分子生物学

1.给你一管核酸，你可用什么方法区别它是DNA或RNA？

答：（1）溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。（2）利用Southernblotting及Northernblotting杂交法区分DNA和RNA。DNA分子可以与硝酸纤维素滤膜结合，通过特异性探针检测DNA片段的存在。而RNA分子不能与硝酸纤维素滤膜结合，而是将RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使他们结合在一起。所以通过不同的杂交方法可以鉴别DNA和RNA。（3）沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度从达到小依次为：RNA；超螺旋DNA>解链环状DNA；松弛环状DNA；线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。（4）利用RNase与DNase水解鉴定DNA和RNA。RNase能水解RNA片段，而不水解DNA片段；而DNase只能水解DNA而不能水解RNA，这样通过水解的程度与与否可鉴别DNA和RNA。（5）显色反应：鉴别DNA和RNA，加入浓盐酸，RNA→绿色化合物，DNA→蓝紫色化合物苔黑酚。

2．假设你从细菌B(非大肠杆菌)中分离到一个质粒，命名为pBX，大小约8kb，DNA序列未知。请你设计实验，克隆和鉴定该质粒的RNA的功能复制原点(replicationorigin,ori)。答：用相同的限制性内切酶分别酶切质粒DNA和具有抗生素抗性基因的质粒DNA,选择DNA 片段与质粒DNA连接后，转换缺乏Amp抗性基因的受体菌，接种于含有Amp的培养基中，选择能正常生长的菌落，即可克隆到该质粒的复制起点的DNA片段。因为只有同时具有ori 和Amp抗性重组DNA的菌落才能在含有氨苄青霉素的培养基中正常繁殖。

3．请设计实验证明某基因存在内含子。

答：内含子的鉴定是通过所谓的“berk-sharp“制图法又称S1核酸制图法来实现的，其原理是：利用S1核酸酶的单链特异性，核酸酶Ⅶ的单链外切特异性，以及稀碱溶液能分解RNA 的特性，来对杂交分子做不同的处理以得到外显子的长度。内含子的长度以及基因的总长度。具体操作：首先将DNA进行转录，制备mRNA，然后将DAN与mRNA分子进行杂交，对杂交分子做不同的处理。一份杂交分子用S1酶处理，核酶能降解所有的单链区，留下一个有缺口的DNA与mRNA杂交双链分子，如果直接走电泳，可以得到一个带，相当于外显子连接起来的长度;如果经碱溶液处理在走电泳，则得到多条带，为外显子带。另外一份杂交分子用外

切核酸酶Ⅶ处理，去除两端没杂交的DNA，在用碱溶液处理，去除RNA，走电泳得到一条带为外显子及其之间的内含子的总长度。从而鉴定内含子。

4．已知蛋白质P（由基因p编码，序列已知）可以在某动物传代细胞C（该细胞可在体外培养和传代）中激活基因g（序列已知）的转录，即P是基因g的一个转录因子，请你设计实验，确定基因g上游的转录因子P的调控区，并进行验证。

答：转录因子与特异的调控序列相结合有利于转录的起始，凝胶阻滞技术可以显示出标记核酸结合pro的阻滞效果，并可被用来检测与调控序列相结合的转录因子，将一段短的标记核酸（转录起始点上游区域）与蛋白质P混合后，并与对照样品一起进行电泳分析，标记分子与蛋白因子特异结合产生DNA蛋白质复合物，经放射性自显影在凝胶上做迁移带。DNAseⅠ足迹法：用末端标记的DNA片段与蛋白质样品相混合，待相互结合后，用DNAseⅠ对复合物进行温和酶解，将酶解的DNA进行PAGE电泳分析，与蛋白质结合的DNA被酶切割，泳道中出现某些带的空缺。

5．如何用分子生物学技术区分“同卵双胞胎”与“来自同一供体的克隆动物”？

答：用来鉴定个体与其家族的亲缘关系的DNA指纹技术的基础就是小卫星DNA的重复序列在某些卫星DNA序列的排列中拷贝数高度可变的，这在不同个体中的变异极大，这种多变异体现了基因的多态性，通过限制性内切酶，Southern印迹和杂交，可以确定基因组中几个不同卫星DNA排列组中的DNA的精确长度，进而可以鉴别一个特定个体，也就是说另一个个体（除了双胞胎或同一克隆）具有同样一套同样的排列长度的概率是极其微小的，而双胞胎或同一克隆具有同样一套排列长度，这种排列是从双亲那里各得一半，亲缘关系可以通过比较不同个体间的长度来确定。

6．你用什么方法可以证明某基因与野生型基因相比存在缺失突变?

答：可以用RFLP分析法：即限制性内切片段长度的多态性。限制性内切酶可以识别基因组内某些特定的DNA序列，并在此处催化裂解，产生一系列大小不等的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上，用标记过的特异性探针进行杂交，通过放射自显影检测特定的DNA片段之间的差异性。特定识别序列碱基的改变而造成的酶切位点的改变，从而检测到是否有缺失突变。

7．λ噬菌体的基因组里没有抗生素抗性的选择标记基因，因此作为基因工程的载体主要根据噬菌斑的形态学特征来选择转化子。请说明将外源基因插入到cI基因内的λ噬菌体转化hfl-寄主细胞后，如何选择转化子，为什么？

答：CI基因被插入外源基因的突变体，失去了建立和维持溶原的阻遏蛋白，HFL基因编码能降解CI基因的正控制调节蛋白CII的酶类，表现不易建立溶原，hfl-突变体表现高频溶原特点，在aa饥饿的培养条件下，转化子表现为不能建立溶原，而对照表现为高频溶原。

8．什么是Insulator? 它与silencer和Enhancer在结构与功能上有什么不同?

答：Insulator：位于silencer或Enhancer与结构基因之间的一段特殊结构的DNA分子，从而阻止Enhanser对结构基因的增强表达，或阻止异染色质化延伸到结构基因Silencer：通过自身DNA序列异染色质化的延伸，使与其毗连的结构基因的表达关闭。Enhancer：与正控制调节蛋白的结合后，可以启动其下游或上游基因的高效表达。

9．论述“将一切生物学问题还原到DNA水平的同时，人类必将用整体的、综合的观点去思考生物学”这一学科发展态势的看法。

答：传统生物学主要基于还原论的研究，通过实验的方法解决问题。传统生物学家通过直接的观察与实验收集数据，试图在纷繁复杂的生命世界中寻找规律。10多年来，基因组计划的实施使这一研究达到了高潮。越来越多的生物，如支原体、大肠杆菌、线虫、果蝇、人的完整DNA序列得以测定，功能基因组学，蛋白质组学研究正试图揭示这些基因的功能，寻找与生命现象的联系。生物学研究正将生命现象逐步建立在分子基础之上。基于坚实的理论基础来描述诸如遗传、发育、免疫、进化等生命现象也因此成为可能。然而，生物体是一个复杂系统，它不仅仅是基因与蛋白质的集合，系统特性也不能仅仅通过勾画其相互联系而获得完全理解。生命所具有的性质往往涌现于整体而不是各个分离的部分。毫无疑义，这要求我们从系统水平来理解生物学系统。作为生物学研究的新领域，其对生物系统的研究专注于系统水平，而不是细胞或生物体中各个孤立的部分。目前，各部分之间的相互关系正越来越得到重视。功能基因组学、蛋白质组学正开始探索基因之间、蛋白质之间、基因与蛋白质之间的相互作用。细胞层次的研究则开始揭示代谢网络、信号转导网络、基因调控网络的结构与功能。

10．提取两份等量的母鸡输卵管细胞的mRNA,一份反转录成cDNA后变性成单链cDNA,再与另一份mRNA进行液相分子杂交(提示:类似复性动力学反应)。mRNA的初始浓度为R0,形成异源双链(RNA/cDNA)的时间为t,异源双链形成速率的度量值为Rot(1/2)。

图示结果表明;异源双链形成的过程可明显分为三部分,速率最快的第一部分占总RNA分子的50%,Rot(1/2)=0.0015,速率中等的第二部分占15%,Rot(1/2)=0.04,速率最慢的第三部分占35%,Rot(1/2)=30，请根据这一结果,分析在鸡输卵管细胞内高拷贝数表达的,中等拷贝数表达的,低拷贝数表达的基因种类数,以及每一类型基因表达的拷贝数。

提示:每一种mRNA以2000碱基计算,即类似复性动力学研究中的单一核苷酸排列的K.C值;其Rot(1/2)=0.0008;

任何一种mRNA的K.C值:2000=这类mRNA的Rot(1/2):0.0008;

每一个输卵管细胞的mRNA总量为0.275picogram(0.965×109bp/pg)

答：

1th 2ed 3rd

校正R0t(1/2) 0.00075 0.0061 0.5

K.C 2,000 15,000 26,000,000

mRNA种类17-813,000

1thmRNA

(0.275*0.965*109bp*2*0.5)/2000=130,000copies(ovalbumingene)

2edmRNA

(0.275*0.965*109bp*2*0.15)/15,000=5,000copies

3rdmRNA

(0.275*0.965*109bp*2*0.35)/26,000,000=7copies

11．回答下列关于λ噬菌体发育现象的分子生物学原理。

(1).λ噬菌体侵染大肠杆菌后,首先会选择裂解途径。

(2).将λ涂布于大肠杆菌的培养皿中,会产生溶原状态的菌落和裂解状态的噬菌斑。

(3).具有λ溶原状态的大肠杆菌对再次侵染的λ噬菌体表现免疫性(或排他性)。

答：（1）a，从适应角度来看，这是生物进化的需要；

b，当λ噬菌体侵染大肠杆菌后，大肠杆菌中的RNApol就结合到λ噬菌体的P R启动子上，转录表达CRO-P和CII-P，而CRO-P能与OR3区域特异高效的

亲和，从而关闭了P RM的启动，使建立溶原的CI-P不能表达，使大肠杆菌进

入裂解途径；

c，CII-P能够正调控P RE，使λ噬菌体进入溶原状态，而大肠杆菌上具有HFL 基因，该基因正常表达的蛋白HFL-P能够降解CII-P，促使λ噬菌体选择

裂解途径。

（2）将λ噬菌体涂布于大肠杆菌的培养皿中，λ噬菌体高频侵染大肠杆菌。使CII-P 积累，而CII-P能够正调控强启动子P RE，P RE能够转录表达CI-P，同时转录CRO

基因的反义RNA，抑制CRO基因的表达；CI-P又能与OR1区域特异高效的结合，

使P R不能继续转录CRO-P，从而进入溶原。

（3）具有λ溶原状态的大肠杆菌中积累有大量的CI-P，当再有λ噬菌体侵染时，CI-P会直接结合于OR1区域，从而阻止了RNApol与P R结合，不能启动CRO-P

的表达，使这些λ噬菌体不能进入裂解状态，从而体现出大肠杆菌的免疫性。

12．请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的？

答：首先让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中连续培养12代，使所有的DNA 都被标记上15N，15NDNA的密度比普通14NDNA的密度大，在氯化铯（CSCl）密度

梯度离心时，这两种DNA形式位于不同的区带，如果将所有15N标记的大肠杆菌转

移到普通培养基中（含有14N的培养基）经过一代之后，所有DNA的密度都介于

15NDNA和14NDNA之间，即所有15N-14N杂合分子，两代后14N和15N-14N杂交分

子等量出现，若再继续培养，可以看到14NDNA增多，而当把15N-14N杂合分子加

热变性时，它们分开成15N链和14N链，这就充分证明了，在DNA复制时原来的

DNA分子可被分成两个亚单位，分别构成子代分子的一半，这些亚单位经过许多代

复制，仍然保持着完整性。

13．请设计一个实验确定某基因的启动子区？

答：足迹法：RNA聚合酶结合于DNA，然后加入DNA内切酶、核酸酶将大部分DNA都降解成单核甘酸或者二核苷酸，而被RNA聚合酶覆盖的部分则保留下来，然后终止

DNAase的作用，出去RNA聚合酶，即可分离到被保护的DNA片段，这种片段一般

为40bp左右。脚印法：将结合有RNA聚合酶的DNA用限制酶切割，得到一个共同

的端点，再将端点的一条链用放射性标记，用微量的DNAaseⅠ部分水解酶——DNA

复合物，在不受RNA聚合酶覆盖的区域，每个磷酸二酯键都可能遭到DNAaseⅠ的

进攻，但同一个分子上只有少量（1～2个）切点，将所得片段经过碱变性电泳和

放射自显影，就可以知道RNA聚合酶在标记上覆盖的大小，并可以确定DNA序列。

14．设计研究未知基因（预测两个跨膜区域）功能的实验方案（不低于4个）。

答：研究一个未知基因的功能要采用正向遗传学和反向遗传学相结合的办法来实现。

首先要通过正向遗传学，找到这个基因的定位、知道这个基因的序列等。然后通过

反向遗传学，定点突变此基因，研究表型的变化，并通过移除或加入此基因研究失

去或获得的性状，研究此基因的功能。

（1）查查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内有没有已经被证明功能的，或者猜想与什么功能有关的。

（2）寻找突变体（该基因缺失的个体）或者设计序列沉默该基因，然后观察其表型和正常个体有什么差别。

（3）寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为一个参考。

这些知识给我们以后的研究提供思路，最后我们要克隆得到该基因，在一个该基

因缺失的突变体（株）内表达该基因，如果在该个体内检测到表达并且该个体和

一般个体性状差异消失，那么证明该个体是控制此性状的基因（之一）。

15．质粒改造原则。

答：（1）构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。为此，构建的质粒克隆

载体必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori），最好是松

弛型质粒的复制起始位点。

（2）构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并且这样的克隆位点应尽可能多。作为克隆位点的限制性核酸内切酶的识别序列一般在质粒克

隆载体上只有一个。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体往往

组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。

（3）构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。当外源

DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。常用的选

择标记基因，主要有根据克隆子抗药性提高进行筛选的Apr或Ampr、Cmr或

Cmpr、Kmr或Karnr、Smr或Strr、Tcr或Tetr等抗性基因；有根据克隆子蓝

白颜色进行筛选的lacZ'基因。

（4）构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能的小。由于质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质粒的转化效率高，大于15kb的质粒转化效率

明显下降。质粒克隆载体DNA分子小，意味着可承载较大的外源DNA片段。

（5）据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片段），构建成不同用途的质粒克隆载体。如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相

应的终止子，成为强表达质粒克隆载体；或者在质粒克隆载体的合适位置组入受

体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。

16．设计一个实验证明某基因存在选择性剪切？

答：对内含子和外显子进行选择性剪接的方式称为选择性剪切。我们可以用northernblot的方式检测选择性剪切是否存在：用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，然后将分离的RNA转膜到纤维素膜上，在液相中与标记的核酸探针杂交，经过放射自显影以后，如果检测到一条带，那么没有选择性剪切，如果有两条或者多条，那么存在选择性剪切。

17．举出2-3种基因组测序或功能基因组研究的策略，并加以说明？

答：（1）Sanger双脱氧核苷酸终止法原理：利用3DNA聚合酶所具有的两种催化反应特性：第一，DNA聚合酶能以单链DNA为模板，准确合成出DNA的互补链。第二，DNA聚合酶能以2’，3’―双脱氧核苷三磷酸为底物，使之参入到寡核苷酸链的3’末端，从而终止DNA 链的延长。当2’，3’双脱氧胸腺嘧啶dTTP，参入到延长的寡核苷酸链末端，取代3’脱氧胸腺嘧啶dTTP之后，由ddTTP没有3’—OH，所以寡核苷酸链不能继续延长（终止3链的合成），于是在本该由dTTP参入的位置上发生特异的链终止效应。如果在同一反应试

管中，同时加入一种DNA合成的引物和模板，DNA聚合酶，ddTTP，dTTP以及其他三种脱氧核苷二磷酸（dAP，dGTP，dCTP），而其中有一种是带32P放射性标记的，那么经过适当的温育之后，使会产生不同长度的ＤＮＡ片段混合物，他们都具有同样的5’－末端，并在3’末端ddTTP处终止。将这种混合物加到变性凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全部以3’末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。使用相应于其他核苷酸的抑制物，如ddATP，ddGTP，和ddCTP，并分别在不同反应试管温育，然后连同第一个ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上进行电泳分离-----放射自显影。（2）焦磷酸测序法原理它是4种酶催化的同一反应体系中的酶吸联化学发光反应。原理：引物与模板DNA 退火以后，在DNA磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放欧联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列目的，反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成，反应底物为5’—磷酰硫酸和荧光素。

18．浅谈你对表观遗传的认识及理解。

答：（1）表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。（2）表观遗传学的现象很多，已知的有DNA甲基化，基因组印（genomicimprinting）和RNA编辑（RNAediting）、基因沉默、核仁显性和休眠转座子激活等。（3）表观遗传改变从以下3个层面上调控基因的表达：①DNA 修饰：DNA共价结合一个修饰基团，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态；②蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因表达的调控；③非编码RNA 的调控：RNA可通过某些机制实现对基因转录的调控以及对基因转录后的调控，如RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。（4）表观遗传学研究包括染色质重塑、DNA甲基化、X染色体失活，非编码RNA调控4个方面，任何一方面的异常都将影响染色质结构和基因表达，导致复杂综合征、多因素疾病以及癌症。和DNA的改变所不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的。

19．大肠杆菌染色体的分子质量大约是2.5×109Da，核苷酸的平均分子质量是330Da，两个邻近核苷酸对之间的距离是0.34nm，双螺旋每一转的高度（即螺距）是3.4nm，请问：

（1）该分子有多长？

答：1碱基=330Da，1碱基对=660Da

碱基对=2.5×109/660=3.8×106 kb

染色体DNA的长度=3.8×106/0.34=1.3×106nm=1.3mm

（2）该DNA有多少转？

答：转数=3.8×106×0.34/3.4=3.8×105

20．曾经有一段时间认为，DNA无论来源如何，都是4个核苷酸的规则重复排列（如ATCG、ATCG、ATCG、ATCG…），所以DNA缺乏作为遗传物质的特异性。第一个直接推翻该四核苷酸定理的证据是什么？

答：在1949-1951年间，E Chargaff发现：

（1）不同来源的DNA的碱基组成变化极大；

（2）A和T、C和G的总量几乎是相等的（即Chargaff规则）；

（3）虽然（A+G）/（C+T）=1，但（A+T）/（G+C）的比值在各种生物之间变化极大。

21．面抗原的变异和哺乳动物免疫多样性都是DNA重排的结果。锥虫通过DNA重排选择达所携带的一千多个不同的VSG基因中的一个。而哺乳动物细胞则通过DNA重排产生成百上千个不同的抗体，包括与VSG蛋白反应的抗体，尽管抗体在数量上的优势，锥虫仍然能够成功地逃避宿主的免疫系统，为什么?

答：锥虫因为细胞分裂周期短而取胜。当锥虫感染哺乳动物时，它在血流中以快速的倍增时间复制。在感染开始后不久，识别锥虫VSG的B细胞从休眠状态被激活并开始膨大，而哺乳动物细胞的分裂比锥虫慢得多。当B细胞膨大到足以杀死锥虫时，一些锥虫的VSG已经发生了改变，使B细胞不再能识别它。这样就起始了新一轮的感染，直到免疫系统能识别它时就已改变成能逃得过免疫系统的变体，于是又开始了新的循环。

22.分析比较细菌转座子的结构与特点。

答：1974年，随着发现与抗生素抗性有关的基因可以在质粒与细菌的染色体之间转移，科学家发现了转座子。转座子比IS元件大很多(一般为2—20kb)，它们至少含有一个基因，给宿主带来可遗传的标记，一般是对一种或多种抗生素的抗性。这是一种非常有用的性质，因为每种质粒可以用一种转座子"标记"，这样通过对药物的抗性型可以简单地检测质粒的存在和转移；同样，可以轻易地观察到转座。转座子Tn5(图A8.2)长5.7kb，是一种结构最简单的转座子;它由三个成分组装而成：一个长中心区(2—7kb)，含有卡那霉素的抗性基因，两端为一对IS元件，每个长1.5kb，方向相反。其他的转座．子两端为不同的IS 元件，有时两个IS同向。这些转座子的转座类似IS元件，转座过程中宿主的一个序列或DNA靶位点被复制。发生转座首先是因为任意一个IS序列或两个IS序列同时起作用，编码一个转座酶(在某些元件中，如Tn5，一个IS只有部分功能，不能编码一个有活性的转座酶);其次，转座子两端通常有一对与IS特异相应的反向重复序列：无论IS元件是正向还是反向的，这些末端重复序列都存在。还有一种可能性：任一对IS元件可以相互作用使它们之间的任意序列转座，这样任一个基因都可以在两端连上两个同样的IS元件成为转座子;这个性质已被用构建重组DNA分子。Tn5因为其组件的组成被称为集成转座子。其他转座子，如复杂的转座子的结构是不同的；它们两端不是一对IS而是一对反向重复，编码转座所需蛋白的基因位于转座子的中心区。

23.试证明一个基因中只有一条DNA链作为模板被转录。

答：若基因两条链均被转录，而RNA聚合酶只能以5'3'方向合成，所以两条DNA链会以相反方向转录。两信使携带着彼此互补的反向核苷酸序列，编码不同的多肽。虽然某些DNA 顺序能被双方向转录，但这不是常见现象。最早的明确证据是通过研究噬菌体SP8感染枯草杆菌(Bacillussubtilis)得到的。SP8的DNA很特别：一条链(重链)富含嘌呤，另一链(轻链)则富含嘧啶。若把双链DNA温和加热，两条链分离(即DNA变性)，可用密度梯度离心分离两条链。1963年，JuliusMarmur和PaulDoty用SP8感染枯草杆菌细胞后提取RNA，发现它只能与噬菌体DNA的"重"链杂交(即互补配对形成DNA-RNA杂合分子)。而不会与轻链杂交。显而易见，信使只可以与一条DNA链(重链)互补，因而DNA双链中只有一条链作为转录的模板(图A7.8)。Marmur和Doty很幸运地选用SP8做实验，因为它的全部基因都是同一条DNA链中转录而来。而另一些噬菌体，包括T4和噬菌体，部分基因由一条链转

录而其他基因则由另一条链转录；因此若用这些噬菌体而不是SP8做实验，则不能成功地说明问题。

24.有一个被认为是mRNA的核苦酸序列，长300个碱基，你怎样才能：(1)证明此RNA是mRNA 而不是tRNA或rRNA。(2)确定它是真核还是原核mRNA。

答：根据序列组成进行判断：(1)此序列太长不可能是tRNA。如果它是rRNA，应该含有许多特殊元件，如：假尿嘧啶和5—甲基胞嘧啶；同时应具有可以形成发夹环的反向重复序列。如果是mRNA则应有AUG起始密码子、一段相应的氨基酸密码子和一个相应的终止密码子构成的可读框。(2)所有的真核生物mRNA在5'端都含有一个7—甲基鸟苷，而且大多数还在3'端有一个长的po1yA尾巴。这些都是原核生物mRNA所不具有的，但是原核生物mRNA靠近5'端有l—个核糖体结合序列(SD序列)。

25.如果两个RNA分子具有适当的序列以及配对恰当，就可以利用它们构建锤头型核酶。其中，"底物链"必须含有5'—GUN—3'(N代任一种核苷酸)序列，而"酶链"则必须具有核酶催化中心的序列，同时与底物链配对。这样，酶链在N核昔酸的3'端对底物链进行切割。提供适当的酶链，可以降解细胞中不能被锤头型核酶切割的RNA，这为把酶链作为阻断某些基因达的治疗试剂提供了可能。例如，一些研究小组正在设计可以切割HIVRNA的酶链，将如何设计这种核酶的酶链?如何选择HIVRNA中的靶序列?该酶链应具有什么特点?另外，以RNA 作为药物，将会碰到什么问题?

答：首先，目标RNA必须具有5'-GUN-3'序列。这一序列不能位于参与形成其他RNA结构(比如说茎—环结构)的区域中，因为这些结构会妨碍RNA与起核酶作用的RNA链的配对。酶链必须与目标RNA配对，但不能与其它细胞内任何RNA配对，否则RNA会被不正确切除。在目前来说将一种RNA送到目标细胞中还是一件困难的事，但可以通过加上一个编码酶链的基因并将基因送进细胞中，让胞内的RNA聚合酶制造出RNA，或者以化学方法合成酶链并导人细胞中。

26.请解释酵母的交配型系统为什么可以作为DNA重组、染色质结构对基因达的调控、染色

体结构域的保持、转录元件间的蛋白互作、基因达的细胞类型特异性以及信号传递激活基因的例子。

答：交配型体系通过DNA重排把交配型基因从沉默基因座(HMT和HML)转移到达基因座(MAT)。沉默基因座由HMT和HML的染色体结构控制而没有转录活性。E和I沉默子区域是产生不活动染色体结构的分界。一些转录因子的活性受到蛋白—蛋白相互作用的调节，如PRTF转录因子。PRTF能单独激活"-特异基因，与-蛋白结合时能激活。-特异基因。当2出现时，它抑制-特异基因。细胞类型特异达基因的达以HO基因为例，它具有一个复杂的启动子，该启动子只在单倍体细胞中有活性，在双倍体细胞中没有活性。HO启动子还受到细胞周期的调节，它只在G1期的后期有活性。最后，交配型体系还采用一种信号传递级联作用来控制基因的达。交配型外激素与细胞面受体的结合激活了一系列将信号传递到核内并改变基因达的蛋白激酶。

27.用含中性碳源(例如甘油)的液体基本培养基培养E.coli不能诱导lacZ操纵子.一小时后在培养基中加入乳糖和再隔一段时间加入过量的葡萄糖分别会对lac操纵子的达有什么影响?

答：在最初的一小时内没有诱导物（乳糖)的存在，所以lac操纵于是关闭的。加入乳糖后，因为没有葡萄糖，lac操纵子经诱导达，使乳糖能够被利用，一段时间后加入的大量葡萄糖导致分解代谢阻遏使lac操纵子重新关闭。

28当lacZ-或lacY-突变体生长在含乳糖的培养基上时，lac操纵子中剩余的基因没有被诱导，解释是何原因。

答：异乳糖是乳糖操纵子的天然诱导物，它是乳糖经过末诱导细胞中的少量-半乳糖苷酶代谢产生的。在lac突变中完全不存在-半乳糖苷酶，乳糖不能被代谢，在lacZ-中完全没有透性酶，因此乳糖不能进入细胞。这样，两种突变体中都不能产生异乳糖，因此操纵子中的其余基因都不能被培养基中的乳糖诱导达。但是其它的基因能被像IPTG这样的安慰诱导物诱导，因为IPTG既能作为诱导物，又不需透性酶的帮助就能进入细胞。

29．蜜二糖是lac操纵子的弱诱导物，它通常在自己的透性酶作用下进入细胞。但如果细胞在42℃下生长，透性酶失去活性，则蜜二糖只有在lacY透性酶存在的情况下才能进入细胞。这样，42℃下lacY-和lacZ-的突变株不能在以蜜二糖为惟一碳源的培养基上生长。如何通过这种特性分离lac操纵子的组成型突变?

答：42℃时，一个lac+诱导型菌株不能生长在含蜜二糖的培养基上。因为乳糖透性酶不能被诱导产生(细胞内既没有乳糖，也没有蜜二糖)。任何组成型的lacOC和lacI-突变都能生长，原因是乳糖操纵子是永久性达的，所以蜜二糖就能够被乳糖透性酶运入到细胞内。