血液病融合基因检测的质量保证
【CN109593861A】不同位点白血病MEF2DBCL9融合基因寡核苷酸的检测方法及检测试剂盒【
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910118948.X (22)申请日 2019.02.18 (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南 路1023号-1063号 (72)发明人 李玉华 胡宇行 常宁 贺艳杰 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 范盈 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 不同位点白血病MEF2D-BCL9融合基因寡核 苷酸的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明是一种用于检测不同位点白血病 MEF2D -BCL9融合基因检测方法及试剂盒，包括检 测体系PCR反应液、引物对、探针、阳性对照品和 阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针 技术检测患者体内MEF2D -BCL9融合基因的表达 情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴 定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特 点。 权利要求书2页 说明书7页序列表3页 附图2页CN 109593861 A 2019.04.09 C N 109593861 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109593861 A 1.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的检验试剂盒，所述检验试剂盒中包括检测用引物、探针，其特征在于： 检测目的基因用上下游引物分别为：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中， 序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 221-1055-F:GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.10 221-1055-R：ACCTGAAATTCGAGGATTCTGTGT SEQ ID No.11 221-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCCCTGTTGGAA-BHQ1 SEQ ID No.12 ABL1-F:GTGAGTGACATAGCCTCATGTTC SEQ ID No.13 ABL1-R:GCAGGCGTGCTCGTGAAAT SEQ ID No.14 ABL1-Probe:Quasar670-TCAGGGAGGGTTAGGAAAACCAC-BHQ-plus SEQ ID No.15。 2.根据权利要求1所述的检验试剂盒，所述检验试剂盒中还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照品为含有MEF2D-BCL9 Variant 1，MEF2D-BCL9 Variant 2，MEF2D-BCL9 Variant 3，MEF2D-BCL9 Variant 4；所述阴性对照品为去离子水。 3.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中，序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 2
血液病中的融合基因
一、Ph染色体相关白血病的检测 Ph染色体最初在慢性粒细胞性白血病（CML）中发现，其发生率达到90%以上，成为慢粒的细胞遗传学标志。该染色体是由于第9号染色体长臂3区4带（9q34）和22号染色体长臂1区1带（22q11）相互易位所致，其后果使位于9q34的原癌基因C-ABL和位于22q11的BCR基因发生融合，形成BCR-ABL融合基因，并表达为BCR-ABL融合mRNA，翻译成融合蛋白质。20世纪70年代以来，在部分急性淋巴细胞白血病（ALL）中也发现有Ph染色体，占ALL的5%（儿童）～25%（成人）。近年来由于PCR技术的不断发展，对Ph染色体阳性白血病的诊断和残留白血病细胞的检测有了很大的进展。 应用筑巢式逆转录酶/多聚酶链反应技术（RT/PCR）检测BCR—ABL融合基因转录本，发现了3种BCR-ABL异构体，这种异构体的形成是由于BCR基因断裂点的位置不同所致。慢粒患者在BCR基因的断裂点主要集中于经典的bcr区域，即M-BCR区域，而伴有Ph染色体急性白血病中，约50%的患者BCR基因断裂点与慢粒患者相同，而另50%患者的断裂点位于BCR 基因的第1个内含子，ABL基因的断裂点主要位于第1或第2个内含子，第22号染色体的断裂点位于M-BCR2内含子，即M-BCR第二外显子与ABL基因第二个外显子相融合（简称b2a2转录本）。如果断裂点于M-BCR第三外显子即形成b3a2转录本，如果BCR基因的断裂点位于基因的第一内含子，则形成e1a2转录本，后者主要见于Ph染色体阳性的急性白血病患者。 二、急性早幼粒细胞性白血病的检测 急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中95%以上具有特异的染色体易位t（15；17）（q22；q21），易位的结果使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维A酸受体α（RARα）基因形成PML-RARα融合基因转录本。由于该融合基因对APL具有高度特异性，因此可以作为APL诊断的分子标志。近年来各国科学家有在少数APL患者中陆续发现了变异型染色体易位t（5；7）、t（11；17）、dup（17）形成的NPM-RARα、PLZF-RARα、NμMA-RARα、STATSB-RARα融合基因，这对进一步研究APL的发生机制具有重要意义。同时在APL患者的鉴别诊断和治疗上具有积极的意义。 三、急性粒细胞性白血病（M2b）的检测 急性粒细胞性白血病（M2b）型患者中90%存在特异的t（8；21）（q22；q22）染色体易位，伴该染色体易位的白血病细胞具有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性和嗜酸性细胞，且对化疗反应较敏感。目前已经发现该染色体易位使8号染色体的ETO/MTG基因和21号染色体的AML1基因融合形成AML1-ETO融合基因，从而导致产生AML1-ETO嵌合转录子，这种异常转录因子有可能参与造血系统恶性肿瘤的发生，因此检测该融合基因转录本对急性粒细胞性白血病（M2b）型患者的诊断、微小残留病变监测等具有重要意义。 四、AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv（16）导致CBF-MHY11融合基因的检测 近年来的研究发现在AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv(16)（p13；q22）的结果使16号染色体长臂的CBF（核心结合因子）β链基因和短臂的MYH11基因发生融合，形成两种形式的融合基因，即CBFβ-MHY11和MHY11-CBFβ融合基因，其中前者对M4Eo的致病可能更为重要。研究结果提示CBFβ基因的断裂点恒定于靠近3′端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，同进这些重排仍然保持融合基因转录本的开放阅读框架。与其他类型的白血病发生的分子机制相似，CBFβ-MYH11融合蛋白的产生将促使白血病的发生。特别有意义的是，本型白血病中的inv（16）与急性粒细胞性白血病（M2b）型中的t（8；21）（q22；q22）染色体易位分别累及CBFα和β链，进一步说明了转录因子异常在白血病发病机制中的特殊地位。 与用PCR检测CBFβ-MYH11融合基因时，必须检测所有可能的CBFβ-MYH11融合基因转录
植物及其产品转基因成份检测抽样及制样方法征求意见稿
SN/T1194—×××× I ICS SN 植物及其产品转基因成份检测 抽样及制样方法 Methods of sampling and preparation of samples for detection of genetically modified components in plants and their derived products （征求意见稿） 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布
SN/T1194—×××× II 前言 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布。 本标准代替SN/T1194-2003《植物及其产品转基因成份检测抽样和制样方法》。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曹际娟、郑江、陈红运、黄新、陈颖、朱水芳。 本标准系代替了SN/T1194-2003。
SN/T1194—×××× 植物及其产品转基因成份检测 抽样和制样方法 1 范围 本标准规定了植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样方法。 本标准适用于植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 0798 进出口粮油、饲料检验检验名词术语 SN/T 0799 进出口粮油、饲料检验检验一般规则 SN/T 0800.1 进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法 SN/T 0952 进出口商品抽样检验程序孤立批计数抽样批不合格品率的估计及样本量的选（适用于批量较大的情形） GB/T 10111 随机数的产生及其在产品质量质量抽样检验中的应用程序 GB/T19495.1 转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法 3 定义及术语 3.1 定义 转基因植物 Genetically Modified Plants 指用基因工程技术或者现代生物技术改变基因组构成的植物。 3.2 术语 本标准采用SN/T 0798中的一般术语以及GB/T19495.1、GB/T19495.7中的术语。 4 总则 4.1 一般规定 4.1.1 抽取及制备的样品应具有代表性。 4.1.2 应确保抽样器具清洁、干燥、无异味，抽样、制样器具及样品容器所用材质不应对待抽取样品造成污染。 4.1.3 为避免交叉污染，尽可能使用不同的抽样和制样器具或设备抽取和制备不同交付批的样品，盛装样品的容器或包装应尽可能一次性使用。如果不能做到（例如使用机械取样设备时），则应在抽取和制备一个交付批的样品后使用适当方法清洁所有器具和设备。 4.1.4 在所有抽样过程中应避免样品散落，防止有活性的生物污染生态环境。 4.1.5 应在物理隔离的区域制备样品，防止对其他区域或实验室的污染，并应及时清洁制样区域。4.1.6 必要时使用DNA销毁剂处理抽样和制样器具和设备、样品容器及制样区域。 4.1.7 适用时，应参照GB/T 1949 5.1《转基因产品检测通用要求和定义》中的规定防止污染。 4.1.8 抽样时应注意保护样品，抽样器具和样品容器应存放于清洁的环境中，避免雨水和灰尘等外来物引起的污染。 1
白血病融合基因
白血病融合基因Last revision on 21 December 2020
bcr/abl融合基因 慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。 基因结构 人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。abl蛋白参与细胞周期调节。在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。 bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML 和非典型CML的诊断指标。
陆道培血液·肿瘤中心简介
陆道培血液·肿瘤中心简介 燕达国际医院陆道培血液·肿瘤中心，是一所以诊断和治疗血液系统疾病及恶性肿瘤的专科医院，成立于2001年11月。医院以著名的血液病和造血干细胞移植权威、中国造血干细胞移植的奠基人与不断推动者、中国工程院院士陆道培的名字命名，汇聚国内外血液病诊治领域的高级医疗人材，努力为来自国内外的广大血液病患者提供一流的医疗救治和护理。目前拥有床位二百余张，百级洁净层流病房数十间，设有造血干细胞移植科、免疫治疗科、普通血液科，分为五个病区。拥有全方位的血液病诊断及治疗技术，包括造血干细胞移植、免疫治疗、血液病相关特殊检验、化疗、中西医结合治疗等。 陆道培血液·肿瘤中心 造血干细胞移植是道培血液病·肿瘤治疗中心的主要特色，我院移植中心能开展同胞异基因造血干细胞移植，非血缘关系造血干细胞移植/脐血移植，配型不合的单倍型移植，同基因移植（双胞胎）和自体移植。除了国际上的常规方法，医院还在预防、处理移植并发症、白血病复发、移植物抗宿主病（GVHD）的防治和控制感染等方面具有许多成功和独创的经验。每年开展配型不合的异基因造血干细胞移植（包括单倍型移植）的数量居全国之首，其中多为难治、复发等高危险性病例，九年来施行异基因造血干细胞移植达1000余例，植入成功率99.67%，总体生存率70%。是中华骨髓库非血缘供者的定点移植和采集医院、台湾佛教慈济造血干细胞中心和美国骨髓库的定点移植医院。我国捐献到境外的造血干细胞均在道培血液病·肿瘤治疗中心采集，采集造血干细胞的质量受到境内外同行的一致好评。
陆道培院士 道培血液病·肿瘤治疗中心对于急性早幼粒细胞性白血病的治疗有独到的治疗技术，达到“百不失一”的要求，即收治后24小时内如不死亡，不允许出现早期死亡。其采用砷剂、维甲酸和化疗联合治疗，所有初治及复发患者均获得血液学完全缓解，诱导缓解率为100%，大多数病例获得细胞遗传学和分子学缓解。5年无病生存率为94%，患者的生活质量很高。据随访统计，来院初治且坚持该治疗方案者3年无白血病生存率达到90%以上，明显高于国际水平。通常，患者大多数时间不需要住院，在家服药即可，不仅大大减少了治疗费用，而且患者生存质量得到明显提高。在第49届美国血液学会年会上，道培医院关于急性早幼粒细胞白血病（APL）的临床研究被选为会议发言，其独具特色的APL治疗所取得的临床成果受到国际社会的瞩目。 作为血液病专科医院，陆道培血液·肿瘤中心免疫治疗、血液病相关的特殊诊断等也在业内独树一帜，并且在预防、处理移植并发症、白血病复发、移植物抗宿主病（GVHD）的防治和控制感染方面具有许多成功和独创的经验。迄今为止，医院已为100余例急性白血病患者开展了免疫治疗，临床长期无病生存率达60%以上，受到国内外专家的好评。 与血液病治疗相配套，道培血液病·肿瘤治疗中心特殊检验中心拥有全国顶尖的实验室检测和诊断治疗技术，拥有细胞形态学及细胞化学、细胞及分子遗传学、免疫学、分子生物学检测技术，此外还有HLA配型实验室、细胞冷冻实验室、正常及恶性细胞及基因库、病毒基因检测实验室、GLP细胞培养室等，除了可以进行临床检测外，还开展了多方面的实验室研究。率先开展的研究项目填补了很多国内血液病实验技术领域的空白。目前特殊检测中心可同时筛查100多种白血病基因，可检测人类T细胞白血病病毒、出血性膀胱炎相关病毒；针对每个白血病患者采用个性化的免疫学检测方案，大大增加了残留恶性细胞的检出率；对移植后患者体内供受者基因检测的敏感性已达到1%。2006年道培血液病·肿瘤治疗中心特检中心和北大、美国佛罗里达大学一起向国家科技部申报了2007年国际科技合作计划重点项目，获得重大资助，其研究成果将可转化为适用于临床的诊断与治疗技术。临床大夫这样评价：“在道培医院，每一项实验的成果几乎都能应用到临床。转化的效率之高、效果之好，在国内医院中尚属首家。”
白血病融合基因检测综述
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白血病相关融合基因的检测及意义 白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。 白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。 BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。 Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年O`Riordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley 发现缺失下来的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22） （q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。 BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码 P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融
血液病诊疗常规
一、急性白血病 一．分型 1．急性非淋巴细胞白血病ANLL (M0~M7) 2．急性淋巴细胞白血病(L1~L3) 二．典型病史 起病急缓不一。急者可以是突然高热，类似“感冒”，也可以是严重的出血。缓慢者常为面色苍白、皮肤紫癜，月经过多或拔牙后出血难止而就医时被发现。 三．典型体征及查体 贫血、发热、出血；淋巴结和肝、脾肿大；胸骨下段压痛等。 四．辅助检查 1．常规（3次）+血型，尿常规，便常规+潜血 2．肝、肾功，心肌酶谱，血脂，血糖，各种离子 3．DIC/凝血四项 4．骨髓穿刺、融合基因、染色体检查 5．肝胆脾彩超、胸片、心电图 五．诊断依据 1．有贫血、发热、出血的表现，伴淋巴结和肝脾大，胸骨压痛。 2．血象多为白细胞增多，可见幼稚细胞，红细胞和血小板少。 3．骨髓增生明显活跃，主要为白血病原始细胞。 六．鉴别诊断 1．骨髓增生异常综合症：骨髓中原始细胞小于30% 。 2．巨幼细胞贫血：骨髓中原始细胞不增多，幼红细胞PAS反应常为阴性。 3．急性粒细胞缺乏症恢复期：骨髓中原、幼粒细胞增多，但该症多有明确的病因，血小板正常，原、幼粒细胞中无Auer小体及染色体异常。 4．某些感染引起的白细胞异常：如传单，百日咳、风疹等病毒感染，血象中淋巴细胞增多或出现义霖，但骨髓象原始幼稚细胞均不增多。 七．治疗 1．一般治疗：1)紧急处理高白细胞血症：羟基脲口服；必要时使用血细胞分离机。 2）防治感染 3）成分输血支持 4）防治尿酸性肾病：嘱患者多喝水，口服别嘌醇0.1日三次。 5）维持营养 2．抗白血病治疗：ANLL: DA /MA /HAD/ HA ALL: VDLP/VDAP/VDCP M3: 亚砷酸/维甲酸 CNS-L: 鞘内注射Ara-C+MTX 每周2~3 次 3．骨髓移植 二、慢性粒细胞白血病 一．分期
正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测
2009年4月第47卷第11期·论著· 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AM L）是一种以造血干/祖细胞获得性突变为特征的恶性克隆性疾病，大约55%的成人病例在诊断时出现非随机的克隆性染色体异常，儿童病例的检出率更高，但正常核型检出率在AM L中达到40%～47%[1]。染色体畸变能在转录水平干扰造血调控、影响髓系细胞分化，因此快速、简便地获得患者染色体遗传缺陷的信息是临床亟待解决的问题。本研究采用多重RT-PCR方法一次可同时检测29种基因重排，提高了隐匿性染色体易位的检出率，用于初诊时的筛选，对临床分型、预后判断及指导个体化治疗具有重要价值。 1材料与方法 １．１对象 选取2006年1月～2008年11月山西医科大学第二医院及山西省儿童医院血液科门诊或住院AM L初治患者60例，男30例，女30例，年龄1～70岁，中位年龄35岁。所有病例均经临床、形态学、免疫学和组化染色确诊，分别为M1、M2、M3、M4各12例，M5、M6各6例。所有病例均进行了染色体核型分析。 １．２方法 1.2.1试剂和仪器TRIzol试剂盒购自美国Gibco/BRL公司；AM V逆转录酶、RNAsin、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司。PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。 1.2.2细胞总RNA的提取和逆转录反应全部病例于初诊化疗开始前采取骨髓标本2～3mL，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，按Trizol一步法提取细胞总RNA，分光光度计测定A260值、A280值，以AM V逆转录酶系合成cDNA。引物序列参照文献[1]方法设计。逆转录广泛表达的转录因子（E2A）mRNA为内对照。1.2.3多重巢式RT-PCR两轮均平行设置8组含有混合引物的多重PCR，同时检测29种染色体易位和畸变所形成的86种剪接形式。每组检测的融合基因包括：第Ⅰ组inv（16）的CBF/M YH11；t（X；11）的M LL/AFX；t（6；11）的M LL/AF6；t（11；19） 正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测 赵瑾1*周永安1△苏丽萍1武坚锐2王恺1解菊芬1马莉1石磊3 （1.山西医科大学第二医院血液科；2.山西省儿童医院检验科；3.山西医科大学第二医院风湿科，太原030001） [摘要]目的探讨急性髓系白血病（AM L）患者染色体畸变所形成的易位相关融合基因的临床和实验的关系。方法采用多重巢式RT-PCR方法和染色体核型分析技术对60例AM L患者的融合基因进行分析。结果18例（30%）正常核型的AM L 患者分别检测出有PM L/RARα、AM L1/ETO、TLS/ERG、CBFβ/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因的存在。结论多重巢式RT-PCR技术可用于白血病患者初诊时染色体畸变的筛选，可在核型正常的AM L患者中检出隐匿的染色体易位，对AM L 的诊断分型具有重要帮助，进一步指导临床个体化治疗。 [关键词]急性髓系白血病；融合基因；多重RT-PCR；正常核型 [中图分类号]R733.7[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）11-11-03 Det ect ion of Fusion Genes in Acut e Myeloid Leukemia Pat ient s wit h Nor mal Kar yot ypes ZHAO Jin1ZHOU Yongan1SU Liping1WU Jianrui2WANG Kai1XIE Jufen1MA Li1SHI Lei3 1.Department of Haematology，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University； 2.Children's Hospital of Shanxi； 3.Department of Rheumatism，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University，Taiyuan030001 [Abst r act]Object ive To investigate the fusion genes derived from chromosome structural aberrations in patients with acute myelocytic leukemia determined by multiplex RT-PCR and explore its potential clinical significance in diagnosis，treatment and prognosis evaluation. Met hods Bone marrow samples from60patients were analyzed with a novel multiplex nested RT-PCR and examination for chromosome karyotype.Result s5types of fusion genes such as PM L/RARα，AM L1/ETO，CBFβ/M YH11，TLS/ERG，M LL/AF9were detected in18（30%）patients with normal karyotypes by multiplex RT-PCR.Conclusion M ultiplex RT-PCR technique can quickly screen chromosome structural aberrations in patients with newly diagnosed leukemia.It is useful in detection of fusion genes in acute myeloid leukemia（AM L）with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis，help us to improve classification of the leukemia types of M ICM and to direct individulized chemotherapy. [Key Words]Acute myeloid leukemia；Fusion gene；M ultiplex RT-PCR；Normal karyotype *山西医科大学硕士研究生在读 △通讯作者 CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生11
转基因植物的检测与鉴定
收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #
食品中转基因成分检测
食品中转基因成分检测 第4章 DNA提取和纯化 M.Somma
目录 第４章 DNA提取和纯化 引言 3 提取方法 4 纯化方法 4 CTAB提取和纯化方法 6 分光光度计测定DNA含量9 分光光度计测定DNA的原理9 核酸浓度测定10 实验12 参考文献16
引言 在所有重组DNA技术和大多数分子生物学研究中，核酸的提取和纯化是实验的第一步。核酸提取方法研究的目的，是为了从不同来源的材料中获得高纯度的核酸，以便于利用聚合酶链式反应 (Polymerase Chian Reaction, PCR) 进行转基因品系的特异性分析。核酸的质量和纯度是PCR分析的关键因素之一。获取高纯度的核酸，避免抑制污染物，需要选择合适的DNA提取方法。表1列出了在PCR检测中可能抑制反应效率的污染物。为了防止由于样品中PCR抑制物的存在导致出现假阴性结果，强烈推荐设置一个对照实验以测试PCR抑制作用。基于此目的，一般采用植物特异性(真核或叶绿体) 或种属特异性的PCR检测。 表1. PCR反应过程中的一些抑制物 抑制物抑制浓度 SDS > 0.005% 苯酚> 0.2% 乙醇> 1% 异丙醇> 1% 乙酸钠> 5 mM 氯化钠> 25 mM EDTA > 0.5 mM 血色素> 1 mg/ml 肝磷脂> 0.15 i.m/ml 尿素> 20 mM 反应混合物> 15% 目前有许多种核酸提取和纯化技术，一般基于以下准则来选择最适宜的提取纯化技术：z目标核酸 z来源生物 z起始材料(组织、叶片、种子、加工过的材料等) z对结果的要求(产量、纯度、纯化所需时间等等) z下游应用 (PCR、克隆、标记、印迹、RT-PCR、cDNA合成等等)
bcrabl融合基因荧光定量rtpcr诊断试剂盒说明书
PML/RARα融合基因荧光RT-PCR诊断试剂盒 一、试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因的情况, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RARα融合基因。因此检测PML/RARα融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪残余白血病细胞的主要依据。 二、试剂盒组成(20人份) RNA提取液（20ml /瓶）1瓶Taq酶（40μl /管）1管 反应液I （165μl /管）1管定量标准品（50μl /管）8管 反应液II （165μl /管）1管DEPC H2O （500μl /管）1管 反应液Ⅲ（350μl /管）1管去离子水（1100μl /管）1管 逆转录酶（25μl /管）1管 三、检测步骤 1．标本采集 抽取外周血5ml抗凝后密封送检，或3ml新鲜骨髓标本密封送检。 2．标本处理 将5ml抗凝外周血或3ml骨髓加入等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入RNA提取液，充分混匀。室温静置5分钟，加入氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃静置2-3分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，离心后反应管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4℃静置10分钟，然后4℃，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA 沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，加入400μl 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10分钟。(注：75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，测A260-A280处的吸光值，并计算RNA含量。 3．逆转录反应：取灭菌离心管, 按以下要求配备逆转录体系 反应液I 逆转录酶模板（RNA）DEPC H2O 总反应体积 μl 1μl 2μg（或5μl）μl 20μl 反应条件：37℃水浴60分钟。 4．第一步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备PCR体系 反应液II Taq酶模板（cDNA）去离子水总反应体积 μl μl 5μl 13μl 25μl 反应条件：94℃→4分钟预变性, 然后按94℃30秒→54℃30秒→72℃60秒, 共做20个循环。 5．第二步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备实时定量PCR体系 反应液ⅢTaq酶模板（PCR产物）去离子水总反应体积 14μl 1μl 5μl 30μl 50μl 注：每次实验取105、10６、10７、10８一组阳性标准品瞬时离心上机即可 反应条件：93℃→2分钟预变性, 然后按93℃45秒→55℃60秒, 共做40个循环。 6．结果分析条件的设定与判定
转基因材料的检测
转基因材料的检测 —转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测 摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号 转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产，经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]，为保护消费者的知情权和选择权，多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识，如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%[2]，韩国为3.0%[3], 日本是5%[4]等，而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度。我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识[5]，为了适应对转基因产品的标识要求，已经建立了一系列的检测方法，
以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[6]。 转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化[7]。 本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出几个适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜“华农1号”以及待测样品DNA为模板进行PCR扩增，鉴别待测样品是否为转基因材料。 1 材料与方法 1.1 材料 华农1号 野生型木瓜 待检测样品 1.2 方法 1.2.1 DNA提取 1.2.1.1 称取0.5 g的植物叶片，搁置于研钵中，加入液氮，捣碎叶片。