莫氏马尾藻_Sargassumm_省略_多酚的抗氧化和抗肿瘤细胞增殖作用_卢虹玉

网络出版时间：2013-01-04 14:42

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2012-11-19

莫氏马尾藻（Sargassum mcclurei）褐藻多酚的抗氧化和抗

肿瘤细胞增殖作用

卢虹玉1*刘义2邵海艳1吉宏武1

（1．广东海洋大学水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江，524088；2. 广东医

学院广东天然药物研究与开发实验室，广东湛江，524023）

摘 要：目的：研究莫氏马尾藻（S. mcclurei）褐藻多酚(PTs)的抗氧化活性和抗

肿瘤细胞增殖作用。方法：溶剂萃取和超滤的方法进行莫氏马尾藻PTs的提取和

精制；Folin - Ciocalteu比色法和磷钼络合物法检测PTs的含量和总抗氧化能力；

DPPH和超氧阴离子法检测PTs的自由基清除能力；MTT法检测PTs对sw579甲

状腺鳞癌细胞生长抑制作用。结果：获得４种PTs提取物，分别为水层内液(W1)

和乙酸乙酯内液(EA1)（相对分子质量>10KD）、水层外液(W2)和乙酸乙酯外液

(EA2)（相对分子质量<10KD），总酚含量分别为1.672、0.096、1.319、0.143mg 没

食子酸（GA）/g海藻干基，在相同浓度(3 mg/L)时，W1的总抗氧化能力最强,

相当于2.315 mg/L的GA；４种PTs提取物均有清除自由基的作用，W1和EA1

的清除作用更强；随着作用时间延长，４种PTs提取物在低浓度(4.4mg/L)时对

sw579甲状腺鳞癌细胞生长的抑制作用不断增加，其中W2的作用最强，作用72h

的抑制率为23.84%。结论：莫氏马尾藻具有显著的抗氧化作用和一定的细胞毒活

性，具有潜在的开发应用价值。

关键词：莫氏马尾藻；PTs；抗氧化；抗肿瘤细胞增殖

Antioxidant and antiproliferative activities of phlorotannins from

Sargassum mcclurei

LU Hong-yu 1*, LIU Yi 2, SHAO Hai-yan 1, JI Hong-wu 1

(1. Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher

Education Institutes, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China；2.

Guangdong key laboratory for research and development of natural drug, Guangdong Medical

Collage, Zhanjiang 524023,China)

Abstract: Objective: To investigate antioxidant and antiproliferation activity of PTs

from S. mcclurei. Method: PTs from S. mcclurei was extracted and prepared by

solvent extraction and ultrafiltration. The contents of PTs in extracts were detected by

Folin – Ciocalteu colorimetry and total antioxidant activity was evaluated by phosphomolybdenum method. The effects of radical scavenging of PTs were studies by using DPPH and superoxide anion. The antiproliferation effect on sw579 thyroid squamous cell carcinoma cells was tested by MTT assay. Results: Four different PTs extracts including W1 (aqueous fraction, SMW>10KD), EA1 (ethyl acetate fraction, SMW>10KD), W2 (aqueous fraction, SMW<10KD), EA1 (ethyl acetate fraction, SMW<10KD) were attained. The contents of the four extracts were 1.672、0.096、1.319、0.143mg gallic acid(GA) equivalent /g seaweed on dry weight basis respectively. Total antioxidant activity of W1 extract at 3 mg/L was close to GA at 2.315 mg/L and the strongest among them. W1 and EA1 exhibited higher DPPH and superoxide anion than W2 and EA2. Four PTs extracts at low concentration (4.4mg/) exhibited gradually strengthen antiproliferation activity with the increasing of culture time, of which W2 displayed the strongest inhibition rate of 23.84% at 72h. Conclusion: S. mcclurei shows significantly antioxidant and antiproliferation activity, which has some potential to be studied and exploited further.

Key Words: S. mcclurei;PTs; antioxidant; antiproliferation

中图分类号：TS201.4文献标识码：Ａ

海藻含有大量的生物活性物质，如多糖、多酚、萜类、吲哚等，是国内外研究热点。褐藻多酚（Phlorotannins, PTs）是一类来自褐藻、以间苯三酚为基本单位、具有酚类化合物性质及单宁性质的次生产物，分子量分布复杂，具有抗氧化、抗炎、抗辐射、抗糖尿病、抗肿瘤、抗过敏、抗菌等多种生物活性[1-2]。目前国内外研究者对褐藻中扇藻属( Zonaria)、囊载藻属( Cystophora)、裙带菜属 ( Undaria)、昆布属（Ecklonia）、马尾藻（Sargassum）属等部分藻种的多酚类物质进行了不同程度的研究[2-5]。但由于褐藻种类繁多，海域分布差异大，涉及的品种相对较少。不同的藻类其多酚类化合物种类和结构差异极大。因此，有必要扩大研究对象，为高值化利用我国丰富的海藻资源，开发海洋药物和功能性食品保健品提供依据。

莫氏马尾藻（S. mcclurei）为褐藻门、马尾藻科、马尾藻属海水藻类植物，产于香港、广东省海丰、硇洲岛、徐闻、海南、广西北海、涠洲岛等海域，生长在低潮带或潮下带岩石上，资源丰富。目前已有繁殖生物学方面的研究[6]，未见

活性成分相关研究报道。本实验对莫氏马尾藻褐藻多酚进行抗氧化和抗肿瘤初步活性进行研究，为其开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

莫氏马尾藻采自湛江硇洲岛，清水洗去除泥沙及附生物，纯净水冲洗后风干研成粉末，-20℃储存备用。sw579甲状腺鳞癌细胞由广东医学院天然药物省重点实验室提供。福林酚试剂（北京鼎国生物技术有限公司），没食子酸（GA）（中国药品生物制品检定所，色谱纯），TPTZ试剂（美国Sigma公司），DPPH试剂（美国Sigma公司），MTT（美国Sigma公司），RPMI-1640（美国Hyclone公司），超级无支原体新生牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰酶（美国Gibco 公司），其它试剂均为国产分析纯，实验用水无特殊说明者为超纯水。

RT-34连续投料粉碎机（荣聪精密科技）；N-1000真空旋转蒸发仪（EYELA）；多利斯 sartorius Vivaflow超滤器超滤膜包（上海摩速科学器材）；UV2550紫外分光光度计（日本岛津）；HH-8数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；HERAcell240i CO2细胞培养箱（美国Thermo）；3001 varioskam plash型连续波段酶标仪（美国Thermo）；13mm无菌针头滤器（美国PALL）

1.2 方法

1.2.1 莫氏马尾藻PTs的提取和精制

莫氏马尾藻按质量体积比1:10（粉末：甲醇）加入80%甲醇溶液，常温下120r/min避光震荡16h，过滤，滤渣按上述方法重复提取2次，合并滤液，低温减压蒸馏去甲醇得粗提液，以等体积的正己烷和三氯甲烷分别洗涤2次，取水相，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，得水相和乙酸乙酯相莫氏马尾藻PTs 提取液，分别进行超滤（截留分子量10KD的膜包），获得水层内液(W1)和乙酸乙酯内液(EA1)（相对分子质量>10KD）、水层外液(W2)和乙酸乙酯外液(EA2)（相对分子质量<10KD），浓缩冻干成粉-20℃备用。

1.2.2 总酚含量的测定

采用Folin - Ciocalteu比色法[7]，具体步骤根据试剂盒操作。总酚含量以没食子酸（GA）当量计算。GA在0~10.0mg/L范围内线性关系良好，标准曲线回归方程：Y= 0.03421X +0.0029，R2=0.9997。

1.2.3总抗氧化能力的测定

采用磷钼络合物法测定各样品总抗氧化能力[8]。0.5mL相同浓度的样液加入

4.5mL新鲜配制的磷钼试剂，混匀后置于水浴锅中恒温90 min，695 nm波长处测定。以GA当量为总抗氧化能力的衡量标准，GA系列浓度与吸光度回归方程: Y= 0.1519x + 0.011，R2=0.9962。

1.2.4 DPPH清除活性测定

各样品配制成系列浓度，根据文献报道[9]，简述如下：设空白组(DPPH无水乙醇溶液+ 2ml 超纯水)，试样组(DPPH无水乙醇溶液+ 2mL 不同浓度试样溶液)和参比组(无水乙醇溶液 + 2mL 不同浓度试样溶液)，加样后暗处放置60min，在λ=517nm处测定吸光度值。GA为阳性对照，根据以下公式计算清除率，并计算半数清除率(IC50)。

DPPH清除效率= (A0–（A x–A x0)/A0×100%

A0 — 空白组；A x －试样组；A x0 －参比组

1.2.5 超氧阴离子清除活性测定

采用邻苯三酚自氧化-分光光度法。将各样品配制成相同浓度，根据文献报道方法，首先进行邻苯三酚自氧化速率线的制作，确定邻苯三酚的自氧化的最佳反应体系和条件，然后进行样品测定，计算清除率。以维生素Ｃ为阳性对照。

1.2.6 抗肿瘤细胞增殖能力检测

采用MTT法进行检测。方法简述如下：对数生长期的sw579甲状腺鳞癌细胞接种于96孔板中，培养过夜，吸出培养液，加入新培养液，并加入相同浓度的各样品，调整终浓度均为4.4μg/mL。设置空白对照组及5-Fu阳性对照组，每组设８个平行，分别作用24h、48h、72h，检测OD值，计算抑制率。实验重复３次。

1.3统计分析

采用SPSS软件进行数据处理和分析。数据以X ± S D 表示，不同数据间用t 检验作统计学分析。

2 结果与分析

2.1总酚测定

总酚测定结果显示(表１)，莫氏马尾藻不同PTs提取馏分的总酚含量差异较大，以海藻干基计W1、W2、EA1、EA2的总酚含量分别为1.672、1.319、0.096、

0.143mg GA/g。总的来说，溶于水的酚总量(约3mg GA/g干基)远高于溶于乙酸乙酯的酚总量(0.239mg GA/g干基)，其中大分子量的乙酸乙酯馏分尤其少，仅0.096 mg GA/g干基。

2.2总抗氧化能力测定

从表1可看出，相同量的不同PTs提取馏分抗氧化能力不同，大分子量的W1和EA1总抗氧化能力均强于小分子量的W２和EA２,其中W1的总抗氧化能力最强,3 mg/L时的总抗氧化能力接近相同浓度的GA,相当于2.315 mg/L的GA。

表1 莫氏马尾藻不同PTs提取馏分中的总酚含量和总抗氧化能力(n=3)

图１莫氏马尾藻不同PTs提取馏分的DPPH清除作用

Fig 1 DPPH scavenging activity of PTs from S. mcclurei

表2莫氏马尾藻不同PTs提取馏分DPPH IC50

Table 2 IC50 value of DPPH scavenging of PTs from S. mcclurei

W2 EA1 EA2

W1

样品名 GA

IC50(mg/L) 1.369 13.619 25.329 13.178 17.405 2.4超氧阴离子的清除活性

采用邻苯三酚自氧化体系检测样品对超氧阴离子的清除作用，往往受到反应

体系和条件的影响，不同的样品所需的最佳反应体系有一定的差异，因此，本研

)的

W1甚

的

作用72h后抑制率增加。4种PTs样品中，W2的作用最强，72h时的抑制率为

23.84％。

表4莫氏马尾藻不同PTs提取馏分对sw579甲状腺鳞癌细胞的增殖抑制作用(x±s,

n=3)

Table 4 Antiproliferation effect of PTs from S. mcclurei on sw579 thyroid squamous cell

carcinoma cells (x±s, n=3)

３个作用时间下的抑制率(h)

样品编号24 48 72

25.28±0.735** 46.62±0.71**

5F-U 26.74±3.378**

14.89±2.221**

7.77±2.798*

W1 -

23.84±4.072**

19.40±1.109**

W2 -

18.15±0.915**

10.05±3.035**

EA1 -

14.67±5.897**

EA2 -

9.32±0.122**

注：各样品浓度均为4.4 mg/L；- 表示无抑制活性；* 与对照组比，有显著性差异(P＜0.05)；

**与对照组比，有极显著性差异(P＜0.01)。

3 讨 论

近年来，关于海藻多酚的研究越来越多，其中PTs作为一类主要存在于褐藻

植物中，具有不同结构和多羟基的单宁类化合物，是植物的次生代谢产物，能够

促进健康、预防慢性疾病，加上低毒安全等优点，被公认为是最具潜力的研究对

象。大量研究表明，PTs具有强抗氧化能力，并认为它的抗氧化机理与其本身独

特的结构骨架有关[2,4]。

本研究采用了溶剂萃取方法进行褐藻多酚的提取，与相关研究比较，莫氏马

尾藻的酚提取率偏低。Cho等[4]分别用正己烷、氯仿、乙醇和水作为提取剂，

对长角马尾藻(S. siliquastrum)总多酚进行了分次提取。结果表明，４种提取剂中，

乙醇的提取率虽然较低(5.51％海藻干基)，但其中的总酚含量最高(127.37mg/g提

取物)，其醇提取物中的总酚含量约为7mg/g干基。这可能是由于本实验的研究

对象－PTs类化合物只是海藻总多酚类化合物中一类，在提取和精制的过程中，

采用了高浓度的醇为提取剂，既最大可能地保证了PTs被提取出来，又去除了蛋

白质、糖类等大部分杂质，并以正己烷和氯仿对粗提物进行了洗涤，去除了较多

杂质，因此，提取物中的总酚含量偏低。

PTs由于间苯三酚的聚合程度不同，分子量差异极大，分子量范围为126D

－950KD。本研究对莫氏马尾藻的PTs提取物进行了分子量分级。结果表明，相

对分子量较大的PTs抗氧化效果普遍优于相对分子量较小的PTs，证实了PTs在

抗氧化方面存在构效关系。这与魏玉西等[10]报道的结果一致。他们的结果表明，

鼠尾藻相对高分子量的PTs抗氧化活性更强。以前的研究也证实，相对分子量大

的PTs含有更多的间苯三酚单元，结构所带的酚羟基数量更多，因此表现出更强

的抗氧化能力[11]。Chandini等[9]对印度3种褐藻的甲醇提取物及乙酸乙酯、正丁

醇等几种有机溶剂的萃取馏分进行了体外抗氧化研究。结果显示，DPPH清除率

最高的为S. marginatum乙酸乙酯萃取馏分，为23.16%，其中有些馏分未表现出

清除作用。Chew等[12]研究了东南亚3种可食用海藻50%甲醇提取物的抗氧化活

性，3种海藻的DPPH IC50分别为0.337、14.3和11.8 mg/L。这些结果证实了不

同的海藻萃取馏分的主要成分虽然同样是多酚，但抗氧化能力差异很大。本研究

中清除效果最好的是分子量较大的乙酸乙酯馏分。

魏玉西等[13]在研究鼠尾藻多酚对人肺腺癌A-549细胞和人肝癌BEL-7402细胞的生长抑制作用时,发现低质量浓度(10 mg/L以下)的鼠尾藻多酚对癌细胞的抑制率低于10%,与本实验结果较为相符。随着鼠尾藻多酚质量浓度的增加,抑制率迅速上升,最高可达90%以上。本研究所采用的样品浓度均为4.4mg/L，抑制率相对较低。国内另一项研究[14]海带PTs活性的结果表明，海带乙酸乙酯PTs 馏分对BEL-7402和P388癌细胞的增殖抑制率分别为61.96%和40.47%，证实了PTs具有抗肿瘤细胞增殖作用。但莫氏马尾藻PTs对肿瘤细胞生长的抑制作用似乎与分子量大小没有必然关系，相对分子量较小的W2表现出最强的抑制作用，这可能与PTs在不同生物活性方面的作用机制不同有关。体外抗氧化体系一般反映化合物的直接抗氧化作用，不涉及间接抗氧化作用，因此，化合物结构中的供电子基团越多，表现为抗氧化效果越强，但PTs的抗肿瘤细胞增殖作用可能与诱导细胞凋亡机制有关[15]，这类机制往往依赖于化合物作用于细胞信号转导通路，一般而言小分子化合物更容易激活相关信号通路。如多项研究表明PTs中分子量较小的Eckol类和dieckol类化合物在一些细胞信号通路中起着重要作用[16－17]。总的来说，目前关于PTs的抗肿瘤机制研究相对较少,有待进一步研究。

目前莫氏马尾藻的研究还处在初步阶段，本研究结果显示莫氏马尾藻PTs 具有显著的抗氧化作用和一定的肿瘤细胞增殖抑制活性，为莫氏马尾藻的进一步研究开发提供依据。

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