腺病毒包装注意事项
在293细胞中大量扩增腺病毒
一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011～3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L 培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同
步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：
1 在100mm 培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106293 细胞。
2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为5。
3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次，37℃CO2 孵箱中培养90 分钟。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培养72 小时，这时在10ml 溶液中大约有5×109～5×1010个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞，600×g 离心 5 分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
1 -20℃/37℃冻融3 次。
2转入15ml 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。
3 3 个175cm2培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。
4 将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃动混匀3 次，370C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。此时MOI 值约为25。
5 加入DMEM5%至30ml。
6 再培养48～72 小时。此时10ml 培养液病毒量约为3×1010～3×1011。若需要，进行MOI 测定以估计病毒滴度。
注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。600×g 离心 5 分钟收集细胞，弃上清，加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。
12. 移入50ml 离心管中，台式离心机上最大速率离心10 分钟，取出上清保存。
13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入107 293 细胞。
14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3 次混匀，370C 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。
15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16. 再培养48-72 小时，此时约有3×1011～3×1012个病毒。若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度。
如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。-200C /370C 冻融3 次，离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011vp/ml。然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA 产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA 产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4 轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒，那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。
如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。
2.5.2 转染
具体操作按TransFastTM Transfection Reagent（Promega）的操作手册进行。转染在24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的新生牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×105个细胞/mL，在24孔细胞板上每孔接种1.0mL，5%CO2、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入200μL 37℃预热的OPTI-MEM无血清培养基（或不含血清的DMEM），然后加入1.0μg的DNA，混匀后加入3.0μL的TransFastTM Transfection Reagent（使lipid∶DNA的体积/μL与质量/μg比为1∶1）后立即涡漩，在室温温育TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物l0～15min；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h后，轻轻加入1.0mL 37℃预热的完全生长液（或使血清浓度降到2～6%），把细胞放入二氧化碳培养箱，37℃培养7～14d。
2.5.3 重组腺病毒的收获与增殖
当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，－20℃冻
存收获病毒。冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM），增殖病毒。
线性DNA转染只有在包装成病毒后才能表达GFP，至少也得5d左右
一般短时间病毒可以保存在-20度，但是病毒最好在-80℃保存，特别是纯化之后。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4% sucrose）病毒会持续1-2年稳定性；病毒不能反复冻融；建议不要在-20℃下长期保存。
病毒在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但通常比在缓冲液中更加稳定。可以在DMEM 中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。
病毒在DMEM中可以反复冻融30次以上而滴度不会下降，在经过纯化的病毒的情况下，使用缓冲液存储于-80℃下滴度就会至少下降一个数量级（视保存缓冲液而定）。缓冲液和精确的PH值对于滴度的保存是很关键的。最佳的保持稳定性的储存方法建议使用以下缓冲液：Tris 10mM ,pH 8.0, 2 mM MgCl2 ，4% sucrose
一般转染后几天之内可以看到零星、散在的荧光，在转染后5d以后，如果有腺病毒包装，由于其感
染周围的细胞，那么会在腺病毒包装的地方看到荧光数增加，聚集成一团的样子。随着时间的延长，整个视野荧光数会逐渐增多。
转染后荧光数不增加或不明显，这与病毒包装的过程有关。如果包装很快，那么很快就能看到明显的荧光。毕竟不同转染条件、不同目的基因，包装速度是不一样的。如果细胞没有CPE，细胞状态好的话，可以尽可能地将时间延长，一直维持就可以。有时候第一代都看不到明显的CPE，等细胞不能维持时，冻融再接一代有时就明显了。
刚转染之后也能看到散在的荧光，包装成功是能看到成团的荧光，当然CPE是最确切的证实。能否包装成功与目的基因也有很大关系，据不完全统计，在腺病毒包装公司，大约有将近10%是不能成
功的。当基因对腺病毒有害时常常会出现这种情况。时间长短与你的转染量、转染效率、基因都有关系。
CPE的具体表现为：细胞变圆、脱落，形成空斑。有时候第一代很难看到，最后时间长了，与对照细胞差别不大，往往病变难以确定，需要传代一次才会变得明显。
液体变黄是正常的，只要感觉细胞还行就可以。这个过程一般不需要换液，细胞好可以维持12d都可以。如果觉得不能维持了，可以换液，因为此时上清的病毒很少（多的话，早就有CPE了）。即使
到后来，也是细胞中的病毒量高。
我的质粒提取方法
重组质粒的小量提取
1.挑取转化DH5a的单个菌落，接种于盛有3.0mL的含50μg/mL（或加倍）氨苄青霉素的LB培养基的试管中，37°C 220rpm过夜振荡培养（一般12-16h，如果浓度低可适当延长时间）；
2.取1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体（我一般重复2次，也就是3ml离心在一个EP 管；试剂盒提我重复4次，也就是说6ml过一个柱子）；（不用担心裂解不开）
3.完全弃去上清后加入300μL 4℃预冷的溶液I（50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA）重悬细菌；
4.加入新配制的溶液II 300μL（0.2mol/L NaOH；1%SDS），缓慢颠倒离心管数次，将离心管置于冰上；
5.加入225μL用冰预冷的溶液III（5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5Ml），盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3～5min；
6.12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；
7.加入1-2μL RNase A（10mg/mL），37℃作用30min或延长至60min；
8.加入600μL的酚∶氯仿，颠倒混匀后置室温5min，12000rpm离心5min；
9.取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；
10.12000rpm离心l0min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30μL双蒸水溶解；
11.琼脂糖凝胶电泳分析。
转染后48h看不到荧光也算是正常的，但是细胞第7天就死亡肯定是不正常的。是不是转染量过大，
导致脂质体太多，对细胞的毒性太大造成的，或者是细胞状态不好，没有转染的细胞对照是不是好的呢？
1）pacI酶切线性化的体系可以参照一般的酶切体系，我一般是30ul，效果挺好。可以放大到50ul，但不宜过大，使得酶浓度降低；也不宜过小，以免有些成分抑制酶切。一般在酶切3h（或者更长）后，取几微升（如3ul）与没有酶切的质粒一起跑电影，一看是否切成了2条带，二看质粒的带型还有没有，如果质粒的带子不见了，全部切成了大片段和小片段2条带，就认为酶切完全，此时可以再延长酶切一段时间。
2）50-70%汇片指的是细胞融合度在50-70%，这些都是凭感觉，时间长了就掌握了。50-70%指细胞间隙还是比较大的，不知道你用的什么转染试剂，好像没见要求密度这么小的。
3）不同转染试剂的步骤一般都不一样，一般参考说明书就行。条件允许，可以多转染几个孔，采用不同的细胞稀释度进行转染。脂质体与DNA的比例一般采用推荐的就可以，当然也可以先用GFP 质粒摸索一下。
这是我用的TransFastTM Transfection Reagent（Promega）的步骤：
2.5.2 转染
具体操作按TransFastTM Transfection Reagent（Promega）的操作手册进行。转染在24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的新生牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，在24孔细胞板上每孔接种 1.0mL（这个地方可以灵活点，一般一瓶满的细胞消化后加20-30ml营养液，每孔加0.8-1.2ml），5%CO2、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入200μL 37℃预热的OPTI-MEM无血清培养基（或不含血清的DMEM），然后加入1.0μg的DNA，混匀后加入3.0μL的TransFastTM Transfection Reagent（使lipid∶DNA的体积/μL与质量/μg比为1∶1）后立即涡漩，在室温温育TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物l0～
15min；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTM Transfection
Reagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；
轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h
后，轻轻加入1.0mL 37℃预热的完全生长液（或使血清浓度降到2～6%），把细胞放入二氧化碳培
养箱，37℃培养7～14d。
LipofectamineTM 2000对293细胞的毒性要稍微大一点，但是转染效率相对也高一点。按照protocol做就可以，记得一定在转需要去掉培养基，否则毒性会更大。细胞2-3天传代一次算是正常，我一般一瓶份2瓶，2d就可以传代。转染后10-14天不换液，有一部分可能会出现死亡，但是大部分是没有问题的，如果细胞不好，肯定是维持不到这个时间的。细胞生长7天后就会非常密的。一定要有没有转染的细胞对照。转染后4-6h换液可以用维持液，血清浓度在2-5%即可。
Reed-Muench法计算重组腺病毒的TCID50。
重组腺病毒10倍比稀释（可以用维持液稀释，含2%血清）后接种293细胞，培养5d，观察CPE，结果如下（表3-1）。距离比=（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数-低于50%的百分）
=（83.3%-50%）/（83.3%-40%）
=0.77
LogTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数
=－7+0.77×（－1）
=－7.77
重组腺病毒的TCID50为10-8.77/mL。
表3-1重组腺病毒各稀释度的CPE数
Table 3-1 Numbers of CPE of different dilutions of recombinant adenovirus
当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，将细胞连同细胞板一起放在-20度冰箱中冷冻，冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM），增殖病毒（反复冻融3次，取上清，不用过滤）。先大量增殖病毒，然后按照每次试验的需要量小量分装，测定病毒含量，病毒收获后可以添加2%血清保存，最好-80℃保存，每次使用一管，完毕就处理掉，如每支100微升，即使使用5微升，下次也不再使用。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4% sucrose）病毒会持续1-2年稳定性。
CPE(ytopathic effect)，细胞病变效应出现后，基本就能确定腺病毒包装成功。但还是要做鉴定，收毒后做免疫荧光，westernblot等。
7、病毒滴度测定
TCID50，Tissue culture infective dose 50，半数组织培养感染剂量，又称50%组织细胞感染量,腺病毒感染性滴度，即指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)的病毒量。TCID50反映的是单位体积中的病毒量。
①准备细胞
取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。
也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
②稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法
B法参照书将液体量减少后的结果
病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病
毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl 加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，
可以根据接种的量自行调整。
此步操作注意事项：
1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
3）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。
③接种
取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。（切记：设置正常的细胞对照）37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在37℃ CO2培养箱中培养。（也有地方介绍不去掉病毒液）
④培养
将培养板放置于CO2培养箱。培养温度，培养几天。（一般4-5d）
⑤测定结果
取出培养板，显微镜下观察细胞病变。
计算方法
1) Reed-Muench法（常用）
观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按公式计算出该病毒液的TCID50。
由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算：
TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例
故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4-5，即TCID50为104-5倍，当病毒悬液做104-5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。
2) 判定标准
细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。
线性化过的腺病毒DNA是只要转进细胞就能表达荧光，因为在我们转染过程中，转染次日就会看到有少量荧光的表达。腺病毒DNA虽然是线性的，但是表达原件是完整的，所以荧光是表达的。
六孔板按照5%接毒还是可以的，病毒滴度很高的话，可以再低一点，但是由于没有测滴度，可以使用这个量。RT-PCR，比较容易做。可以在病变达到50%左右进行提取RNA，这个好像要求不严格。如果大量细胞脱落，就要低速离心沉淀细胞再提。如果很少细胞脱落，去掉上请后，直接加TRIZOL裂解即可。
2、SDS-PAGE，你可以做一个时间梯度。比如病变30%、50%、80%、100%的时候取细胞，裂解后做SDS-PAGE和western blot。按照病毒生长周期，蛋白应该在晚后期表达。但是，由于接种量MOI的关系，开始并不是每个细胞都感染了病毒。一些细胞感染之后，释放出病毒后再感染其他细胞，这样，整个过程都在发生病毒的增殖周期。所以，我看文献讲，做SDS-PAGE鉴定，一般感染量要大，一开始，保证每个细胞都感染上病毒；而做病
毒增殖，感染量要低。
直接取上清或者一点细胞，量可能有点小。最好做一下浓缩。检测低限与蛋白量、一抗质量、检测方法有一定关系。
般CsCl离心可以起到浓缩和纯化的作用。如果你的条件达不到，可以不做。但是要保证你
的病毒原始滴度可以用于试验。我以前做动物试验，测定免疫效果，也没有CsCl离心。
转染条件看你使用的转染试剂的要求，不同的转染试剂要求不同，从60%到95%都有。一
般的80-90%都基本可以。
腺病毒纯化包括3步：
1．不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物
和缺陷性病毒颗粒。
2．连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷
性病毒颗粒分开。
3．透析去除氯化铯（去盐）。
连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从
早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按
照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约
需2天时间。
下面所有操作均以SW28转子30ml离心管为例。理论上
讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在
离心后收集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒
密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的
离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒
带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。
5.5.7 不连续密度梯度离心
注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增
病毒至少需要3×108细胞。
1．预冷离心转子至4℃。
2．在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯
（53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9），再非常轻缓地加入6ml 1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mM
Tris-HCL，PH 7.9）。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。
3．超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL调至20ml。
4．平衡离心管，100000×g（SW28转子上为23000rpw）4℃离心90分钟。
5．超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。6．用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。7．在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。
8．用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。
注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。
9．小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。
10．取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15ml离心管。
11．加入1倍体积1×TE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345。
5.7.2 连续密度梯度离心
1．使用连续密度发生器将12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。
2．非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10ml 5.7.1第11步中稀释的病毒悬液。
3．100000×g 4℃离心16-20小时。
4．超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。
5．用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。
6．用20 G针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。7．让底部梯度溶液流入烧杯，当接近病毒带时再转入50ml离心管中收集。
8．蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。
说明：当然，病毒带也可以象不连续梯度时一样从侧壁穿刺收集。
5.7.3 病毒溶液去盐和浓缩
氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。透析液的选择取决于病毒的最终用途。如果用于动物，则应避免使用甘油，因为含有甘油的溶液极难注射；如果要使病毒滴度达到5×1011vp/ml，则应避免PBS-5%蔗糖缓
冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液PH
的关系，病毒将会沉淀下来。含10mM Tris（PH8.0），2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至
1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。
（Nyberg-Hoffman等，1999）。将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃
中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定），剩下的用于以后的
实验。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。这个过程中所丢失的病毒量小于10%。纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒，
然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液）。
包装产品注意事项
包装产品注意事项 产品包装注意事项包装产品的性能，主要包括产品的物态、外形、强度、重量、结构、价值、危险性等，这是进行包装时首先应考虑的问题。 ①产品物态。主要有固态、液态、气态、混合等，不同的物态，其包装容器也不同。 ②产品外形。主要有方形、圆柱形、多角形、异形等，其包装要根据产品外形特点进行设计，要求包装体积小、固定良好、存放稳定、且符合标准化要求。 ③产品强度。对于强度低、易受损伤的产品，要充分考虑包装的防护性能，在包装外面应有明显的标记。 ④产品重量。对于重量大的产品，要特别注意包装的强度，确保在流通中不受损坏。 ⑤产品结构。不同产品，往往结构不同，有的不耐压，有的怕冲击等。只有对产品结构充分地了解，才能对不同产品进行合适的包装。 ⑥产品价值。不同产品，价值差异很大，对价值高者应重点考虑。 ⑦产品危险性。对易燃、易爆、有毒等具有危险性产品，要确保安全，在包装外面应有注意事项和特定标记。 (2) 环境对产品的影响 产品在流通过程中，会遇到不同环境，它们对包装会产生不同影响，故应采取相应措施。 ①气象条件。主要有、温度、湿度、雨雪和空气等，它们对不同产品的影响也不同，这都需要针对不同气象条件分别加以考虑。 ②装卸条件。应考虑是人工装卸还是机械装卸，以及装卸次数等条件。 ③运输条件。产品在运输过程中，会受冲击、振动等作用，且不同的运输工具，对包装的影响也不同。主要应考虑产品固定与缓冲。 ④贮存条件。贮存多用堆码，包装应考察其耐压强度。另外，贮存还分室贮存和室外贮存，前者要注意防潮、防霉、防水等;后者要注意防雨雪、防、防风等。 (3) 包装方式的选择
包装方式的选择对产品保护甚为重要，只有对产品性能及流通条件作全面了解，制定几种方案，进行经济评估，才能找到合适的包装方式。 ①选择包装材料。根据产品性能选择与之相适应的包装材料来制作包装容器，同时选择合适的附属包装材料来包装产品。 ②选择包装方法。根据对产品保护强度的要求，使用方便，便于机械装卸和运输等来选择适当的包装工艺和包装方法。 常用的包装技法有哪些物品的种类、品种极多，流通条件也有很大差异，故包装技法种类很多，常用的有以下几种： (1)防潮包装 防潮包装是采用具有一定隔绝水蒸气能力的材料对物品进行包封，隔绝外界湿度对产品的影响，或在包装容器加干燥剂，以吸收包装残留潮气和由外界透人的潮气。 (2)防水包装 防水包装是为防止因水侵入包装容器而导致容物发生变质、损坏所采取的一定防护措施的包装。 (3)防锈包装 防锈包装是为防止包装金属物品的锈蚀损坏而采取的一定防护措施的包装。 (4)防霉包装 防霉包装是为防止含有机物物品在受霉菌作用时发生霉变和腐败，使物品质量受到损害而采取的一定防护措施的包装。 (5)防尘包装 防尘包装也称密封包装，是为防止粉尘进入包装容器影响产品质量的一种包装。 (6)收缩包装 收缩包装是用热收缩薄膜裹包物品或包装件，然后加热使薄膜收缩，从而包紧物品或包装件的一种包装。
纸塑包装材料的使用与注意事项
纸塑包装材料使用注意事项 一．结构 纸塑包装袋一般由两面组成，一面是透过和排放灭菌因子的纸，一面是不能渗透液体、空气和气体的透明复合薄膜（塑料膜），透明复合薄膜至少由两层（聚丙烯内层和聚酯外层）构成。空气消毒因子的交换在纸的一侧进行，由于材料的原因，同样具有良好的微生物屏障功能，而且塑面对包内物品可视，使包装物品一目了然和具有良好的抗渗能力。 二．优点：包内物品可视，良好的微生物屏障功能，良好的抗渗能力，可根据包装器械物品的长短、大小，选择规格合适纸塑包装进行裁剪，可用于高压蒸汽、环氧乙烷灭菌并在包装上印有两种化学变色指示区(EO灭菌前是粉红色，灭菌后变为黄色；高压蒸汽灭菌前是蓝色，灭菌后变为黑色) 三．缺点：临床科室存放备用的纸塑无菌包，易出现褶皱和封口裂开，包装硬质物时干燥性差，个别出现内塑面上滞留水珠，锐器易刺破纸塑袋的包装。2009年规范中规定仅用于单个器械的包装，平面卷带一般建议用于厚度不大于5CM 的物品。目前是医院广泛采用的产品，但其因存在单面透气，一些金属类器械在灭菌过程易产生冷凝水，纸塑包装袋不能用于下排气式灭菌器。 四．使用注意事项 1.纸塑袋包装使用封口机时, 应注意检查封口日期是否准确, 物品封口后 注意检查日期有效性。字迹变浅时, 及时增加打印机油墨。医用封口机的温度一般为180℃，使聚丙烯熔化为液态把薄膜挤入纸张纤维；纸塑包装的封纹宽度应≥６ｍｍ，封口必须同一连续形态，平整无皱褶,无气泡或者漏道。2.包装时要检查包装物品的清洁度和干燥度，高压蒸汽灭菌时器械清洗干燥不 完全，残留的油和水分容易浸湿纸面而造成湿包。 3.对尖锐器械部位进行保护，如尖剪等应用硅胶管或橡胶管套上，防止刺破纸 塑包装，导致灭菌失败； 4.纸塑袋必须合适裁剪和正确使用，以便去除空气，灭菌剂渗透，干燥。排出 不利的空气将成为热和水汽的障碍，所以密封前应去除尽可能多的空气。此外，包装袋不能装的太满，拉伸纸塑包装袋可能会在灭菌或搬动时导致纸张撕裂或封条破裂；另外器械挤满包装袋，袋内没有一定的空间，不利于蒸汽
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
国际运输货物外包装注意事项
国际运输货物外包装注意事项 包装是影响运输质量的一个非常重要的因素，它可由托 运人自身完成，也可委托专业包装公司进行。包装材料的选 择要视货物品质而定，目的是使货物得到安全的保护和支 撑。常用的有木箱、纸箱等。不同国家对木箱的要求不同， 有些国家和地区木箱是要求熏蒸的。 钢琴、陶瓷、工艺品等偏重或贵重的物品请用木箱包装。 美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等国，对未经过加工的原 木、或原木包装有严格的规定，必须在原出口国进行熏蒸， 并出示承认的熏蒸证，进口国方可接受货物进口。否则，罚 款或将货物退回原出口国。 欧洲对松树类的木制包装规定，货物进口时必须有原出 口国检疫局出示的：没有虫害的证明。 加工后的木制家具不用做熏蒸。 日常生活常用类物品如书籍、各种用具等可用结实的纸 箱自行包装，并最好做防潮处理。 易碎类的物品最好用东西填充好，避免损坏。条件允许，在纸箱内铺垫一层防水用品(例如：塑料袋、布等)。在同一包装箱内，轻重物品要合理搭配放置，以便搬运。 箱内最后要塞满填充物，要充实，可用卫生纸、纸巾、小衣 物等填充，以防在搬运挪动过程中箱内物品互相翻动、碰撞 而受到损坏。
【国际贸易运输方式】国际贸易海洋运输方式 [提要]国际贸易海洋运输方式:班轮运输(定期船运输) Liner Transport. 指按固定的航线和预先规定的时间表航行,沿途停靠若干固定的港口,从事这些港口的货运业务,并按事先公布的费率收取运费的船舶运输业... 国际贸易中，进出口商品的交付是通过各种运输方式完成 的。国际贸易运输方式的种类很多，各种运输方式都有其自身的 特点和独特的经营方式，了解各种国际贸易运输方式的特点和经 营方式，对于合理选择和正确利用各种运输方式，有着重要的意义。 一. 国际贸易运输的六大方式: 根据运输工具的不同, 可分为: 海洋、铁路、航空、邮政和国际多式联运等运输形式. 二. 国际贸易运输方式之一 - 海洋运输。海洋运输(Ocean Transportation)简称海运，它是利用货船在国内外港口之间通 过一定的航线和航区进行货物运输的一种运输方式。 海洋运输包括：
纸盒包装容器的制作流程和注意事项
纸盒包装容器的制作流程和注意事项 容器, 流程, 纸盒, 事项, 牛皮纸 纸盒包装容器的制作流程纸容器的加工 纸容器是用于包装商品的纸板做的容器，如纸盒、级杯等。评价级容器的质量，不仅评价印刷的好坏，还要评价容器的造型和加工的繁简。 纸容器的制造工艺流程为：制版、印刷→表面加工→模切、压痕→制盒。 1.材料 一般选用印刷效果良好、适合所包商品的廉价材料制成，有使用黄板纸、牛皮纸、卡纸、白板纸等作为承印材料，要求高的，可在这些材料上裱贴铜版线等上等纸张，印刷油墨也要根据包装的物品选用耐光、耐磨、耐油、耐药品、无毒的油墨。 2.制版、印刷 采用凸版、平版、照像凹版、柔性版印刷。现在以平版印刷为主、凸版印刷可以得到印刷效果好、色调鲜明、光泽好的成品，但制版工艺烦杂，不如平版印刷简单。在印刷过 程中进行喷粉，防止背面粘脏。 3.表面加工 根据需要可进行涂复聚乙烯，粘贴表面薄膜、涂蜡以及压箔、压凸等工艺，但并非所 有产品都要经过表面加工。 4.模切（die cutting）、压痕（creasing） （1）模切版制版 模切版的制版较好的方法是用胶合板制作模切版材。先将级盒图样转移到胶合板上，用线锯沿切线和折线锯缝，再把模切和折缝刀线嵌入胶合板，制成模切版，它具有版轻、 外形尺寸准确、可以保存等优点。 也有用计算机控制，激光制模切版的，把纸盒的尺寸、形状、纸板克重输入计算机，然后由电子计算机控制激光移动，在胶合板上刻出纸盒的全部切线的折线，最后嵌入刀线。
其工艺流程为：绘制级盒样图→绘制拼版没计图→复制拼版设计图→拼版设计图转移到胶合板上→钻孔和锯缝→嵌线→制作模切版阴模板。 ①绘制纸盒样图 绘制纸盒的黑白稿刀线图，有盒的各一种精确尺寸，要求线条非常准确，如图8-31。 ②绘制拼版设计图 根据纸盒纸盒样图和可印刷的最大纸张尺寸，进行拼版设计，拼版设计要考虑节约纸张和便于模切后自动清除废边。按拼版设计绘制拼版设计图。 ③复制拼版设计图 复制两张拼版设计图，一份供制印版印刷用，一份供模切版制版用，可保证一致性， 在模切时能精确套准。 ④拼版设计图转移到胶合板上可用手工描绘或照像复制。手工描绘要保证高度准确。 有专用锯缝机，是上下移动的线锯。在两只盒芯 相连处钻孔，便于穿线锯，沿切线和折线锯开。线锯的厚度应与模切刀线和折缝刀线 的厚度相适应。 ⑥嵌线 用铡线机、弯线机、冲孔机等机械根据盒子形状把刀线轧断、弯圆或弯成各种角度。 横切刀线的高度是23.8毫米，厚为0.7毫米，嵌入模切版上的模切线必须高度一致。折缝刀线的高度和厚度取决于纸张的厚度。折缝刀线高度为模切刀线高度减去纸张厚度即 可。 在刀线嵌好后，两边要贴上泡沫橡皮，以便纸板从模切版上弹出来，如图8-32。 ⑦制作模切版阴模板 阴模板是为了获得良好的的缝，在钢板上贴好绝缘纸，放入机器，放好复写纸，再盖一层卡纸，开动机器压一下获得压痕，在压痕上开出折缝线槽。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
包装设计要注意什么_包装设计注意事项
包装设计要注意什么_包装设计注意事项 平时我们购买的商品大都有外包装，包装设计的好坏会直接影响到消费者的购买欲望，从而影响商品的销量。怎样的一个包装设计才算是好呢？本期乔布简历小编将为大家介绍一下包装设计注意事项，下面就一起来了解一下包装设计要注意什么吧~ 关键词：包装设计要注意什么,包装设计注意事项 包装设计除了精美外，还要符合并遵循可靠、适当、经济的原则。由于需要包装设计的产品种类繁多，性能用途也各不相同，对包装设计的要求也是大有不同，从业者在做包装设计时要考虑的问题也就比较多种多样。概括来说，做包装设计时主要注意以下几点： 1、产品本身的性能用途 在做包装设计时，首先要考虑的就是产品本身，不同形态的产品包装容器也不一样。此外还要考虑到产品的外形及重量，外包装的设计要符合包装体积小、存放安全、确保在运输流通中不易受损等原则。对于价值比较高的产品要最先考虑包装要使得不易受损的问题，而对于易燃易爆或有毒等危险性产品则要优先考虑安全性。 2、外在环境的影响 产品在运输及售卖流通的过程中，会遇到不同的环境，各种环境会对包装产生不同的影响，这点在包装设计时要充分考虑。针对不同的贮存条件，也要采取相应的措施。室内贮存的产品包装要注意防潮防霉等，室外贮存的产品则要考虑防光照防雨水，防风防雨雪等。 从业者在做包装设计时，要充分考虑到各种因素，这样才能保证商品在到消费者手中时完好无损。找工作意向为包装设计行业的小伙伴们也可以参考一下以上内容，加强对包装设计的理解认识~ 包装设计要注意什么_包装设计注意事项 https://www.360docs.net/doc/8011845287.html,/knowledge/articles/5656b5410cf2f396f66c9d50
包装工艺规范
包装工艺规范 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
无论何种方式的包装以保护产品不损坏为原则。 2包装方式 阀门成品的包装材料分麻袋、编织袋和木箱包装。具体采用哪种包装材料按合同规定或由销售部根 据产品品种、规格、数量等具体情况确定。每件包装装入产品的数量不作具体规定，仓库保管员可根据产品大小和重量、运输方式等自行确定。 3包装要求 3.1包装前仓库保管员应按《产品出库单》SY/QP016-01和《最终检验和试验作业 规范》进行交付检验，确 认无误后进行包装。 3.2麻袋或编织袋包装 a单台包装的阀门产品,应装入尺寸合适的袋子,然后用绳捆紧、扎牢； b麻袋和编织袋外应写明到站、收发货单位、产品名称、型号、规格、本批件数。 c阀门出厂时，每台阀门应有合格证，每批阀门应有产品合格证，产品检验 报告（合同规定时），材 料质量证明书，产品说明书（合同规定时）等有关技术文件。 3木箱包装 a阀门装箱前应仔细检查阀门的型号、规格、数量及合格证是否与装箱单相符。 b单台产品木箱包装。用于较重、尺寸适中的产品。装箱时用泡沫塑料或其它方法固定，防止产品 串动。 c多台产品木箱包装。用于体积小、重量轻、数量多的产品。装箱时用泡沫塑料或其它软质材料填 充，防止搬运途中产品相互碰撞、串动。 d木箱四周应用铁带封包，防止木箱在搬运中损坏。 e每箱应随带产品合格证，装箱单、产品检验和试验报告（合同规定时），材料质量证明书（合同规 定时），产品说明书（合同规定时）等有关技术文件，并固定在箱内某一部位。 f木箱外唛头（收货单位地址、收货人、发货单位地址等）应书写整齐，清晰。 旋塞阀、球阀和具有反作用通道的闸阀，在发运中应处于全开位置，除非配有安全关闭装置。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
农药包装袋制造工艺注意事项复习课程
农药包装袋制造过程中的注意事项 一、农药包装对材料的要求 由于农药是含大量腐蚀性有机溶剂的液体状物质，而复合包装袋又是用有机高分子材料薄膜做成的，这些有机溶剂对无机物质的玻璃或金属没有腐蚀作用，但依“相似相溶”的原则，它对有机高分子材料的溶解性、溶胀性和渗透性，就要比对无机材料的金属和玻璃大很多。 液体农药中使用的有机溶剂种类多，通常有甲苯、二甲苯、二甲基甲酰胺、甲醇、酒精、氮酮、环己酮、丙酮或丁酮、醋酸乙酯等等，这些有机溶剂都是混合使用的。从我们检测的数据来看，它们混合以后似乎有“协同效应”，腐蚀性要比单独使用更强。 1) 对基膜的要求 作为包装液体农药的基膜，抗有机溶剂的腐蚀能力和阻透性越高越好。这跟它的分子结构、分子量、加工方法都有关。 从分子结构上考虑，含氟、氯、氮、氧、硅、酯基、羟基、酰胺基多的有机高分子材料更好，但又要同时考虑它们的加工适应性，例如：能否做成薄膜，能否复合粘牢，能否热封制袋，还要考虑废弃物对环境是否存在不利的影响、成本是否合适等问题。 对于同一种结构材料而言，这些有机高分子物质的分子量越高越好，经过分子定向加工的双向拉伸膜更好。目前，制造液体农药包装袋的基材薄膜，作为阻隔层使用的有双向拉伸的PET、OPA，有铝箔和真空镀铝的聚酯膜(即VMPET)，作为可热封内层使用的有CPP、PE和含PA、PVA、EVOH的共挤膜。 从这七、八年的实际试验和检测情况来看，目前我们推存使用的阻隔层材料，有PET、OPA、VMPET和铝箔，而可热封制袋的内层是CPP或PE膜。 最外层印刷用的PET（有时也可以用BOPP），国内许多企业都可提供，表面张力高于48mN/M或38mN/M（即48或38达因/厘米）、干燥清洁就行。 作为中间使用的，是铝箔、VMPET或OPA阻隔性材料。 铝箔最好采用9～11微米厚的，小于9微米时因针孔数太多，阻隔性降低，农药的失重量就变大。同时，铝箔的表面清洁度要好，应该没有油污和灰尘，双面的表面张力都大于70mN/M才行。 VMPET必需要用加强型的，不能使用普通型的，镀铝层的厚度要大于40nM（即大于400埃），而且非镀铝面的表面张力也应高于48mN/M。这种VMPET膜在国内各地都有生产，其中有安徽宁国的双津集团、合肥的通达公司、黄山的永新公司、上海的永超公司，还有浙江、广东、江苏等地的真空镀铝膜企业，他们都能提供这种产品。 双向拉伸的尼龙薄膜OPA是15微米厚、双面电晕处理过、表面张力都大于48mN/M的为好，因OPA的吸湿性强，必需用有干燥剂存在的密封袋去包装，并要在干燥阴凉处保存，使用前没有受潮吸湿才行。目前，厦门的长华塑业公司和沧州的东鸿包材公司都能提供这种产品。我们不提倡使用单面电晕处理或表面张力小于48mN/M的OPA薄膜。若采用12微米厚的PET去代替OPA，它也必需是双面电晕处理过、表面张力都大于48mN/M 的双向拉伸PET膜。上海紫东包装材料公司能生产这种双面电晕处理的PET薄膜。 作为可热封的内层材料，目前，我们主力推荐采用CPP或PE，但它们必需是“农药包装专用级”的产品。从这几年的情况看来，全国大多数地区都采用农药包装级CPP膜为主，其中有无锡环亚公司、上海美丰公司、上海紫藤包材公司的产品，但广东地区比较多采用PE膜，个别企业也采用日本的XRC－18型CPP或我们过去推
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。 产品订购和技术支持 山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处 美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室 广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室 山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.360docs.net/doc/8011845287.html, Phone: 400-077-2566 https://www.360docs.net/doc/8011845287.html,(美国) https://www.360docs.net/doc/8011845287.html,（中国） 欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
精品浅谈家具生产工艺流程与质量要求及注意事项
浅谈家具生产工艺流程与质量要求及注意事项 家具生产主要有备（配）料、机加工（细作）、安（组）装、涂装、包装五个工艺过程，这五个工艺流程也称为家具生产的基础流程。 家具生产工艺在很多人看来十分简单，比如现代板式家具，三步一体的开料、封边、打孔，所用的设备也无外乎开料锯、封边机、排钻。结构要点无非是32系列拆装连接件等，其实实际上的板式家具生产工艺要远比这些复杂得多，同样是一块板件，有些只要一两道工序就可以完成，而有些则十数道甚至数十道工序才能够完成。如抽屉底板，只要开料就可以，而如一块较复杂的地柜面板其结构是蜂窝空心，面木皮，边实木封边且有边N型，上面还要镶嵌玻璃。单一面板的加工就要二十几道工序才能完成，所以说家具工艺的复杂程度同产品的外观设计、产品结构、用料以及种类、数量等诸多因素息息相关，涉及的要素越多就越复杂。 家具生产工艺的主要构成要素：原材料、工艺文件、机器设备、操作工人以及相应的品质和生产管理系统。其中原材料准时到位是整个工艺流程的前提和基础，而工艺文件则是整个加工流程和管理活动的行动依据，工艺文件要全面细致。家具工艺文件大概有：效果图、三视图、零部件分解图、零部件加工图、五金配件清单、包装方案、安装示意图、原材料明细表、零部件加工工艺流程表、产品使用说明书。其中零部件加工图要与零部件加工工艺流程表结合使用，并与生产线上的零部件产品同步运行效果最佳。零部件加工流程表里面的主要内容要涵盖名称、规格、数量、用料、批次、加工注意事项、特殊检验标准、工时、工序及序列号等基本内容。机器设备和操作工人则是加工保障。 家具的主要生产工艺流程，因其类别、款式、装饰效果的不同也有不尽相同的工艺流程，比如家具从材质上分有板式家具、实木家具、五金家具、软体家具、混合家具等；从类别上分有酒店家具、民用家具、学校家具、公共家具、儿童家具等等；从款式上分有美式家具、欧式家具、中式家具、明清家具、仿古家具等等；从结构上分有整装家具、拆装家具等告示。所以，在实际操作过程中，因为受类别、款式、结构与成本等因素的影响，工艺流程与质量要求也尽不相同。 在这里，由于受版面限制，我们只从一般常见木家具来简单谈谈家具生产工艺流程与质量要求及注意事项的基本原则。 一、备（配）料 概述：就是运用家具备料所需要的机械设备和工具，在备料车间对家具毛料或素材进行一系列的加工操作，用来供应生产所需。备料是家具生产的第一道工序，俗话说“万 丈高，从地起”，备料工艺水平的高低，直接影响整个家具产品的质量。 工艺流程：备料包括选料、断料、开料（裁板/压板/贴皮/封边）、平刨、压刨、拼板、弯矩成型等工序。 质量要求： 1、拼板时尽量将颜色相近的材料拼在一条拼缝上，保持板面颜色基本一致。 2、备料规格不能太大，更不能缩小，长度保持在1-1.5厘米，宽厚度保持在0.5-0.8厘米 左右的砂光或精切余量。 3、所有材料必须保持方正、平直，杜绝拼缝空隙出现。上胶水时必须将胶水均匀涂布在 木材表面，不能过多或过少，以拼实后表面有芝麻大小胶粒溢出为宜，拼板必须保持一面平整，一头整齐，确保材料利用率。 4、锯裁后的板件必须与实际尺寸要求相符，大小头之差应小于2mm。当板件长度L为：
包装工艺、安全操作规程
第三篇包装工艺操作规程 第一章工艺原理 第一节包装机的主要技术性能 1.1生产线的主要技术性能 称重能力800bags/h 称重精度+0.2% 包装能力800bags/h 码垛能力1000 bags/h 气源压力0.5 —0.7Mpa 总耗气量81Nm3/h 总耗电量AC380V+10% ，50HZ+1%，三相五线制，55KW 1?2包装机的工作环境 环境温度 5 C?40 C 环境湿度在40 C时不超过50%RH，在低温下允许 有较大的湿度 现场照度不小于100Lux 现场保护接地电阻不大于10Q 现场仪表接地电阻不大于4Q 接地形式TN-S 第二节包装机的维护、检修 2.1日常维护、保养 2.1.1 机械设备： 每日巡回检查链轮与链条的润滑情况以及链轮与链条之间啮合是否良好。 电机启动、停止平稳，无异常噪音。 螺栓等紧固件是否有松动；光电开关位置是否有移动
光电开关的玻璃窗是否有灰尘，发现异常情况需及时更换。 定期检查易损件的磨损情况，磨损严重应及时更换，检查周期为1个月 定期检查轴承的磨损情况，磨损严重应及时更换，检查周期为1 个月 2.1.2 电控系统： 定期检查交流及直流电源的电压是否在规定的范围内 定期检查控制柜、接线盒的接线端子、设备的接地线是否松动。 定期检查漏电保护器是否有效。 操作前检查光电开关表面是否清洁，接近开关是否松动。操作前检查操作盘上的按钮开关和选择开关是否灵活好用。 2.1.3气动、真空系统 每日检查水分离过滤器中冷凝水的多少，沉积过多时应及时排放。 每日巡回检查压力表指示的空气压力是否正确，及时调整操作压力。 每日巡回检查各接头处的连接处是否牢固、是否漏气、排气噪音是否在规定的范围内。 每日巡回检查各气缸的动作速度是否正确，气缸密封垫处是否漏气。 定期清理过滤器上的污物，并将其清洗干净，清理周期为一个月。 每班检查一次真空泵水箱内的过滤器是否有污物，并保证水箱内水的清洁，若混入杂质，应及时更换。 检查油雾器的滴油量及油色是否正常。 2.2系统检修的一般方法： 2.2.1 电机的检修 电动机产生异常噪音、发热、无法启动、异常停止等故障时，应按下列方法进行检查： 检查对应的电动机空气开关是否因过载或短路而跳闸，如果是，查明原因，排除故障，然后将电动机空气开关闭合。 检查对应的交流接触器是否发生故障，如果是，查明原因，排除原因，排除故障或更换新的接触器。 检查各连接端子处是否松动、断开，电机电缆是否损坏，紧固松动的连接处、更换损坏的电缆。 检查制动电机的制动器部分是否有杂物，传动系统是否缺乏润滑，清理刹车片，润滑传动系统各部件。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
车间包装安全操作规程及注意事项二
车间包装安全操作规程及注意事项 1．领桶：厂长开领桶单后由车间叉车司机到空桶组办理领空桶手续，交车间包装负责人，核查品质合格方可使用。 2．空桶套胶袋：按照生产联络单的包装要求，在空桶内套相应的胶袋。如120KG桶套120KG的胶袋、200KG桶套200KG的胶袋等。 3．安装过虑网：依据包装指示进行过滤包装，白胶用80目的过虑网，防水胶用150目的过虑网，UV油用UV专用过滤袋包装，丙烯酸树脂（水性）用200目过滤网，丙烯酸树脂（油性）用300目过滤网，高温树脂用250目过滤网，特殊情况按指令执行。 4．校正磅秤：以20KG砝码来校正，允许误差为±0.2%。 5.穿戴防护用品：包装时要求员工穿戴适当防护用品方可上岗作业，如穿戴防止产生静电厂服、戴耐酸碱胶手套、防毒防尘口罩等。 6.包装：按照包装规格重量进行包装，包装时器具要求备齐、干净，包装的产品名称、类别、型号、重量与要求一致，包装出来的产品外观要求干净、美观。 7.贴标签：标签要求贴在桶身侧面正上方，统一位置，标签要与包装产品确定一致后粘贴，特殊情况按特殊要求粘贴。 8.保管器具：产品包装完毕后，要求彻底清洗机械，要妥善保管好工具器具，以待后用。 9.注意事项 1）严禁烟火：严禁带火种进出生产区域，不准在生产区内使用打
火机、手机等。 2）防止皮肤接触危险化学品：若接触液体，立刻使用大量清水冲洗皮肤至少5分钟，若症状严重，送医院治疗；同时移除污染衣物、鞋子，以肥皂清洗干净，衣物再使用前，予以清洗。 3）防止眼睛接触危险化学品：立刻用洗眼器持续冲洗眼睛至少30分钟，严重者送医院治疗。 4）防止吸入危险化学品：移患者到新鲜空气处，若呼吸停止，施行人工呼吸，若呼吸困难，由受训合格人员给予氧气，寻求医生治疗或送医院。 5）防止食入危险化学品：可催吐，用大量的清水漱口，并送医院治疗。 6）注意供电、供热及压力危害：不要随意乱动电气开关等，有问题请教主管或电工方可；发现有人触电，应立即使触电者脱离电源，静卧,呼吸心跳停止应及时给予人工呼吸及心脏挤压按摩。车间在生产或包装时会遇到温度和压力问题，反应釜及蒸气管道为压力容器，在操作时应小心防止受到蒸气烫伤。压缩空气及外购瓶装氮气，要防止管道阀门破裂等造成高压气体伤害，氧气瓶不得在地面随意滚动，使用时应固定牢固，防止碰倒发生意外。 7）防止静电：包装前将包装胶桶排整齐，并在地面洒水消除静电；在包装时严禁使用铁锤等敲打铁桶及使用铜质开桶器；在使用电子秤时要求必须夹上静电夹，清扫地面需使用竹扫把，禁用塑料扫把，禁