RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞转染)

RFect 小核酸转染试剂

货号：11011: 0.5ml

11012: 1.0ml 储存条件：-20℃

11013: 1.5ml

产品特点应用

产品介绍

RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞株、肿瘤细胞株等。目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很大的细胞毒性，并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利，并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。

操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。 B. siRNA-RFect 混合物准备：

1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。

2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min 。注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。

3. 孵育5min 后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl ）。轻轻混匀，室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：

1. 将100μl 混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。

2. 37°C 培养18-72h ，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h 时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、

所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。转染实验要点：

● 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡；

● 首次实验siRNA 的用量可稍大（一般10 nM ），后续实验根据实验结果修改。

转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24孔培养板，调整 siRNA 与RFect 试剂的用量。siRNA 用量在0.6-30 pmol(final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFect 试剂用量在1.0 - 3.0μl 之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验，如实验结果不理想，可适当调整并摸索转染试剂用量。储存和运输

蓝冰运输，4°C 保存，长期不用于-20°C 储存，避免反复冻融有效期

-20℃保存条件下，有效期为1年

质量控制

本产品经严格的质量检验证明，无生物污染注意：本产品仅用于科研实验

RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels

Culture vessel Surface area/well

(cm 2) Vol. of growth medium

(μl) Vol. of dilution medium

(μl) siRNA Amount

(pmol) RFect

(μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 6-well

2500

2 x 250

◎卓越的细胞转染性能：细胞转染阳性率高达90%以上，基因敲除效果明显，A549细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上

◎极低的细胞毒性：转染细胞死亡率不到10%，大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响

◎转染细胞范围广，绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染

◎200bp 内的小分子DNA 转染

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤：（在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟（在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。）注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

siRNA说明书

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20 C?-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔； b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度： siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24?72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。 1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液： a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ; b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ; c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。注意：稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。 3）将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基（v2）的培养孔中，轻轻混匀； 4）（可选）培养4?6h后，将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5）（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）；

磷酸钙法细胞转染试剂盒

磷酸钙法细胞转染试剂盒简介：外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞转染： 1、在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。 2、在加入DNA 之前2～4h ，加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 3、取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 4、取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。 5、室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。 6、取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。 7、置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 8、去除培养液，用PBS 清洗细胞2次，加入2ml 完全培养液继续培养，一般24h 后可见转染细胞的表达。 (二)悬浮细胞转染： 1、低速离心收集悬浮细胞，用PBS 洗涤1次。 2、取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。编号名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃ 使用说明书 1份

锐博siRNA产品说明书

siRNA使用说明（2009-08）名称：常规化学合成siRNA。产品简介：常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。保存和使用：保存：液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上；冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。使用：产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理；特别提示：荧光标记siRNA要求避光。使用方法： 1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。（siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。 2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）： (1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）： a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min； b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000 混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。 (3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和； (4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。 4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。

翻译好罗氏公司Tel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、

新型原代细胞转染试剂

简介人们尝试过很多方法将质粒DNA 导入细胞，常用的有DEAE 右旋糖苷，磷酸钙沉淀，脂质体，显微注射和电击等物理方法。现有的转染技术都或多或少的有各种不足，其中转染效率低，细胞毒性高是研究者最常遇到的困扰；而许多细胞系，特别是原代细胞是很难获得理想的转染效果的。现有的转染试剂产品在应用中还有一个普遍的问题，就是不太可能采用单一一种试剂在各种细胞上都获得较高转染效率；因此研究者不得不尝试很多种类的转染试剂而获得特定细胞的最佳转染效果。如果某种转染试剂盒可以在各种细胞——包括哪些“抗拒转染”的细胞?——的转染实验中都能获得好结果，对于广大研究者来说将是一个福音。为了达到研究者的这种期望，默克Novagen 经验丰富的研究团队开发了NanoJuice?转染试剂盒，其两种组分互相促进，可以提高各种哺乳动物细胞的转染效果。采用最新的纳米科学技术Priostar? dendrimers （树枝状聚合物）和多价阳离子脂质体的特别设计，NanoJuice 转染试剂混合物可以确保获得卓越的转染效率而细胞毒性极低。这种新的转染方法会帮助研究者在原代细胞和那些“顽固抵抗转染”的细胞上轻易获得成功。NanoJuice 试剂盒中的两种试剂经过调节配比，很方便为不同的细胞设定最佳转染效果的使用方法。有了NanoJuice 转染试剂盒就再也不需要不断地为每一种细胞从头摸索不同转染方法或尝试各种产品了。我们建议您采用预试验为特定的细胞找到最佳试剂用量，通常这个小试可以在24孔板中进行；一旦最优化的转染试剂用量确定了，后续的操作可以在此基础上非常方便地用等比缩放来轻松获得稳定的高效转染。确定最佳转染条件预实验我们在一些原代细胞和其它较难转染的细胞上做了预试验，以便摸索试剂的最佳用量和配比。每个试验设定6种条件，包括每ug DNA 采用2种不同用量的NanoJuice 核心转染试剂和4种不同用量的转染增强试剂（图1）。通常，NanoJuice 的最适使用量范围是：核心转染试剂1-2ul / ug DNA ，转染增强试剂1-4ul / ug DNA 。预试验结果显示，每种细胞的最佳转染效果采用的两种转染试剂成分的比例可能差别甚大（图2）。我们的尝试表明每一种细胞均需设置预试验以获得最优化的实验条件，同时这些数据也证明了NanoJuice?转染试剂盒是一种多功能转染工具，可以作为各种细胞高效转染的首选。不断在各种细胞上尝试NanoJuice 转染试剂盒发现其两种试剂成分的用量可以根据不同细胞的实际情况有更大幅度的调整。例如：Caco-2细胞的预试验中，NanoJuice 核心转染试剂和转染增强试剂都是1ul / ug DNA 。而进一步的尝试发现两种试剂的用量可以更低一些，分别为1ul 和0.75ul ，而转染效率有小幅提高（图3）。图1 确定最佳转染条件的预实验，尝试8种转染核心试剂与转染增强试剂的不同配比，每种做3个重复。 https://www.360docs.net/doc/787359441.html, 第 2 页，共 21 页下一页返回

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

各种转染试剂的中文转染方法

各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：

jetPRIME转染试剂说明

Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.360docs.net/doc/787359441.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)

CK-MB试剂盒说明书(罗氏)

the MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB 11821598 322 100测试主要用途用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸激酶同工酶MB含量。电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏 Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。临床应用1、2、3 肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可持续较长时间，这取决于病情经过。 CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹肌溶解症和中风。实验室诊断方面，测定总体 CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些临床疾病。 CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。因此跟踪测定非常有意义。 Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接对抗人CK-MB的单克隆抗体。检测原理双抗体夹心法，总检测时间：18分钟 ●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗 CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB 特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗体夹心复合物。 ●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之间的反应结合到微粒上。 ●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过ProCell被去除。给电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。 ●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得到检测结果。 a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)- complex (Ru(bpy){ 2 3 }三联吡啶钌试剂－工作溶液 M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。 R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶， 10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L， pH值7.0；防腐剂。 R2 Ru(bpy)32+标记的抗CK-MB抗体（黑盖）， 1瓶，10mL；钌标记的抗CK-MB单抗 1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH 值 7.0；防腐剂。警告和注意事项仅用于体外诊断。在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂操作的注意事项。所有废弃物必需按照当地法规进行处置。专业人员可要求获得安全数据报告。避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产生气泡。试剂处理试剂盒为即用型，不能分开使用。试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。储存及稳定性存放于2－8℃。请垂直摆放Elecsys CK-MB试剂盒，确保使用前仪器通过自动搅拌能够完全混匀磁珠微粒。样本的采集和准备仅以下罗列的样本通过检测要求。血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管收集。肝素锂、肝素钠、K3-EDTA和枸橼酸钠抗凝的血浆都适用。使用枸橼酸钠抗凝的血浆时，结果必须按＋10％校正。标准：回收率在血清值的90-110%以内或斜率 0.9-1.1＋截距<±2×分析灵敏度（LDL）＋相关系数>0.95。稳定性：18-23℃保存4小时，2-8℃保存8小时， -20℃保存3个月。样本只能冰冻一次。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

siRNA转染常见问题解答

siRNA转染常见问题解答 SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？ SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM， 50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。这里需要说明的是，以

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染；运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。

lip2000转染说明书

4. 哺乳动物细胞siRNA转染 4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。目前用的最多的是阳离子脂质体法。 4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞 转染)