各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法
FuGENE6（Roche）转染步骤：
转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。
2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。
4. 室温孵育20分钟。
5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。
6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：
1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。
3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。
5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。
6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。
7. 在37℃，5％CO
2
或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。
8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
贴壁细胞的稳定转染：
转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。
Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：
1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数（0.5-2×105），细胞铺板，使其在转染
日密度为90-95％。细胞铺板在0.5 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养
基中。
2. 对于每孔细胞，使用50 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8-1.0 ugDNA，轻轻混匀。
3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释1-3 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。
5. （optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入0.5ml无血清配养基。
6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。
7. 在37℃，5％CO
2
或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。
8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
贴壁细胞的稳定转染：
转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。
Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：
以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每6孔培养板使用0.4 ug DNA。尽管DNA的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。
1. 转染前一天，用5ml含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。
）。转染当天细胞应40-80％2. 在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO
2
融合。
3. 转染时，用DNA浓缩缓冲液（EC Buffer）稀释1 ug DNA至100 ul总体积（DNA 用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低浓度：0.1ug/ul）。加入3.2 ul Enhancer，涡旋1s以混合溶液。
重要：请保持DNA与Enhancer比例恒定。
注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用Endofree Plasmid Kit，该
试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染结果。
4. 室温（15-25℃）孵育2-5分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液滴。
5. 向DNA-Enhance混合液中加入10ul Effectene Transfection Reagent，反
复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。
注意：没必要一直把Effectene Reagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。
6. 室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。
7. 孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用4 ml PBS洗涤一次细胞。加入1.6 ml新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。
8. 加入0.6 ml培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP
管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物drop-wise加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。
9. 将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。
Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后6-18小时移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗涤一次细胞，然后加入5 ml新鲜细胞培养液。
10. 瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。
转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基
因的表达最大化。
稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:5~1:10传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。
注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。
以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液。
Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：
以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。
1. 转染前一天，用含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105
的细胞（根据细胞类型而定）。
）。转染当天细胞应40-80％2. 在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO
2
融合。
3. 转染时，用无血清培养基稀释2 ug DNA至100 ul总体积（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低浓度：0.1 ug/ul）。混合，离心几秒钟以从管顶去除液滴。
注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用Endofree Plasmid Kit，该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染结果。
4. 向DNA稀释液中加入10 ul Superfect Transfection Reagent，反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。
注意：没必要一直把Superfect Reagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。
5. 室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。
6. 孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用2ml PBS洗涤一次细胞。
7. 加入600 ul培养液（包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。吹打两次以混合，立即将转染复合物加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。
8. 将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育2-3小时。
9. 小心移除Superfect-DNA混合物，用2 mlPBS洗涤3-4次细胞
10. 加入新鲜的正常培养基，孵育24-48小时。
11. 瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。
转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达最大化。
稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:10~1:15传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。
注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。
以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： （在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟 （在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
磷酸钙法细胞转染试剂盒
磷酸钙法细胞转染试剂盒 简介： 外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞转染： 1、 在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。 2、 在加入DNA 之前2～4h ，加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 4、 取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。 5、 室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。 6、 取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。 7、 置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 8、 去除培养液，用PBS 清洗细胞2次，加入2ml 完全培养液继续培养，一般24h 后可见转染细胞的表达。 (二)悬浮细胞转染： 1、 低速离心收集悬浮细胞，用PBS 洗涤1次。 2、 取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃ 使用说明书 1份
新型原代细胞转染试剂
简介 人们尝试过很多方法将质粒DNA 导入细胞，常用的有DEAE 右旋糖苷，磷酸钙沉淀，脂质体，显微注射和电击等物理方法。现有的转染技术都或多或少的有各种不足，其中转染效率低，细胞毒性高是研究者最常遇到的困扰；而许多细胞系，特别是原代细胞是很难获得理想的转染效果的。现有的转染试剂产品在应用中还有一个普遍的问题，就是不太可能采用单一一种试剂在各种细胞上都获得较高转染效率；因此研究者不得不尝试很多种类的转染试剂而获得特定细胞的最佳转染效果。如果某种转染试剂盒可以在各种细胞——包括哪些“抗拒转染”的细胞?——的转染实验中都能获得好结果，对于广大研究者来说将是一个福音。 为了达到研究者的这种期望，默克Novagen 经验丰富的研究团队开发了NanoJuice?转染试剂盒，其两种组分互相促进，可以提高各种哺乳动物细胞的转染效果。采用最新的纳米科学技术Priostar? dendrimers （树枝状聚合物） 和多价阳离子脂质体的特别设计，NanoJuice 转染试剂混合物可以确保获得卓越的转染效率而细胞毒性极低。这种新的转染方法会帮助研究者在原代细胞和那些“顽固抵抗转染”的细胞上轻易获得成功。NanoJuice 试剂盒中的两种试剂经过调节配比，很方便为不同的细胞设定最佳转染效果的使用方法。有了NanoJuice 转染试剂盒就再也不需要不断地为每一种细胞从头摸索不同转染方法或尝试各种产品了。我们建议您采用预试验为特定的细胞找到最佳试剂用量，通常这个小试可以在24孔板中进行；一旦最优化的转染试剂用量确定了，后续的操作可以在此基础上非常方便地用等比缩放来轻松获得稳定的高效转染。 确定最佳转染条件预实验 我们在一些原代细胞和其它较难转染的细胞上做了预试验，以便摸索试剂的最佳用量和配比。每个试验设定6种条件，包括每ug DNA 采用2种不同用量的NanoJuice 核心转染试剂和4种不同用量的转染增强试剂（图1）。通常，NanoJuice 的最适使用量范围是：核心转染试剂1-2ul / ug DNA ，转染增强试剂1-4ul / ug DNA 。预试验结果显示，每种细胞的最佳转染效果采用的两种转染试剂成分的比例可能差别甚大（图2）。我们的尝试表明每一种细胞均需设置预试验以获得最优化的实验条件，同时这些数据也证明了NanoJuice?转染试剂盒是一种多功能转染工具，可以作为各种细胞高效转染的首选。不断在各种细胞上尝试NanoJuice 转染试剂盒发现其两种试剂成分的用量可以根据不同细胞的实际情况有更大幅度的调整。例如：Caco-2细胞的预试验中，NanoJuice 核心转染试剂和转染增强试剂都是1ul / ug DNA 。而进一步的尝试发现两种试剂的用量可以更低一些，分别为1ul 和0.75ul ，而转染效率有小幅提高（图3）。 图1 确定最佳转染条件的预实验，尝试8种转染核心试剂与转染增强试剂的不同配比，每种做3个重复。 https://www.360docs.net/doc/1c12283299.html, 第 2 页，共 21 页 下一页 返回
各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤： 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁细胞的稳定转染： 转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：
miRNA及其inhibitor转染方法
miRNA及其inhibitor转染方法 1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。 （1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水； （2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水； （3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水； （4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水； 对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。 分装后于－80 ℃保存。 2经过调整，细胞状态较好。晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。 3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。 （1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 min b 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min （2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min b用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min （3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。（4）用无血清的DMEM将培养皿中的细胞清晰干净，至少2次 （5）向培养皿中加入3 ml无血清DMEM （6）向培养皿中加入a和b的混合液（成点状均匀加入） （7）放入细胞培养箱作用6 h。 4 下午三点对转染细胞进行换液：弃去无血清DMEM后每个60 mm培养皿加入4 ml 含10%血清的DMEM，18 h后接毒。
jetPRIME转染试剂说明
Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.360docs.net/doc/1c12283299.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
脂质体转染的几个实验方法
脂质体转染的几个实验方法 关键词：脂质体转染2013-08-28 14:32 来源：互联网点击次数：731 实验原理 脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 实验步骤 1. 操作步骤(方法一)： 1) 取6孔培养板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5个细胞的培养基，37℃、18% CO 2培养基40%-60%汇合时。 2) 转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。 A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。 B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。 轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 3) 转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。 4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 5) 其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 6) 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二)： 1) 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。 2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。 a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。 b. 旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。 c. 室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。 3) 弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。 4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。 5) 吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。 6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书
Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。
转染实验方法 (全)
转染实验方案 1.LB培养基的配制：500ml（5皿+2锥形瓶） 准备：500ml玻璃瓶1个，250ml玻璃瓶2个，500ml容量瓶一个，平皿5个 称取：酵母浸提液 5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠10.0g 实验操作： 混合后加去离子水（或注射用水）水400ml，待充分溶解后加水定容至500ml，取100ml 做固体培养基用装入A瓶，余下装入500ml B瓶中（400ml/瓶） 称取1.5g琼脂粉加入A瓶中 另取一瓶（C瓶）接100ml水（稀释氨苄西林用） 将以上3瓶高压灭菌：121°C , 30min 取氨苄西林一支：规格：1g/支 加水于安瓶中溶解后，移入C瓶中，浓度：10mg/ml 按照50μg/ml氨苄西林的浓度加到A B C三瓶中 A瓶：0.5ml（即为LB固体培养基）——松弛型100μg/ml,严紧型50μg/ml B瓶：2ml（即为LB液体培养基） 将A瓶按20ml/平皿，分别移到5个平皿中，待冷却后即为固体培养基。 用膜封口放入4℃保存。 2.感受态转化与培养（TOP10） 准备：37℃摇床，37℃烘箱，10cm培养皿（LB琼脂凝胶+氨苄=50 ml LB+0.75 g琼脂+50μl氨苄），冰盒，42℃水浴,无菌牙签，氨苄溶液40~60 μg/ml 实验前：水浴调至42℃，SOC培养液放至室温，LB加氨苄培养皿于37度烘箱中加热半小时 实验操作： 1)将质粒短暂离心后迅速放入冰浴中 2)冰上解冻TOP10 3)吸取1到10μl质粒加入TOP10中，轻轻敲打混匀（切记不可用移液枪混匀）。剩 余的质粒可储存于-20℃中 4)冰上孵育TOP10离心管30min。 5)42℃水浴30s（精确），不要晃动离心管 6)迅速转入冰浴2-3min，加入250μl预热的soc溶液，保证过程无菌 7)37℃摇床水平225 rpm摇1h 8)吸取200μl用三角耙铺板（最好同时做不同加入量的2个皿，LA培养皿预热）， 剩余溶液储存于4 ℃ 9)正置20min，倒置37 ℃培养过夜 10)第二天取出平皿，观察菌落，选择较大菌落，用牙签挑取菌落放入对应的试管中， 加入15 μl氨苄西林（C瓶母液），最后加3ml LB液体培养基，试管放架子上37 ℃ 摇4-6 h（预培养） 11)按照培养基：菌液=200ml：2ml进行转菌，剩余菌液放入EP管中-20℃保存（复苏 加时100μl菌液预培养）。37℃摇床过夜（约12h），收集菌体。
转化和转染
转染和转化的区别 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 基因转染 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，
各种转染方法比较
各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓 度较高）,操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL，Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物，然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合；另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电核，而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA，能转染各种类型的细胞，没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率，但在体内，能被血 清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒 性，这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine， Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin） Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co（GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega（Transfast，Tfx， Transfectam）
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。