葡萄糖的一般杂质检查

CH 3CONH 2+H 2S ↑

验证性试验

实验三 葡萄糖的一般杂质检查

一、实验目的

1.了解药物中一般杂质检查的项目和意义。

2.掌握葡萄糖中氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、砷盐以及灼烧残渣等限度检查的基本原理和方法。

二、仪器与试药

1.仪器

FI 型红外光谱仪 纳氏比色管 规格：25mL

2.试药

碱性酒石酸铜试液 酚酞指示液 氢氧化钠 氯化钴 氯化钡

重铬酸钾 硫酸铜 乙醇 氯化钠 硫酸钾 碘 锌

磺基水杨酸 硝酸 硫氰酸铵 溴化钾 硫代乙酰胺

三、实验原理

1.氯化物检查法

氯化物在硝酸溶液中与硝酸银作用，生成氯化银微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样条件下用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，测定供试品中氯化物的限量。

Cl - + Ag + → AgCl （浑浊）

2.硫酸盐检查法

药物中微量硫酸盐与氯化钡在酸性溶液中作用，生成硫酸钡微粒而显白色浑浊液，同一定量硫酸钾溶液与氯化钡在同样条件下，用同法处理生成的浑浊液比较，判断药物中含硫酸盐的限量。

SO 4

2- + Ba 2+ → BaSO 4 （浑浊） 3.铁盐检查法

三价铁盐在硝酸酸性溶液中与硫氰酸盐生成红色可溶性的硫氰酸铁络离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。

Fe

3+ + 6SCN - → [Fe （SCN ）6] 3- （红色） 加硝酸3滴，煮沸5分钟，可使二价铁离子氧化成三价铁离子。 4.重金属检查法

重金属是指在弱酸性（pH 3～3.5）溶液中，能与硫代乙酰胺或硫化钠作用生成硫化物的重金属杂质，在药品生产过程中遇到铅的机会较多，铅又易蓄积中毒，故检查时多以铅为代表。

由于硫代乙酰胺（thioacetamide ）在弱酸性（pH 约3.5）溶液中水解，产生硫化氢，可与重金属离子作用，呈现有色硫化物的均匀沉淀，可与对照标准溶液按同法处理比较。

Pb 2++H 2S → PbS ↓+ 2H +

5.砷盐检查法

中国药典主要采用古蔡氏（Gutzeit ）法检查砷盐。原理是：利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中的微量砷盐作用生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞（或氯化汞）试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，可判断药物中含砷盐的限量，反应如下： pH3.5

AsO33-+3Zn+9H+→AsH3+3Zn2++3H2O

AsH3+2HgBr2→2HBr+AsH（HgBr）2（黄色）

AsH3+3HgBr2→3HBr+As（HgBr）3 （棕色）

五价砷在酸性溶液中也能被金属锌还原为砷化氢，但生成砷化氢的速度较三价砷慢，故在反应液中加入碘化钾及酸性氯化亚锡将五价砷还原为三价砷，碘化钾被氧化生成的碘又可被氯化亚锡还原为碘离子。

AsO43-+ 2I- + 2H+→ AsO33- + I2 + H2O

AsO43-+ Sn2+ + 2H+→ AsO33- + Sn4+ + H20

I2 +Sn2+→ 2I- + Sn4+

溶液中的碘离子，与反应中产生的锌离子能形成络合物，使生成砷化氢的反应不断进行。

4I- +Zn2+→ ZnI42-

氯化亚锡与碘化钾存在，可抑制锑化氢的生成，因锑化氢也能与溴化汞试纸作用生成锑斑，在试验条件下，100 g锑存在不会干扰测定。氯化亚锡又可与锌作用，在锌粒表面形成锌锡齐，起去极化作用，从而使氢气均匀而连续产生。

6.炽灼残渣检查法

有机药物经灼烧炭化后，再加硫酸润湿、低温加热至硫酸蒸汽除尽后，于高温（700～800℃）灼烧至完全灰化，使有机物破坏分解变为挥发性物质逸出，残留的非挥发性无机物质（多为金属的氧化物或无机盐类）成为硫酸盐，称为炽灼残渣。

如炽灼残渣需留作重金属检查，则控制灼烧温度在500-600℃，否则，将使重金属检查结果偏低。

四、实验内容

葡萄糖

Putaotang

Glucose

C6H12O6.H2O 198.17

本品为D-(＋)-吡喃葡萄糖一水合物。

【性状】本品为无色结晶或白色结晶性或颗粒性粉末；无臭，味甜。

本品在水中易溶，在乙醇中微溶。

比旋度取本品约10g ，精密称定，置100mL 量瓶中，加水适量与氨试液0.2mL ，溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，放置10分钟，在25℃时，依法测定（《中国药典》附录Ⅵ E），比旋度为＋52.5°至＋53.0°。

【鉴别】 (1)取本品约0.2g，加水5mL 溶解后，缓缓滴入温热的碱性酒石酸铜试液中，即生成氧化亚铜的红色沉淀。

(2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集464图）一致，见图1。

图1 葡萄糖红外光吸收图谱

【检查】酸度取本品 2.0g，加水20mL溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20mL，应显粉红色。

溶液的澄清度与颜色取本品50g，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10mL，溶液应澄清无色；如显混浊，与1号浊度标准液（附录Ⅸ B）比较，不得更浓；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3mL，比色用重铬酸钾液3mL与比色用硫酸铜液6mL，加水稀释成50mL）1.0mL加水稀释至10mL比较，不得更深。

氯化物取本品0.6g，加水溶解使成25mL（如显碱性，可滴加硝酸使遇石蕊试纸显中性反应），再加稀硝酸10mL，溶液如不澄清，滤过。置50mL纳氏比色管中，加水适量使成约40mL，加硝酸银试液1mL，用水稀释使成50mL，摇匀，在暗处放置5分钟，如发生浑浊，与标准氯化钠溶液一定量制成的对照液（取标准氯化钠溶液（10μg Cl-/mL）6.0mL置50mL纳氏比色管中，加稀硝酸10mL，用水稀释使成约40mL，加硝酸银试液1mL，用水稀释使成50mL，摇匀，在暗处放置5分钟）比较，不得更浓（0.01%）。

硫酸盐取本品2.0g，加水溶解使成40mL（如显碱性，可滴加盐酸使遇石蕊试纸显中性反应）。溶液如不澄清，滤过，置50mL纳氏比色管中，加稀盐酸2mL，加25%氯化钡溶液5mL，加水稀释使成50mL，摇匀，放置10分钟，如发生混浊，与对照标准液（取标准硫酸溶液（100μg SO42-/mL）2.0mL，置50mL纳氏比色管中，加水稀释使成40mL，加稀盐酸2mL，加25%氯化钡溶液5mL，加水稀释使成50mL，摇匀，放置10分钟,比较，不得更浓（0.01%）。

乙醇溶液的澄清度取本品1.0g，加90%乙醇30mL，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。

铁盐取本品2.0g，加水20mL溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45mL，加硫氰酸铵溶液（30→100）3mL，摇匀，如显色，与标准铁溶液2.0mL用同一方法制成对照液比较，不得更深（0.001%）。

重金属取25mL纳氏比色管两支，一管加标准铅溶液（10μg Pb /mL）2.0mL，醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL，加水至25mL；另一管取本品4.0g，加水23mL溶解，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL，各管分别加硫代乙酰胺试液2mL，摇匀，再放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，供试品显出的颜色与标准铅溶液比较，不得更深，含重金属不得超过百万分之五（5ppm）。

砷盐取本品2.0g ，置检砷瓶中，加水5mL溶解后，加稀硫酸5mL与溴化钾溴试液0.5mL，

置水浴上加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸发的水分，放冷，加盐酸5mL与水适量使成28mL，加碘化钾试液5mL及酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，迅速将瓶塞塞紧（瓶塞上已安放好装有醋酸铅棉花及溴化汞试纸的检砷管），保持反应温度在25～40℃,45分钟后，取出溴化汞试纸，将生成的砷斑与标准砷溶液（1 g As/mL）一定量制成的标准砷斑比较，颜色不得更深（0.0001%）。

标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液（1μgAs/mL）2mL，置另一检砷瓶中，加盐酸5mL与蒸馏水21mL，照上述方法，从“加碘化钾试液5mL……”起依法操作，即得标准砷斑。

炽灼残渣取本品1～2g，置已炽灼至恒重的瓷坩埚中，精密称定，加硫酸0.5～1mL润湿，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700～800℃炽灼使完全灰化。移至干燥器内，放冷，精密称定后，再在700～800℃炽灼至恒重，所得炽灼残渣不得超过0.1% 。

蛋白质取本品1.0g，加水10mL溶解后，加磺基水杨酸溶液（1→5）3mL，不得发生沉淀。

五、注意事项

1.注意平行原则，供试液与对照液同时操作，加入试剂的顺序应一致。

2.比色或比浊操作，一般均在纳氏比色管中进行，在选用比色管时必须注意其大小相等、玻璃色质一致（最好不带任何颜色）、管上刻度高低一致（如有差别，不得相差2毫米）。比色管使用后应立即冲洗，避免久置，不可用毛刷或去污粉等洗刷，以免划出条痕损伤比色管内壁而影响比色，应用清洁液洗后，用自来水、纯化水依次冲洗干净。

3.检查氯化物时，供试液与对照液同时操作，均应先制成40mL水溶液，再同时加硝酸银试液1mL，避免浓度较大时加入硝酸银产生氯化银沉淀，影响比浊。

4.比浊方法：将供试管与对照管同置黑色（或白色）背景上，自上方向下观察；比色：将供试管与对照管同置于白色背景上，从侧面观察。

5.铁盐检查时，光线和温度影响颜色的稳定性。光线促使硫氰酸铁还原或分解褪色，褪色的程度与光照时间成正比，葡萄糖在检查过程中加硝酸处理可减少褪色现象，但必须加热煮沸除去氧化氮，否则与硫氰酸根作用生成红色亚硝酰硫氰化物（NOCNS）而影响比色。温度越高，褪色越快。

6.检查重金属时，如供试液在加硫代乙酰胺之前带有颜色，应在对照管中滴加少量稀焦糖液，如任不能使两管的颜色一致，则可改用有机破坏的方法除去颜色。标准铅溶液应在临用前精密量取标准铅贮备液新鲜配制，防止铅水解而引起误差。

7.测砷时，锌粒的大小，以通过1～2号筛为宜，过细作用太快，过粗则作用太慢，可采用锌粒与锌粉各一半的方式加入较好。测砷装置：古蔡氏法，装置见附图1，先在干燥的测砷管中装入约8cm长的醋酸铅棉花，安装位置不宜过低，防止测砷瓶中反应剧烈时，产生大量氢气将反应液带上来，沾湿醋酸铅棉花而影响砷斑的检出，同时必须先将溴化汞试纸装好。加锌粒后，应立即将测砷瓶塞塞上，避免砷化氢气体逸出，影响结果的准确性。反应温度以25～40℃为宜，如在冬季可置温水浴中。

8.检查炽灼残渣时，取样量应根据供试品的炽灼残渣限度决定，如规定限度为0.1%，取样量在1g左右；如规定限度为0.05%，取样量以2g为宜，规定为1%或以上者，取样量可在1g以下，如遇贵重药物或供试品数量不足时，也可相应减少取样量。

六、思考题

1.一般杂质检查的意义是什么？主要包括哪些项目？

2.计算本次检查中氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐的限量。

3.在进行氯化物、硫酸盐和重金属检查时，样品有颜色应该如何处理？

4.重金属检查时pH为多少？为什么？

5.古蔡氏法检砷时所加试剂的作用与操作注意点是什么？

6.炽灼残渣测定的成败关键是什么？恒重的概念和意义是什么？

7.根据标准砷溶液的浓度、取量与杂质限量，计算样品的取量。

七、参考文献

1.《中国药典》二OO五年版二部，691，化学工业出版社。

2. 药物分析.杭太俊主编.人民卫生出版社.第七版。

《中国药典》附录ⅧJ：砷盐检查法

标准砷溶液的制备称取三氧化二砷0.132g，置1000mL量瓶中，加20％氢氧化钠溶液5mL 溶解后，用适量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10mL，用水稀释至刻度，摇匀,作为贮备液。

临用前，精密量取贮备液10mL，置1000mL量瓶中，加稀硫酸10mL,用水稀释至刻度,摇匀，即得(每1mL相当于1μg的As)。

第一法（古蔡氏法）

仪器装置如图1。A为100mL标准磨口锥形瓶；B为中空的标准磨口塞，上连导气管C（外径8.0mm，内径6.0mm），全长约180mm；D为具孔的有机玻璃旋塞，其上部为圆形平面，中央有一圆孔，孔径与导气管C的内径一致，其下部孔径与导气管C的外径相适应，将导气管C的顶端套入旋塞下部孔内，并使管壁与旋塞的圆孔相吻合，粘合固定；E为中央具有圆孔（孔径6.0mm）的有机玻璃旋塞盖，与D紧密吻合。

测试时，于导气管C中装入醋酸铅棉花60mg（装管高度为60～80mm）再于旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸（试纸大小为能覆盖孔径而不露出平面外为宜），盖上旋塞盖E并旋紧，即得。

标准砷斑的制备精密量取标准砷溶液2mL，置A瓶中，加盐酸5mL与水21mL，再加碘化钾试液5mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将照上法装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置25～40℃水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。

若供试品需经有机破坏后再行检砷，则应取标准砷溶液代替供试品，照各药品项下规定的方法同法处理后，依法制备标准砷斑。

检查法取按各药品项下规定方法制成的供试液，置A瓶中，照标准砷斑的制备，自“再加碘化钾试液5mL”起，依法操作。将生成的砷斑与标准砷斑比较，不得更深。

图1 图2

第二法(二乙基二硫代氨基甲酸银法)

仪器装置如图2。A为100mL标准磨口锥形瓶；B为中空的标准磨口塞，上连导气管C(一端的外径为8mm，内径为6mm；另一端长180mm，外径4mm，内径1.6mm，尖端内径为1mm)。 D为平底玻璃管（长180mm，内径10mm，于5.0mL处有一刻度）。

测试时，于导气管C中装入醋酸铅棉花60mg（装管高度约80mm），并于D管中精密加入二乙基二硫代氨基甲酸银试液5mL。

标准砷对照液的制备精密量取标准砷溶液5mL，置A瓶中,加盐酸5mL与水21mL，再加碘化钾试液5mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将导气管C与A瓶密塞，使生成的砷化氢气体导入D管中，并将A瓶置25～40℃水浴中反应45分钟，取出D 管，添加二氯甲烷至刻度，混匀，即得。

若供试品需经有机破坏后再行检砷，则应取标准砷溶液代替供试品，照各药品项下规定的方法同法处理后，依法制备标准砷对照液。

检查法取照各药品项下规定方法制成的供试液,置A瓶中,照标准砷对照液的制备,自“再加碘化钾试液5mL”起，依法操作。将所得溶液与标准砷对照液同置白色背景上,从D管上方向下观察、比较，所得溶液的颜色不得比标准砷对照液更深。必要时,可将所得溶液转移至1cm吸收池中，用适宜的分光光度计或比色计在510nm波长处以二乙基二硫代氨基甲酸银试液作空白，测定吸收度，与标准砷对照液按同法测得的吸收度比较，即得。

【附注】

1.所用仪器和试液等照本法检查，均不应生成砷斑,或至多生成仅可辩认的斑痕。

2.制备标准砷斑或标准砷对照液，应与供试品检查同时进行。

3.本法所用锌粒应无砷，以能通过一号筛的的细粒为宜，如使用的锌粒较大时,用量应酌情增加，反应时间亦应延长为1小时。

4.醋酸铅棉花系取脱脂棉1.0g，浸入醋酸铅试液与水的等容混合液12mL中,湿透后，挤压除去过多的溶液，并使之疏松，在100℃以下干燥后，贮于玻璃塞瓶中备用。