,ADS基因的拷贝数与酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量呈正相关。

7、

篇名：Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast(酵母工程菌生产抗疟药物青蒿素的前体青蒿酸)

作者：Ro, DK; Paradise, EM; Ouellet, M;

文献来源：Nature 440, 940-943 (13 April 2006)

摘要：Malaria is a global health problem that threatens 300–500 million people and kills more than one million people annually1. Disease control is hampered by the occurrence of multi-drug-resistant strains of the

malaria parasite Plasmodium falciparum2, 3. Synthetic antimalarial drugs and malarial vaccines are currently being developed, but their efficacy against malaria awaits rigorous clinical testing4, 5. Artemisinin, a sesquiterpene lactone endoperoxide extracted from Artemisia annua L (family Asteraceae; commonly known as sweet wormwood), is highly effective against multi-drug-resistant Plasmodium spp., but is in short supply and unaffordable to most malaria sufferers6. Although total synthesis of artemisinin is difficult and costly7, the semi-synthesis of artemisinin or any derivative from microbially sourced artemisinic acid, its immediate precursor, could be a cost-effective, environmentally friendly, high-quality and reliable source of artemisinin8, 9. Here we report the engineering of Saccharomyces cerevisiae to produce high titres (up to 100?mg?l-1) of artemisinic acid using an engineered mevalonate pathway, amorphadiene synthase, and a novel cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1) from A. annua that performs a three-step oxidation of amorpha-4,11-diene to artemisinic acid. The synthesized artemisinic acid is transported out and retained on the outside of the engineered yeast, meaning that a simple and inexpensive purification process can be used to obtain the desired product. Although the engineered yeast is already capable of producing artemisinic acid at a significantly higher specific productivity than A. annua, yield optimization and industrial scale-up will be required to raise artemisinic acid production to a level high enough to reduce artemisinin combination therapies to significantly below their current prices.

疟疾是一种全球性的健康问题，威胁到300–500000000人，造成一百万多人死亡疾病控制是由多重耐药菌株的疟疾寄生虫恶性疟原虫引起的。目前正在开发的合成抗疟药和疟疾疫苗，预防疟疾的疗效有待严格的临床鉴定。从黄花蒿中青蒿素.L提取的倍半萜内酯过氧化物（菊科；俗称青蒿），是非常有效的抗多药耐药疟原虫药物，但供不应求。虽然青蒿素的全合成很困难，但青蒿素的合成中间

体现在确实已经实现的。我们在这里报告工程酵母菌?使用一个精心设计的甲羟戊酸途径，紫穗槐二烯合成酶青蒿酸，和一种新的细胞色素P450单加氧酶

（cyp71av1）从青蒿执行三氧化紫穗槐-4,11-二烯为青蒿酸。这意味着一个简单的和廉价的净化过程可以用来获得所需的产品。虽然酵母工程已经能够生产青蒿酸，但产量优化和产业规模将需要提高将青蒿酸生产到足够高的水平，降低青蒿素联合疗法的成本价格。

8、

篇名：酵母工程菌制备抗疟药物青蒿素前体的研究

作者：孔建强、王伟、朱平、程克棣

文献来源：2008年生物产业技术研讨会论文集

摘要：克隆了青蒿素生物合成途径的酶基因:紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因,将这两个基因以及酵母的HMG-CoA还原酶基因,FPP合酶基因导入酿酒酵母WHT,构建分别能合成紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的酵母代谢工程菌.通过GC-MS,在紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌中检测到了紫穗槐

-4,11-二烯,产量达13.1688·L-1朱栾倍半萜当量；通过傅立叶回旋共振质谱,在青蒿酸酵母工程菌中检测到了青蒿酸。

9、

篇名：Yeast Model Uncovers Dual Roles of Mitochondria in the Action of Artemisinin（由酵母模型来揭示线粒体在青蒿素合成中的作用）

作者：Wei Li, Weike Mo, Dan Shen,Libo Sun, Juan Wang,Shan Lu, Jane M Gitschier, Bing Zhou

文献来源：PLOS GENETICS卷:1期

摘要：Artemisinins, derived from the wormwood herb Artemisia annua, are the most potent antimalarial drugs currently available. Despite extensive research, the exact mode of action of artemisinins has not been

established. Here we use yeast, Saccharamyces cerevisiae, to probe the core working mechanism of this class of antimalarial agents. We

demonstrate that artemisinin's inhibitory effect is mediated by

disrupting the normal function of mitochondria through depolarizing their membrane potential. Moreover, in a genetic study, we identify the electron transport chain as an important player in artemisinin's action: Deletion of NDE1 or NDI1, which encode mitochondrial NADH dehydrogenases, confers resistance to artemisinin, whereas overexpression

of NDE1 or NDI1 dramatically increases sensitivity to artemisinin. Mutations or environmental conditions that affect electron transport also alter host's sensitivity to artemisinin. Sensitivity is partially restored when the Plasmodium falciparum NDI1 ortholog is expressed in yeast ndi1 strain. Finally, we showed that artemisinin's inhibitory effect is mediated by reactive oxygen species. Our results demonstrate that artemisinin's effect is primarily mediated through disruption of membrane potential by its interaction with the electron transport chain, resulting in dysfunctional mitochondria. We propose a dual role of mitochondria played during the action of artemisinin: the electron transport chain stimulates artemisinin's effect, most likely by activating it, and the mitochondria are subsequently damaged by the locally generated free radicals.

青蒿素，来自青蒿，是目前可用的最有效的抗疟疾药物。尽管进行了广泛的研究，主要的作用的精确模式尚未建立。这里我们使用的酵母，酿酒酵母，探讨这类抗疟药物的核心工作机制。我们表明，青蒿素的抑制作用是通过破坏线粒体的正常功能，通过去极化膜电位介导。此外，在遗传研究中，我们确定的电子传递链中青蒿素的作用的一种重要的球员： NDE1 orndi1 缺失，其编码线粒体NADH脱氢酶，抵抗青蒿素，而过度的 NDE1 或 Ndi1 大大增加灵敏度的青蒿素。突变或影响电子传输也改变宿主的敏感性对青蒿素的环境条件。灵敏度是部分恢复时，Ndi1 恶性疟原虫基因在酵母中表达 Ndi1 应变。最后，我们表明，青蒿素的抑制作用介导的活性氧物种。我们的研究结果表明，青蒿素的作用主要是通过与电子传递链的相互作用介导的膜电位的中断，导致线粒体功能失调。我们提出了青蒿素的行动中发挥了双重作用：刺激线粒体电子传递链青蒿素的作用，最有可能

通过激活线粒体，并随后被本地产生的自由基。

四、综述

1、简要介绍检索到每篇文献的主要内容

文献1青蒿素的靶点蛋白一直没有定论，前人的研究提出了若干个可能的作用靶点，但并没有得到遗传学上的证据。在本研究中，利用酵母作为模式生物，通过遗传学的方法来验证已有的候选靶点对青蒿素敏感性的影响，并采用生物化学的方法寻找青蒿素的作用靶点。已有的候选靶点在酵母中都有同源物，然而，我们并没有看到它们作为青蒿素靶点的迹象。当然，青蒿素可能是通过多个靶点共同作用，所以其中一个基因的突变或过表达并不能对青蒿素的敏感性产生明显响。因此，本研究结果说明酵母中7个被测试过的候选靶点不是青蒿素在酵母中主要的或唯一的作用靶点。

文献2主要介绍了青蒿素的来源及发现，以及青蒿素的各种合成方法，如化学合成法，生物合成法及其他方法。探讨了青蒿素生物合成的各种途径，还列举了各种实验现象及结果来证明不同的说法。文章最后表明了对生物合成青蒿素的强烈的信心及支持。

文献3介绍利用代谢工程，将来源于不同生物的基因组合到酵母中，在酵母中重新构建一条青蓠素中间体生物合成途径在未来有望成为这样的方法。本试验通过努力，获得了能生产紫穗槐-4，11-二烯的酵母工程菌。结果表明，整合型酵母工程菌的紫穗槐-4，11-二烯产量明显高于质粒型酵母工程菌。其中，整合型酵母工程菌的紫穗槐-4，11-二烯产量达到117 mg·L．1朱栾倍半萜当量。ADS基因被整合到了基因上，这是一个多拷贝位点，因此，随着ADS基因拷贝数的增加，整合体型AD工程菌的产量也上升了，甚至于超过了质粒型酵母工程菌。实验证明，提高基因的拷贝数能有效地增加紫穗槐一4，1 1-二烯代谢工程菌中目的产物的产量。

文献4，到目前为止，还没有任何一种基因工程微生物能全合成青蒿素。实验在大肠杆菌中成功表达紫穗槐二烯合酶基因并合成紫穗槐二烯的基础上，拟从青蒿中克隆CPY71AVI和DBR2基因，并插入酵母菌表达载体，导入携带ADS基因的酵

母工程菌中，以便将前期已合成的紫穗槐二烯转变成青蒿醛以及将青蒿醛转变成双氢青蒿醛，为下一步培育青蒿素全合成酵母工程菌打下基础。

文献5介绍了紫穗槐-4, 11-二烯合酶及其编码基因的发现历史，紫穗槐-4, 11-二烯合酶编码基因的特点，紫穗槐-4, 11-二烯合酶特点，紫穗槐-4,11-二烯合酶基因成功克隆的策略和紫穗槐-4,11-二烯合酶作用机制以及紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的代谢工程研究

文献6介绍了一种多拷贝外源基因同源重组的方法。为获得高产紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的工业用酵母工程菌奠定了基础。可以利用该工程菌更便利地进行条件优化。ADS 基因整合到酵母基因组, 使酿酒酵母获得了生产紫穗槐-4,11-二烯的性质, 从而克服了外源质粒不稳定的性质。随着外源基因在酿酒酵母中拷贝数的提高, 基因同源序列之间的相互作用会导致外源基因“反式失活”。因此, 怎样解决目的产物增量和外源基因沉默之间的矛盾将是构建高效青蒿酸前体酵母工程菌的关键之一。

文献7本实验构建的紫穗槐一4，1卜二烯酵母工程菌中，导入了三个基因：HMG-CoA还原酶基因，FPP合酶基因和紫穗槐-4，1 1-：烯合酶基因。通过紫穗槐一4，11一二烯合酶的作用，能将麦角固醇代谢途径中的FPP催化形成紫穗槐-4，11--烯。为了提高进入紫穗槐一4，11一二烯代谢流中的FPP的供应，

将萜类合成途径中的限速酶基因HMG．CoA还原酶基因和FPP合酶基因导入了酵母，提高这两个酶基因在酵母中的拷贝数，增加FPP的供应，提高紫穗槐一4，1l一二烯的产量。在青蒿酸代谢工程菌中，除了导入这三个基因之外，还导入紫穗槐-4，Ii---烯氧化酶基因，该基因能连续催化紫穗槐一4，1l一二烯生成青蒿醇，青蒿醛和青蒿酸。

文献8介绍了在本实验中，我们从酵母克隆出HMG—CoA还原酶(3-hydroxy一3一methylglutaryl—coenzymeAreductase，HMGR)和FPP合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPPS)基因：从青蒿中克隆出了紫穗槐一4，11一二烯合酶基因及紫穗槐-4，11----烯氧化酶基因。将这四个青蒿酸合成所必要的酶基因导入酵母中．通过在酵母中重构一条青蒿酸的合成途径，利用酿酒酵母自身合成萜类的前体FPP，通过代谢工程制备出了青蒿素前体紫穗槐一4，11一二烯和

青蒿酸

文献9介绍实验使用酿酒酵母，探讨这类抗疟药物的核心工作机制。我们表明，青蒿素的抑制作用是通过破坏线粒体的正常功能，通过去极化膜电位介导。此外，在遗传研究中，确定的电子传递链中青蒿素的作用的一种重要的球员： NDE1 orndi1 缺失，其编码线粒体NADH脱氢酶，抵抗青蒿素，而过度的 NDE1 或 Ndi1 大大增加灵敏度的青蒿素。突变或影响电子传输也改变宿主的敏感性对青蒿素的环境条件。灵敏度是部分恢复时，Ndi1 恶性疟原虫基因在酵母中表达 Ndi1 应变。最后，实验表明，青蒿素的抑制作用介导的活性氧物种。我们的研究结果表明，青蒿素的作用主要是通过与电子传递链的相互作用介导的膜电位的中断，导致线粒体功能失调。我们提出了青蒿素的行动中发挥了双重作用：刺激线粒体电子传递链青蒿素的作用，最有可能通过激活线粒体，并随后被本地产生的自由基。

2、综合以上文献，介绍该课题的意义、国内外研究现状和研究发展趋势。

（1）该课题研究的意义

青蒿素（artemisine）是从中药黄花蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药。

青蒿素对多种疾病具有治疗作用。药理学研究表明青蒿素对疟原虫红细胞内期有直接杀灭作用，对组织期无效，在机体内吸收快，分布广，排泄快。主要用于间日疟、恶性疟的症状控制，以及耐氯喹虫株的治疗，也可用以治疗凶险型恶性疟，如脑型、黄疸型等。亦可用以治疗系统性红斑狼疮与盘状红斑狼疮。

青蒿素生物合成属于异戊二烯代谢途径的倍半萜分支途径，萜类家族化合是植物体内一大类天然产物，其商业价值很高，例如很多的香料、香气以及一些抗癌都属于此类。青蒿素就是属于此类。由于目前化学合成青蒿素成本较高且污染浪费较大，所以一般是从植物中提取青蒿素。现在，人们又把研究的目光转向微生物发酵合成青霉素。

（2）目前国内外研究现状

中国抗疟新药的研究源于1967年成立的五二三项目，其全称为中国疟疾研究协作项目，成立于1967年的5月23日,因绝密军事项目,遂设代号523。

历经380多次鼠疟筛选，1971年10月取得中药青蒿素筛选的成功。1972年从中药青蒿中分离得到抗疟有效单体，命名为青蒿素，对鼠疟、猴疟的原虫抑制率达到100%。

1973年经临床研究取得与实验室一致的结果、抗疟新药青蒿素由此诞生。

1981年10月在北京召开的由世界卫生组织主办的“青蒿素”国际会议上，中国《青蒿素的化学研究》的发言，引起与会代表极大的兴趣，并认为“这一新的发现更重要的意义是在于将为进一步设计合成新药指出方向”。

1986年，青蒿素获得新一类新药证书，双氢青蒿素也获一类新药证书。这些成果分别获得国家发明奖和全国十大科技成就奖。

2011年9月，中国女药学家屠呦呦因创制新型抗疟药———青蒿素和双氢青蒿素的贡献，获得被誉为诺贝尔奖“风向标”的拉斯克奖。这是中国生物医学界迄今为止获得的世界级最高级大奖。

近年来，青蒿素生产发展迅速，通过微生物发酵生产青蒿素前体已接近工业化规模,但目前还不能实现青蒿素在微生物体内的全合成。国外拟采取“两步法”策略半合成青蒿素: 第一步是在微生物中获得青蒿素前体, 第二步是利用化学方法将青蒿素前体转变成青蒿素。一旦成功产业化必将带来青蒿素生产方式的彻底变革, 也是缓解日益严重的青蒿素短缺局面的根本出路。

国外利用酵母工程菌生物合成青蒿酸及化学半合成青蒿素的生产工艺已经基本成型，而我国尚未育成类似的青蒿酸生物合成工程菌，即使拥有青蒿酸化学半合成青蒿素技术，也暂时无法派上用场。另一方面，鉴于生物转化效率高、成本低、污染少等优势，可以尝试用生物转化法替代化学转化法，即通过单线态氧发生酵母菌与双氢青蒿酸提取液混合发酵的方法进行青蒿素的生物半合成，将提取青蒿素后剩余的双氢青蒿酸转化为青蒿素。然而，国内外目前还没有建立双氢青蒿酸合成青蒿素的生物转化技术。

（3）该课题研究发展趋势

目前国内外还没有一个研究小组将酵母工程菌中的青蒿素前体转变成青蒿素, 其原因可能是酵母不具备青蒿素合成所需要的细胞环境。酵母工程菌中未检测到青蒿素的原因可能有两个：一是酿酒酵母中单线态氧缺乏，双氢青蒿酸合成后不

能转变成青蒿素；二是青蒿素未被油相环境隔离而与细胞成分（如血红素）发生烷基化反应，无法检测到青蒿素。

这里面临着一个策略选择, 即在微生物中合成青蒿素前体后是改用化学方法半合成青蒿素, 还是继续探索让微生物将青蒿素前体转变成青蒿素的方法? 现在看来, 国外选择的是前者, 并且已先期启动产业化进程.。不过, 从工艺、成本、环境影响等方面考虑, 实现青蒿素的微生物全合成无疑有着更大的应用价值。

（4）参考文献

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［5］青蒿素结构研究协作组. 一种新型的倍半萜内脂———青蒿素［J］. 科学通报，1977(3):142.

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数对紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌产量的影响［J］. 药学学报，2007，

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