细胞培养：如何选用培养基及培养细胞注意事
培养基手册
MEDIA HANDBOOK
（2005）
一、培养基的历史
体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。
体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。
细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。
发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、
设计不同的培养液等几个方面进行。
1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织；
1903年Jolly，1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养；
1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法；
1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法；
1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法；
1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。
Earle等加以改进，使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上，培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。
组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。
在培养容器方面, 由简单的用试管、旋转管培养，发展到多种培养瓶培养，近年来，塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。
在培养基方面，从50年代初，Parke、Eagle等设计出合成培养基后，从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清（促细胞生长物），直至60年代设计出无血清培养基。
首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液，以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。
在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。
1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。
1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。
从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。
诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。
在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。
在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L 生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到
1.7×107cells/mL。
二、细胞培养目的与用途
1．科学研究
（1）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物研究与开发、单克隆抗体制备等。
（2）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究。
2．生物制药
（1）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（肿瘤疫苗)等。
（2）基因工程药物生产：如EPO等。
（3）抗体药物、基因治疗药物生产。
（4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等。
（5）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性；并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性。
三、细胞培养基的定义
人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。包括：
1．天然培养基
指来自动物体液或利用组织分离提取的一些培养基，如动物血浆、胚胎浸
出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。
2．合成培养基
人工设计、配制的培养基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。
四、动物细胞培养技术平台
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言：蛋白治疗药物如糖蛋白、抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有更为快速的发展。届时，蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产能力。
动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污
浓度累积染；更为精确有效的工艺控制手段；规模化培养中氧气的限定与溶解CO
2
的控制等。
1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。
动物细胞大规模培养技术集中在细胞系、细胞培养基和细胞生物反应容器三个方面，构成生物制品生产的必要条件。
其中细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响蛋白的表达量或病毒的滴度，故筛选、驯化优质细胞是关键。而只有好的细胞培养基才可能筛选、驯化出优质的细胞。
细胞生物反应容器也在不断发展，以转瓶、反应器为主要细胞生产设备，配合高密度培养、微载体培养、悬浮培养技术，均需要相适应的细胞培养基以充分发挥作用,获得高表达、高产量，降低生产成本。
清大天一公司致力于动物细胞培养技术的开发和服务，跟随生物技术的发展，针对各种生物制品特点不断开发针对性培养基新产品，建立多种细胞体系的疫苗、
抗体药物生产细胞培养技术平台，以提高相应细胞培养水平和生物制品表达水平，促进生物制药发展。
细胞培养技术对生物制品成本的影响
1．表达量提高
通过细胞培养技术的不断改进可以充分利用现有设备，大幅度提高生物制品表达量，降低生物制品的单位制造成本；同时，由于产量提高并不新增固定资产投资，也带来生物制品的单位固定成本的降低。
因此提高表达量可以有效降低生物制品的单位成本，既降低变动成本，也降低固定成本，使得制品利润率提高，市场竞争能力增强。
2．培养液成本降低
在很多使用牛血清的细胞培养液中，为牛血清支付的成本远远高于培养液中的细胞培养基等其它成分，因此通过采用低血清细胞培养基，降低牛血清用量，可以降低细胞培养液总成本。
3．纯化成本低，制品安全性提高
牛血清的使用量不仅增加了细胞培养液的成本，更严重的是带来动物来源成分、杂蛋白，以及不安全因素，这些成分越多，纯化的成本越高、生物制品原液损失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、无血清培养细胞可以有效降低纯化成本何损失，提高生物制品成品率和利润率。
4．综合成本降低
综上所述，动物细胞培养技术是生物制品产业化的核心技术之一，在生产中，应该系统、全面的研究细胞培养技术对生物制品成本的综合影响，不断追求最佳的细胞培养技术，提高生产效率，有效降低生物制品成本，提高利润率，增强产品市场竞争力。
五、细胞生存条件
1．基本营养物质
（1）糖
六碳糖主要能源、维持渗透压，含葡萄糖1-5%。
（2）氨基酸
维持生存需12种氨基酸（精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪、缬）。谷氨酰胺需量最大,缺乏时细胞生长不良。
单细胞培养或细胞量少时,所需氨基酸的种类和量增多，细胞主要利用左旋氨基酸异构体。
（3）维生素
细胞大部分需水溶性B族维生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促进正常细胞生长繁殖。
2．促生长因子、激素类物质
3．其它物质
基本元素、微量元素、促细胞贴附物质(纤粘连蛋白、层粘连蛋白laminin、IV型胶原、氨基多糖类)
4．水
主要成分和生存环境,要求高纯度水。
5．温度
哺乳动物及人源细胞最适培养温度为35℃—37℃,对低温耐受力比高温强。39℃以上受损→死亡；不低于0℃时（0℃-34℃），细胞能生存，但代谢降低、分裂延缓。
6．气体环境和pH
需O
2、CO
2
，通氧量过大对细胞有毒害。
CO
2
主要与维持pH有关，细胞培养最佳pH为7.2—7.4，通过缓冲系统和调
节CO
2
含量，维持正常pH。
开放培养要求5%CO
2
环境、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH变化。
含Earle’s缓冲系统的培养基适合于5％CO
2
的培养条件，Hanks’缓冲系
统的培养基仅含有0.35g/L NaHCO
3，不能用于5％CO
2
的环境，若放入CO
2
培养
箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。
7．湿度和光
开放培养相对湿度控制在95%。细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力。
8．影响细胞生长的其它因素
接触橡胶用品、收集细胞时离心速度过大、细胞接种浓度过低等。
六、细胞培养基的基本要求
1．营养成分
氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素。
2．促生长因子及激素
3．渗透压
4．pH
5．无毒、无污染
七、细胞培养基组成及作用
1．氨基酸
组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。
2．维生素
维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
●脂溶性维生素如：A、D、E、K。
●水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺
等。
许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。
VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD 参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。
叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。
生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。
3．碳水化合物
碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
4．无机离子
钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。
培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ?320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。
K +主要分布在细胞内液，细胞内K +的对于激活某些酶是必需的，它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。 Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。 Mg2+是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。
八、细胞培养基发展趋势
1．无血清培养基
是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和/或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。其主要优点：
●增加确定性；
●性能更一致；
●容易进行纯化和下游加工；
●提高制品安全性和/或产量。
2．无蛋白培养基
培养基中没有添加蛋白，但仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（如低分子量肽的各种水解物）。
培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。
九、培养基的品质
1．外观
颜色、粉末细度须均匀。
2．溶解性
培养基完全溶解，可以避免培养基内营养成分的流失。
3．pH值
哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，同时pH值的测定也可以检查培养基的批间差异。
4．水分
培养基的营养成份很丰富，利于微生物的滋长，因此水分的含量控制可以延长有效期。
5．冰点渗透压
细胞必须生活在合适的渗透压环境中；同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异。
6．菌落总数
粉末培养基不是无菌制剂，培养基本身的营养成分很丰富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延长有效期
7．细胞生长试验
可检查细胞培养基是否有促生长的能力，以及是否有不利细胞生长的毒素。8．细菌内毒素
为满足生物制品细菌内毒素的控制要求，作为生物制品生产原料的培养基同样需要细菌内毒素控制。
9．稳定性
确定产品的储存、运输条件，产品的保质期限。
10．一致性
验证产品的均一性。
十、常见问题解答
选择培养基没有一定标准，有几点建议可供参考：
（1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅文献，或在购买细胞株时咨询。
（2）本单位惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。
（3）根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。
（4）用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最
客观的方法，但比较繁琐。
2．选择便宜的培养基品种成本就低吗？
（1）通常，培养基可以适合多种细胞，细胞也可以在不同培养液中生长；
例如在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生
长。
（2）培养基养份不同会导致细胞生长效果不同，病毒或蛋白表达不同，应该选择效果最好的培养基，考虑生物制品的综合成本；
（3）最终目的是追求生物制品的得率——得率高则成本低。
3．L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的，脱掉氨基后， L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。但L－谷氨酰胺在溶液中不稳定，在高温下会分解成吡咯烷酮和羧酸，也有一些毒降解产物如NH4+会不可逆转地损坏细胞壁。
L-谷氨酰胺在不同温度、不同pH值条件下的稳定性研究如下。
图1 7.6PH不同温度2mM谷氨酰胺的稳定性
20
406080100120
0246810121416182022日期（天）
谷氨酰胺保持量（％）
图2 室温下不同PH时10mM谷氨酰胺的稳定性0
20
40
60
80
100
120
02468101214161820
22日期（天）谷氨酰胺保持量（％）
4．为什么培养基中可以省去酚红？
酚红在培养基中被用来作为pH 值的指示剂，研究表明，酚红可以模拟固醇
类激素的作用（特别是雌激素），为避免固醇类反应，用无酚红培养基。
5．在新鲜培养基中添加了血清和抗生素后，有效期是多长？
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用
它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
6．为什么不要用碳酸氢钠调pH值？
如图所示，培养基pH值随着碳酸氢钠量的增加，呈抛物线增长，当碳酸氢钠加到一定量时，pH变化越来越小。而培养基的渗透压值随着碳酸氢钠量的增加，呈直线增长，碳酸氢钠量越大，渗透压值越大。
如果为了达到工作pH值仅加入少量的碳酸氢钠，而忽略渗透压，一来可能会达不到缓冲效果而引起细胞培养过程中pH值变化较剧烈，二来会使培养基成为低渗溶液，在培养细胞时易造成细胞膨胀破裂；如果为了达到工作pH值而加入大量碳酸氢钠，一来可能会难以达到期望的pH值，二来会使培养基成为高渗溶液，在培养细胞时易造成细胞萎缩。
生产中最好通过实验找到合适渗透压和pH值情况下的碳酸氢钠加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培养基的碳酸氢钠与pH值、渗透压的曲线。
（1） DMEM(HED)培养基
（2） MEM培养基
7．细胞生长质量很好，为什么病毒、蛋白表达量没有提高？
细胞生长质量高是高表达的必要条件。
采用细胞生产的疫苗是体外培养一定量的动物细胞并接种病毒，利用病毒在细胞内增殖，得到预期的病毒抗原，然后制成疫苗。细胞生长质量包括细胞密度和形态，没有好的细胞生长质量就不可能有高的表达量。
但要注意的是，细胞生长质量好、密度厚度大时候病毒接种量也应该相应增大，表达量才会提高，否则前期的高质量细胞培养就可能浪费了。
同时病毒、蛋白的表达、分泌在一定浓度下可能会饱和，因此如欲获得高表达，还须研究合适的收液时间和次数。
8．污染是培养基质量不好引起的吗？
（1）培养基不是无菌产品，但有菌落数量控制。
（2）培养基在使用前通过高压或过滤灭菌。
（3）防止污染应该注意以下事项：
A.从污染的源头开始
●确认工作细胞库是否被污染：用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并
排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。
●确认毒种工作种子批是否被污染：用细菌、真菌及支原体无菌试验来确
认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。
●确认所用培养基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染：
用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养
基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加
入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。
一些单位在使用血清时候往往不经过过滤除菌处理便直接加入到培养
液中，可能带来污染。
●其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效
果；前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、
后进行验证工作（至少应在除菌后进行一次）。
●另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及
孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞（尤其是
细胞库）的污染。
B.从GMP管理、SOP操作方面加强管理力度
●每二周（或每周）对无菌操作室及洁净区域按GMP要求进行检测
●人员的GMP管理和无菌操作强化培训
C.一些特殊情况
●细菌的大小从0.1-700μm，为防止细小细菌的污染，过滤除菌应尽量
采用0.1μm的滤膜或滤芯。
●大面积污染时，应对所有设施、用具及操作环境进行彻底消毒。
9．如何消除组织培养的污染？
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
（2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推
荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
（3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
（6）重复步骤4。
（7）在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否已被消除。
十一、培养基
培养基产品分为细胞培养基、平衡盐、细菌培养基产品。
（一）平衡盐（balanced salt solution，BSS）
1885年Sydney Ringer开发生理盐水发展而来，由无机盐、葡萄糖和水组成。平衡盐通常以其发明者命名，基本平衡盐溶液都是基于细胞需要钠、钾、钙、镁和磷酸盐这5种离子开发而来，只是在离子浓度和盐的形式上有所区别。
平衡盐的主要功能是维持细胞内外渗透压平衡、控制和维持酸碱平衡在生理范围之内、提供能量和代谢所需的无机离子。平衡盐培养基可用于配制培养用液基础液及细胞洗涤液。常用的平衡盐有：
1．Dulbecco,s平衡盐（D-PBS），不含碳酸氢钠；
2．Hanks,平衡盐（HBSS），含碳酸氢钠少，约0.35mg/L；
3．Earle,s平衡盐（EBSS），含碳酸氢钠多，约2.2mg/L；
4．PBS平衡盐，无Ca2+、Mg2+离子。
（二）细胞培养基
1．传统基础细胞培养基及其改良培养基
基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。
据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,?还可补加新成分。?如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。
合成培养基使用时加5-30%血清。
（1） 199细胞培养基及其改良品种
1950年由Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，添加适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。
199（HB）细胞培养基，主要应用于Vero细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗，具有高缓冲性能，能够有效提高病毒滴度。
改良199细胞培养基——199（HB）细胞培养基
狂犬疫苗生产实践证明，199（HB）细胞培养基与传统199细胞培养基
相比，具有以下优势。
a)细胞生长形态好
用199（HB）细胞培养基培养的细胞生长速度相对较快，形态良好。
b)营养液的pH较稳定
用199（HB）细胞培养基配制病毒维持液pH值较稳定，经过3－4天的细胞培养后pH值变化小。
c)病毒原液滴度高
用199（HB）细胞培养基收获的病毒原液相对用199培养基收获的病毒原液平均滴度要高，尤其对二次苗的影响。
注：一次苗、二次苗分别为第一次和第二次收毒。
d)纯化后原液的效力明显提高
用199（HB）细胞培养基培养后，对纯化后原液的效力影响比较明显，对效力有明显提高。
（2） BME细胞培养基
基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle设计，BSS ＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代
细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM
等。
（3） MEM细胞培养基
低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，适合多种细胞单层生长，是一种
最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。
需要注意的是，MEM细胞培养基有含Earle's平衡盐的类型，也有含Hanks'平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有含非必
需氨基酸的类型。生产和科研时，应根据实际情况注意选择合适的MEM细
胞培养基。
另外，因MEM培养基营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。
（4） DMEM细胞培养基及其改良品种
DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克
隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细
胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。
改良DMEM细胞培养基——DMEM（HED）细胞培养基
DMEM（HED）细胞培养基，培养CHO细胞生产乙肝疫苗，具有较强细胞维持能力，可增加收液次数，有效提高蛋白表达率。
生产和试验研究证明，DMEM（HED）细胞培养基在细胞生长和病毒分泌方面均优于使用DMEM细胞培养基。1
a)使用DMEM（HED）细胞培养基细胞贴壁和长满单层时间明显快
于传统DMEM细胞培养基，维持2个月细胞未出现脱落现象。
使用DMEM（HED）细胞培养基，在接种后第2天， 80％细
胞已伸展并开始分裂增殖，第3天已长成较密单层，细胞贴壁1 《应用国产改良型DMEM培养基培养CHO-C28细胞》，中国生物制品学杂志，2003 V ol.16 No.6 P.380-382
均匀，形态清晰，呈多边形和梭形，细胞间略有空隙，细胞数
为7.5 x 106个／ml。在此后转瓶培养的60 d内细胞数保持稳
定，无明显增加和减少，无脱落，无明显形态变化，培养液中
HBsAg滴度稳定在1：128～1：512之间。
而使用传统DMEM细胞培养基，只有30％和40％的细胞伸展，至第4天才长成较密单层，小方瓶与双层转瓶结果相同。
至30 d 时已长成较厚的复层，并开始大片脱落，细胞数明显
减少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此后细胞开始重新
贴壁、增殖，至45 d左右部分细胞长成单层，一部分细胞因脱
落，至60 d时仍未能长满转瓶。
b)分泌HBsAg量明显高于传统DMEM细胞培养基组。
（5） IMDM细胞培养基
IMDM是由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。
（6） RPMI-1640细胞培养基
Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。
（7）Fischer’s细胞培养基
用于白血病微粒细胞培养。
（8） HamF10、F12细胞培养基
1963年、1969年由Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12适用于CHO细胞。（9） DMEM/F12细胞培养基
DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。
2．低血清细胞培养基
血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是必不可少的。大部分的组织培养研究者非常熟悉血清添加物给予基本培养基配方的良好生长支持特征。然而，伴随血清的使用也带来了很多的问题。
●费用因素
生产血清费用高而效率低。小牛血清还必须来源于没有疯牛病、口蹄疫和其它高度传染性疾病的地区。
●差异
所有的血清都是一种成分不确定的混合物，血清批与批之间的组分存在差异。
●传染源
动物血清有可能携带传染源，包括支原体、病毒和有毒物质。任何一种传染源可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险。
●法规问题
为了使与传染源相关的风险减少到最低，存在多个国家间进出口生物材料的国际法规。
为了解决这些问题，清大天一公司开发了多种营养培养基，以最小化和消除与使用动物血清相关的制品安全性问题。
（1）低血清细胞培养基的原理
通常在用传统培养基培养细胞时须加入约10％的小牛血清，低血清培养基是在基础培养基中添加了额外的营养成分，使小牛血清的添加量减少50％到70％，而对于细胞生长、增殖、形态和功能有较小或者没有影响。
（2）低血清培养基的优点
●小牛血清是细胞培养液成本最大的原料，使用低血清培养基明显地
节省培养液成本。
●减少制品纯化损失，提高纯化收率，便于分离纯化。
●减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险。
●提高制品安全性。
●批间差减少或影响降低：
a)血清用量减少可以减少使用批次。
b)血清用量减少使得批间差的影响减少。
细胞在低血清培养基的生长相当或者优于加入10％小牛血清的传统培养基，没有观察到在细胞形态及增殖方面的显著差异。
（3）低血清细胞培养基的应用
VERO细胞、BHK21细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。
5．无血清无动物组分细胞培养基
无血清无动物组分细胞培养基意指以该培养基配制的培养液无须添加牛血清即可培养细胞和维持生长收液，且该培养基成分中不含有任何动物来源成分。
在细胞培养生产生物制品过程中无须添加动物来源成分，避免疯牛病、口蹄疫等传播进入人体，减少人、兽在使用生物制品时的特异性免疫反应、降低产品成本（如降低培养液成本，简化下游纯化工作及提高产品收获量等）。采用生物反应器、无血清无动物来源成分培养基进行细胞培养制药是21世纪生物制药发展趋势；美国FDA和美国农业部已经严格控制在细胞培养中胎牛血清的使用。
同时，高密度细胞培养并长时间维持细胞密度是高表达率和高产量的关键，只能通过无血清悬浮培养技术来实现。
为了获得足够的营养成分，无血清无动物组分细胞培养基中氨基酸含量倍增，另外添加了生长因子和/或细胞因子，以及含有个别蛋白或大量蛋白的组分。
无血清无动物组分细胞培养基通常是特定细胞专用培养基，如无血清无动物组分CHO悬浮细胞培养基适用于CHO悬浮细胞。
6．替代天然培养基
培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。
（三）细菌培养基
细菌培养基为肺炎、流脑等细菌培养疫苗生产专用培养基。用于细菌性疫苗大规模生产中细菌体的培养及实验室中细菌体的研究培养。
目前细菌性疫苗生产厂家及实验室都使用自行配制的培养基进行细菌体的繁殖培养，由于配制工艺的不同、各种培养基组分来源不同，以及培养基中重要活性添加剂来源的质量不稳定性，导致了细菌体繁殖培养的数量和质量不稳定，批间差
细胞工程试题及答案
专题2细胞工程 一、选择题 1.运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种,操作过程中能形成愈伤组织的是( )。 ①植物组织培养②植物体细胞杂交③动物细胞培养 ④转基因植物的培育 A.①②③ B.①②④ C.①③④ D.①②③④ 2.生物技术的发展速度很快,已灭绝生物的“复生”将不再是神话。如果世界上最后一只野驴刚死亡,以下较易成功“复生”野驴的方法是( )。 A.将野驴的体细胞取出,利用组织培养技术,经脱分化、再分化,培育成新个体 B.将野驴的体细胞两两融合,再经组织培养培育成新个体 C.取出野驴的体细胞核移植到母家驴的去核卵细胞中,经孕育培育成新个体 D.将野驴的基因导入家驴的受精卵中,培育成新个体 3.下列关于细胞工程的叙述,错误的是( )。 A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D.某种植物甲、乙两品种的体细胞杂种与甲、乙两品种杂交后代的染色体数目相同 4.用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织,下列叙述错误的是( )。 A.该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的 B.该愈伤组织的细胞没有全能性 C.该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成的 D.该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 5.名为“我的皮肤”的生物活性绷带自从在英国诞生后,给皮肤烧伤病人带来了福音。该活性绷带的原理是先采集一些细胞样本,再让其在特殊的膜片上增殖。5~7天后,将膜片敷在患者的伤口上,膜片会将细胞逐渐“释放”到伤口,并促进新生皮肤层生长,达到加速伤口愈合的目的。下列有关叙述中,不正确的是( )。 A.“我的皮肤”的获得技术属于动物细胞工程 B.人的皮肤烧伤后会因人体第二道防线的破坏而导致免疫力下降 C.种植在膜片上的细胞样本最好选自患者本人 D.膜片能否把细胞顺利“释放”到伤口,加速患者自身皮肤愈合与细胞膜上的糖蛋白有关 6.既可用于DNA重组技术又可用于细胞融合技术的是( )。 A.病毒 B.纤维素酶 C.聚乙二醇 D.质粒 7.培育农作物新品种的过程中,常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是( )。 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 B.在植物组织培养过程中用理化因素诱导可获得大量有益突变体 C.单倍体育种中经减数分裂和组织培养两个过程能获得纯合二倍体 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 8.下列与细胞工程技术相关的表述中,不正确的是( )。 A.植物体细胞杂交技术可以克服常规的远缘杂交不亲和障碍 B.动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分基本相同 C.动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 9.经植物组织培养技术培养出来的植物一般很少有植物病毒危害,其原因在于( )。 A.在组织培养过程中经过了脱分化和再分化,进行的是快速分裂和分化
细胞培养复习题
名称解释 细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。 组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。 器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。 无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。 完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。 接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。 无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。 不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑 细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量 细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞培养综述
细胞培养综述 摘要：为了模拟机体生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。培养出的活细胞具有量大、均一和可重复性的特点，可以通过各种物理、化学、生物等因素进行调控，并且可以通过倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等多样的方法进行研究，已广泛运用在不同科学研究领域。 关键词：分化，细胞分型，生长增殖过程，传代 一、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系[1]。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启
引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为[2]。 二、体外培养细胞的分型 （一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态[3]。 3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
大学细胞工程试题及答案
细胞模拟试题及答案 一、填空（每空一分，共25分） 1.实验室的物理防护是由隔离的设备、实验室的设计、实验实施等三个方面组成，根据其密 封程度的不同，分为P1、P2、P3、P4四个生物安全等级。典型的P4实验室由更衣区、过滤区、缓冲区、消毒区、核心区组成。 2.细胞系是原代培养经初步纯化获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一细胞 群体。 3.细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群。 4.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的增殖特性为缓慢性和自稳性。 5.培养细胞的生长特点为贴附、接触抑制和密度抑制。 6.植物细胞培养的原理是基于动物细胞的全能性。 7.植物细胞悬浮培养的方法为分批培养法、连续培养法和半连续培养。 8.植物组织培养中培养材料的消毒过程中，消毒的基本原则是既要杀死附着其上的微生物又 不损伤材料。 9.细胞生长测定的一般方法为：细胞计数、测定细胞密实体积、细胞鲜重或干重。 10.体外培养的细胞根据其生长方式主要分为贴附型细胞和非贴附型细胞。 11.人工种子的组分包括胚状体、人工胚乳和人工种皮。 12.细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合几 个步骤。其中细胞桥形成是最关键的一步。 13.花粉单倍体植株的鉴定方法有形态鉴定、细胞学鉴定、杂交鉴定、分子标记鉴定。 14.胚胎工程主要是对哺乳类动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育， 获得人们所需要的成体动物。 15.人工诱导单倍体形成的方法包括：远缘杂交、延迟授粉、核置换、射线照射、花药培养等。 二、单项选择题（每题1分，共10分） 1.人参皂甙粉是人参中重要的药用成分，以前只能从人参中提取产量极低，因而价格昂贵。 目前人参皂甙粉可以通过下列哪项技术迅速大量获取（B） A．基因工程 B．植物组织培养 C．植物体细胞杂交 D．发酵工程
高中生物细胞工程试题
阶段质量检测(二) 细胞工程 (时间:4５分钟,满分:10０分) 一、选择题(每小题3分,共45分) 1、下列生物工程技术中,不属于细胞工程得就是( ) A.通过试管动物大量繁殖优良动物 Ｂ.利用含有人胰岛素基因得大肠杆菌生产胰岛素 C.通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D、将某人得肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系 2。下列关于植物体细胞杂交技术得叙述,错误得就是( ) A.获得原生质体得过程需要用到纤维素酶与果胶酶 B.利用植物体细胞杂交可以获得某种多倍体植株 C.植物体细胞杂交过程就就是原生质体融合得过程 Ｄ。可根据细胞中染色体数目与形态得差异来鉴定杂种细胞 3.植物体细胞杂交制备原生质体与动物细胞培养配制一定浓度得细胞悬浮液,所需要得酶依次就是( ) Ａ.淀粉酶与磷脂酶 B.纤维素酶与胰蛋白酶 C.脂肪酶与二肽酶 Ｄ。过氧化氢酶与半乳糖苷酶 ４.下列有关单克隆抗体制备得叙述,正确得就是( ) A.先利用特定得抗原蛋白饲喂小鼠,再从小鼠脾脏中分离B淋巴细胞 B。为避免病毒感染,只能用聚乙二醇、电激等处理来诱导骨髓瘤细胞与已免疫得B淋巴细胞融合 Ｃ.体外培养杂交瘤细胞需要在培养液中添加动物血清与抗生素 D.经过选择培养基初次筛选得杂交瘤细胞即可进行体内或体外培养 5。(全国高考)关于动物细胞培养与植物组织培养得叙述,错误得就是( ) A.动物细胞培养与植物组织培养所用培养基不同 Ｂ.动物细胞培养与植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C、烟草叶片离体培养能产生新个体,小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖 D。动物细胞培养可用于检测有毒物质,茎尖培养可用于植物脱除病毒 ６。细胞工程中,选择合适得生物材料就是成功得关键、下列选择不合理得就是( ) A、选择高度分化得动物体细胞进行培养有利于获得大量细胞 Ｂ。选择胚胎细胞作为核供体进行核移植可提高克隆动物得成功率 Ｃ、选择一定大小得植物茎尖进行组织培养可获得脱毒苗
细胞培养集锦一个培养300多种细胞人的经验总结
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可
生物技术概论试题
生技28、查找阅读有关生物技术的英文文献并翻译成中文一、名词解释 Plasmid 目的基因 单克隆抗体技术 细胞融合 基因库 问答题：
1.疾病基因治疗有哪四大策略，肿瘤的基因治疗主要有哪两种策略？ 2.从cDNA文库和基因文库中获得目的基因有什么不同？ 3.如何从一片嫩叶经组织培养培育出众多的完整植株？ 4.开展干细胞研究对人类有何积极的意义？ 5.为什么说干细胞的应用将具有广泛的前景？ 6.人类基因组计划任务是什么？将解决什么问题？它对医学的发展有什么影响？ 7.生物法处理污水或废水有哪几种常见方法？污水治理的意义何在？ 8.空气污染治理与水污染治理有什么关系，常见的方法有哪几种 9.什么事生物修复技术，方法，举例说明其应用价值 10. 生物技术对经济社会发展的影响，试举例说明。
第二部分综合练习 一、单项选择题 4. 下面哪个不是生物技术包括的基本内容？ 细胞工程基因工程遗传工程酶工程 1、现代生物技术是一项高新技术，它具有高新技术的“六高”特征，下面哪个不属于“六高”？ A、高效益 B、高风险 C、高势能 D、高效率 2、生物技术是以下面哪个为核心？ A、基因工程 B、细胞工程 C、酶工程 D、发酵工程 3、分子克隆主要是指 A、DNA的大量复制 B、DNA的大量转录 C、DNA的大量剪切 D、RNA的大量反转录 4、多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为 A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 5、设计聚合酶链反应的引物时，应考虑引物与模板的 A、5…端特定序列互补 B、5?端任章序列互补 C、3…端特定序列互补 D、3?端任意序列互补 6、用于鉴定转化于细胞是否含重组DNA的最常用方法是 A、抗药性选择 B、分于杂交选择 C、RNA反转录 D、免疫学方法 7、下列哪些是发酵技术独有的特点 A、多个反应不能在发酵设备中一次完成 B、条件温和、能耗少、设备简单 C、不容易产生高分子化合物 D、发酵过程中不需要防止杂菌污染 8、不是工业生产上常用的微生物为 A、担子菌 B、细菌 C、酵母菌 D、霉菌 9、机械搅拌发酵罐与通风搅拌发酵罐相比，下列不属于前者特点的是 A、发酵罐内没有搅拌装置，结构简单 B、发酵罐内有搅拌装置，混合速度快 C、耗能少，利于生产 D、发酵罐内没有搅拌装置，结构复杂 10、从微生物细胞制备酶的流程一般包括破碎细胞、溶剂抽提、离心、过滤、干燥这几 个步骤。
最新细胞工程练习题(附答案)
细胞工程练习题 一．选择题 1. 在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需 要的 A．消毒灭菌B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2. 下列关于植物组织培养的叙述中，错误 ．．的是 A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 3．我国科学工作者曾成功地将分别属于两个科的植物----烟草和菠菜杂交成功，从而获得一种新型的烟草品种。在此过程中，下列操作不．是必需的是 A．杂交前要除去两种细胞的细胞壁 B．原生质体融合前要先脱分化 C．原生质体融合后，要选出烟草----菠菜融合细胞加以培养 D．要诱导愈伤组织进行再分化 4．下图是“白菜—甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是 A．所得到的“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B．愈伤组织是已高度分化的细胞 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂等过程 D．诱导原生质体融合时可用聚乙二醇 5．下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，相关叙述中正确的是 A．②阶段会发生减数分裂过程B．①阶段需生长素而③阶段需细胞分裂素C．此过程体现植物细胞具有全能性D．此兰花的花药离体培养所得植株为二倍体6．下图为将胡萝卜的离体组织在一定条件下培育形成试管苗的过程示意图。有关叙述正确的是 A. 利用此过程获得的试管苗可能为杂合子 B．①②过程中都会发生细胞的增殖和分化 C. 多倍体植株的培育需经过如图所示过程 D．此过程依据的生物学原理是细胞膜具有流动性 7. 各项培育植物新品种的过程中，不经过愈伤组织阶段的是 A．通过植物体细胞杂交培育白菜——甘蓝杂种植株 B．通过多倍体育种培育无子西瓜 C．通过单倍体育种培育优质小麦 D．通过基因工程培育转基因抗虫水稻 8. 作物新品种的过程中，常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 ③ ② ① 四倍体兰花叶片愈伤组织胚状体植株
细胞培养基种类及用途
基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。 据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,?还可补加新成分。?如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。 合成培养基使用时加5-30%血清。 1． 199细胞培养基及其改良品种 1950年Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，广用于各类细胞培养，广泛用于病毒学、疫苗生产。 2． BME细胞培养基 基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMEM等。 3． MEM细胞培养基 低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 4． DMEM细胞培养基及其改良品种 DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖(1000mg/L)、高糖(4500mg/L)。生长快，附着稍差肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 5． IMEM细胞培养基 IMEM由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。 6． RPMI-1640细胞培养基 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养 7．Fischer’s细胞培养基 用于白血病微粒细胞培养。 8． HamF10、F12细胞培养基 1963年、1969年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。 9． DMEM/F12细胞培养基 DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 10． McCoy5A培养基 1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，
细胞工程学相关考试题及答案
细胞工程学名词解释及问答题 一、名词解释 1、细胞工程（cytotechnology或cell engineering）：它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 或应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2、看护培养（nursing culture）：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。 3、细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。 4、外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物组织、器官等材料。 5、人工种子：是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 6、花药培养（anther culture）：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。（指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株，使之二倍化的细胞工程技术。 7、条件培养基(conditioned medium)：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。 8、植物脱毒：由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。 9、原代细胞系：指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。 10、体细胞杂交：指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 11、胚胎培养：是指胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 12、互补选择：是指利用两个亲本具有不同的遗传和生理特征，在特定培养条件下，具有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 13、悬浮培养(suspension culture):是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 14、植板率:植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。 15、玻璃化冻存：是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。 16、接触抑制(contact inhibition)：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。 17、非对称融合（aymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 18、对称融合（symmetric fusion）：两个完整的细胞原生质体融合。 19、胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 20、体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。 21、永久细胞系：大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。
细胞传代培养标准操作规程
细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 （7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 （2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 注意事项： 1.严格的无菌操作。 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
专题2-细胞工程练习题(含答案解析)
第I卷（选择题） 1．利用植物组织培养技术将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，培育的过程中不需要 A. 导入外源基因 B.离体状态 C. 具有完整细胞核的细胞 D.一定的营养物质和激素 2．通过植物体细胞杂交可以获得“烟草—菠菜”——一种新型的烟草品种。下图为培育杂种植株过程的示意图,下列操作不是必需的是( ) A.在融合之前除去两种细胞的细胞壁 B.原生质体先进行脱分化处理再融合 C.原生质体融合后筛选杂种细胞继续培养 D.诱导杂种细胞形成愈伤组织再分化成植株 3．能克服远缘杂交不亲和技术的是( ) A．组织培养 B．细胞融合 C．动物胚胎移植 D．单倍体育种 4．下列有关现代生物科技的叙述中，错误的是（） A．植物体细胞杂交技术克服了不同生物远缘杂交不亲和的障碍 B．动物细胞融合技术开辟了制备单克隆抗体的新途径 C．利用基因工程技术可以使哺乳动物生产人类所需的药品 D．胚胎移植技术的优势是可以充分发挥雄性优良个体的繁殖潜力 5．关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是 A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同 B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C.给予适宜的条件，有的植物可在愈伤组织的基础上直接发育出花器官 D.细胞培养产生出变异的新植株，为选择有益性状的新作物创造了条件 6．利用生物工程技术能够实现对良种种畜的快速大量繁殖，以下哪项技术不具备此优点？ A．基因工程技术 B．细胞核移植技术 C．胚胎分割技术 D．试管动物技术 7．在细胞工程——植物体细胞杂交中，需要将营养细胞的细胞壁除去，通常是采用纤维素酶和果胶酶的酶解破壁法处理。如将去掉了细胞壁的成熟植物细胞置于清水中，细胞将（） A．皱缩 B．胀破 C．呈球形 D．保持原状 8．在生物体内，细胞没有表现出全能性而是分化为不同的器官，其原因是 A. 细胞丧失了全能性 B. 不同细胞中遗传信息的执行情况不同 C. 不同的细胞中遗传信息不完全相同 D. 在个体发育的不同时期，细胞内的遗传物质发生了变化 9．下列有关植物组织培养的叙述，正确的是（） A．植物组织培养没有体现植物细胞的全能性 B．二倍体植株的花药经植物组织培养后得到稳定遗传的植株 C．用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子 D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl的培养基培养筛选而获得
细胞培养知识
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培
养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
细胞培养合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。 一、基本组分 基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 ●无机盐：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 ●氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50％，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。 ●维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、 D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C 也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。 ●碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含 的能源物质。 ●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明，体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸，这降低了营养物质的代谢效率，降低培养基pH值，增加渗透压。在氧气供给不足的情况下，NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+，细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+，从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足，细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。 在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，其能量代谢通路与体内完全不同，表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量，谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径，另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此，适当的调整细胞内的代谢途径，使之能促进细胞的快速生长和产物合成，同时减少代谢抑制物的生成是行之有效的一种策略。 许多动物细胞如CHO、BHK和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言，二者的快速利用并非细胞必需；相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是两种主要代谢废物，其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累，是大规模细胞培养技术研究的重要方向。 氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。 ●除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入酚红（当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于 8.4呈红色），一种pH指示剂。 ●在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。 二、常用细胞培养基 (1).MEM细胞培养基系列 (2).DMEM细胞培养基系列 (3)RPMI-1640细胞培养基系列
细胞培养的注意事项
相关疾病： 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? 早走早脱身，从此专注黑生物 1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。 3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。 5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 非科班出身经验分享 1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。 2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。 5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天
细胞培养技术和培养箱习题
第十章细胞培养技术和培养箱 首页习题习题参考答案 习题名词解释选择题简答题 一、名词解释 1. 细胞培养 2. 细胞培养传代 3. 原代细胞培养 4. 无限细胞系 5. 细胞融合 6. 细胞治疗 7. 培养箱 8. 缓冲室 9．手套操作箱 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1.体外培养细胞的分类（贴附型或悬浮型）是根据（） A．细胞为上皮样或成纤维细胞样 B．能否贴附在支持物上生长 C．呈密度抑止特性 D．肿瘤细胞 E．细胞可多次传代 2. 下述细胞传代的概念中，正确的是（） A．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器的过程 B．从体内取出细胞接种到培养容器，细胞继续增殖的过程 C．培养细胞期间更新培养液的过程
D．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器并及时更新培养液使细胞增殖继续的过程 E．细胞倍增的过程 3. 细胞生长维持液，需添加的血清量的百分比为（） A．1％～2％ B．2％～5％ C．5％～10％ D．10％～20％ E．20％～25％ 4．培养细胞传代时，通常是（） A．根据不同细胞采取不同的方法 B．常用二乙烯四乙酸二钠（EDTA） C．EDTA与胰蛋白酶按不同比例混合使用 D．悬浮生长的细胞直接添加胰蛋白酶” E．贴壁生长的细胞添加新鲜培养液 5. 二氧化碳培养箱结构的核心部分，主要是 A．湿度调节装置 B．湿润的含水托盘 C．温度调节器 D．CO2调节器、温度调节器和湿度调节装置 E．气体保护器装置 6. 二氧化碳培养箱调节CO2浓度范围为（） A．0％～20％ B．20％～40％ C．10％～20％ D．20％～30％ E．30％～40％ 7. 厌氧培养箱通过自动连续循环换气系统保持箱内的厌氧状态，其换气过程是（） A．①气体排空→②净化→③气体排空→④N2净化→⑤气压平衡 B．①气体排空→②N2净化→③气压平衡