造血系统疾病动物模型

第九节造血系统疾病动物模型

造血系统疾病（Disease of hematopoietic system），除了地中海贫血等少数疾病具有明确的病因以外，再盛赞该性贫血等大多数疾病都还没有明确的病因，造血系统疾病的动物模型，就成为研究造血系统疾病的发病机理、探索新型治疗技术和新药研究的基本工具。

一、缺铁性贫血动物模型

缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。

IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下：

实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。

建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC配方配制，采用EDTA 浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。

模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。

需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。

二、再生障碍性贫血动物模型

再生障碍性贫血（aplastic anemia），简称再障，系多种病因引起的造血系统退行性变，红骨髓总容量不断减少，黄骨髓不断增加，造血衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。再障的发病机制尚未完全阐明，目前存在四种假说：（1）“种子”学说，有证据表明，再障与患者造血干细胞存在某种内在缺陷有关。（2）“土壤”学说，有证据表明，再障与患者的造血微环境存在某种缺陷，对造血支持不良有关。（3）“虫子”学说，有证据表明，免疫反应、药物、病毒损伤造血干细胞可致再障发生。（4）“遗传”学说，有证据表明再障具有遗传易感性。

目前，再障的发病机制、预防和治疗都是有待深入研究的课题，这些研究都需要大量的

动物模型。目前已报道的再障动物模型构建技术有：

（一）化学方法建模

1.腺嘌呤致大鼠肾性贫血模型

实验动物：SD大鼠，雌雄不拘。

建模方法：腺嘌呤肾毒性建模法，由肾脏分泌的粗红细胞生成素（EPO）是红系、巨核系分化、成熟所必需的细胞因子，腺嘌呤可导致肾脏病变，使EPO分泌不足，进而导致红系和巨核系造血障碍。王威等于1999年报道，利用饲喂含腺嘌呤0.75%，投饲量300mg/(kg.d)，连续喂养7周，获得肾衰竭贫血模型，实验动物红细胞、血红蛋白及红细胞压积等主要红系指标均、血小板均显著下降。

用途：可作为肾性贫血的发病机制研究、疾病进展研究和治疗药物筛选的动物模型。2.马利兰致骨髓抑制的再障模型

实验动物：小鼠、SD大鼠、家兔，雌雄不拘。

建模方法：利用马利兰的骨髓选择性抑制作用，一次性超致死剂量给药或者多次小剂量给药，均可导致造血干细胞、骨髓微环境的抑制，形成再障。（1）口服给药，15mg/kg/周或30mg/kg/周，总给药剂量达到118-153mg/kg时，可致家兔的再障，出现全血细胞减少、淋巴细胞比值增加、骨髓黄化和骨髓纤维化。（2）一次性给药，35mg/kg腹腔注射，可致大鼠再障。（3）口服给药，18mg/kg/天，连续给药10天，可致NIH小鼠再障，出现血细胞减少和骨髓有核细胞降低，建模稳定、实验动物存活率高。

3.苯致骨髓抑制的再障模型

实验动物：CD1小鼠、家兔。

建模方法：苯类化学物质进入动物体内后，在骨髓富集（可达血清浓度的20倍），对骨髓有较强的抑制作用，可导致再障。（1）皮下注射给药，苯与玉米油1:1混合物，4.0ml/kg，3次/周，共给药25次，可致CD1小鼠再障，表现为全血细胞减少、骨髓黄化、脂肪细胞等非造血细胞数目增多，骨髓间质血窦充血、出血伴水肿。（2）皮下注射给药，纯苯，0.5-1.0ml/kg/天，3次/周，连续给药2周以上，可致全血细胞减少、造血细胞减少。

（二）物理方法建模

1.外部照射建模法

实验动物：小鼠，雌雄不拘。

建模方法：γ射线等高能射线可穿透机体，起DNA损伤，干扰DNA复制，阻断有丝分裂，对造血干细胞等分裂增值活跃的细胞有强抑制作用。使用钴60等放射性同位素，亚致死剂量（6.0Gy）辐照以后，可致小鼠全血再障，维持时间较长，但辐照的剂量不好控制，稍大易致小鼠死亡，稍低则个别小鼠不易达到造血抑制效果。

2.内部照射建模法

实验动物：小鼠，雌雄不拘。

建模方法：放射性同位素153Sm（钐）、89Sr（锶）、32P（32磷）、186Re(186铼)、188Re(188铼)、105Rh（105铑）、177LU（177镥）和60Co（60钴），能产生β射线及亲骨性特点，进入人体后对造血组织进行内照射。将氯化锶，按每克体重6.4或2 μCi腹腔注射给予11~12周龄的小鼠，6μCi组动物于35d后全部死亡．2μCi组动物全部存活。6μCi组的小鼠于21d后股骨骨髓显示为脂肪髓。全血细胞减少，骨髓有核细胞数和CFU-S产率都减少。应用32P给小鼠一次静脉注射1.4mCi/kg体重也可导致再障。

三、溶血性贫血动物模型

四、白细胞减少症动物模型

人类白细胞减少症是临床上常见的病症。为了研究该病症的发病规律和筛选有效的升高白细胞的药物，可用环磷酰胺、马利兰等化学物质，过量x射线、γ射线辐射损伤，细菌、真菌感染和遗传因素来建立白细胞减少症动物模型。

1.环磷酸胺诱发的白细胞减少症动物模型(animaln model of cyclophosphamide induced

lenkocytopenia)

【造模机理】

环磷酰胺是抗癌药，是实验常用的烷化毒，能使脱氧核糖核酸变性、核分裂停顿，造成白细胞生成减少。

【造模方法】

以小鼠作为实验动物模型，按每公斤体重腹腔注射或皮下注射环磷酰胺50~70 mg。用生理盐水配成2 mg/m1的环磷酰胺溶液。每只小鼠注射0.5 mL，即可成功地复制白细胞减少症动物模型，按同样方法亦可复制白细胞减少症的大鼠模型。

2．食物中毒性白细胞缺乏症猫模型(cat model of alimentary toxic aleucia)

【造模机理】

A TA是由于人食用真菌污染的食物引起致死的真菌中毒。人的A TA表现为白细胞进行性减少、贫血、坏死性咽峡炎、发热、出血及脓毒血症。

【造模方法】

1981年，Lutsky等用倍半萜(Sesquiterpene)T-2毒素(从镰刀菌属的类分支孢菌中分离出来的单端孢菌素)胶囊，每48 h给健康猫口服0.08 mg/kg体重，直至发病．建立了食物中毒性白细胞缺乏症的猫模型。初期伴有轻度白细胞增多，随后是严重的进行性白细胞减少。伴有全身软弱无力，便血、后腿共济失调、呕吐、厌食、脱水、体重减轻。

【模型应用】

猫是一种较大的实验动物，可用来充分评价食物中毒性白细胞缺乏症的药理学、病理学、血液学、生物化学、免疫学及临床方面的问题。但是，小鼠、大鼠、脉鼠、免、犬、猪、绵羊、家禽、牛、马等均不能建立A TA的动物模型。

3．周期性粒细胞减少症犬模型(dog model of cyclic neutropenia)

【造模机理】

人类周期性粒细胞减少患者，病程迁延多年，周期有规律。常隔21 d(14~25d)发作一次，每次持续约1周。发作时有全身不适、头痛、感染、发热。婴儿患者病死率高。

【造模方法】

犬的周期性粒细胞减少是一种遗传性疾病，为常染色体隐性遗传。骨髓造血细胞用期性成熟受阻，仅见于大牧羊犬．出于具有淡灰色皮毛，又称为灰牧羊犬，中性粒细胞减少与其淡灰色皮毛紧密连锁，该犬一直作为周期性粒细胞减少症的动物模型。这种犬的红细胞与粒细胞成熟同时受阻，由于周围血红细胞寿命长，其成熟中断期相对较短，因此，不表现红细胞的减少：犬的中性粒细胞平均寿命仅10 h，当骨髓粒系造血细胞成熟中断时，骨髓储存的粒细胞迅速释放入血而耗尽。随后粒细胞严重减少[(0~100)×105／L]。每隔9~13d发作一次，

每次持续2~5d。伴严重感染，待粒细胞恢复后1~3d内感染消失。多数病犬寿命仅1~2岁，尸体解剖可见内脏与淋巴组织中有淀粉样物质沉积。患犬症状与人相似，但并发症更多、更严重，死亡更早。

4. 60Co-γ射线辐射建立小鼠白细胞减少症模型

【造模机理】

人类在自然条件下受到天然和辐射的影响常引发白细胞减少等病理现象,在临床上放疗也是治疗肿瘤的主要方法之一,但放疗的主要副反应为骨髓抑制，从而导致外周血白细胞下降。

【造模方法】

小鼠32 只，雌雄各半，分为4 组：ICR 小鼠雌性组、ICR 小鼠雄性组、C57BLP6J 小鼠雌性组和C57BLP6J 小鼠雄性组,每组8 只。自眼眶静脉丛取全血20μL，测定正常小鼠外周血白细胞总数后, 采用60Co-γ射线一次性全身照射小鼠, 源皮距为1.5 m，照射剂量为5 Gy，照射后第3 d 测定外周血白细胞总数。结果显示无论雄性还是雌性ICR 小鼠的正常白细胞数量均极显著低于C57BLP6J 小鼠。我们还探讨了辐射对于不同性别不同的影响，结果表明雄性C57BLP6J 在照射后第3 d白细胞数量显著高于其雌性小鼠, 提示雄性C57BLP6J

小鼠耐辐射能力可能强于雌鼠。通过动态观察小鼠照射后白细胞数量变化，发现在5Gy 的照射剂量下,小鼠的白细胞数量随时间持续降低,而且随时间推移小鼠出现被毛蓬松,活动减少，食欲减退、体重滞长等症状，至第5 d ICR 小鼠有死亡现象发生。由此提示在造模后应立即开始进行药物干预,可以达到较佳的治疗效果，药物干预最迟不可超过照射后第3 d。

五、白血病动物模型

白血病是一种造血系统的恶性疾病。根据不同分类方法，可有数十种类型。绝大多数人类白血病可以用化学(如烷化刑)、物理(如电离辐射)、生物(如逆转录病毒)以及转基因方法，在不同动物（小鼠、豚鼠、大鼠、猫、牛、长臂猿等）诱发白血病，建立动物模型。

1．T淋巴细胞白血病小鼠(L615)动物模型(animal model of T 1ymPhocytic 1eukemia)

【造模机理】

【造模方法】

1965年，由中国医学科学院血液研究所用津638病毒诱发的昆明小鼠白血病组织的无细胞提取液，皮下注射给新生615小鼠，经81 d潜伏期，取一只患白血病小鼠，用生理盐水制备脾细胞悬液(25％)，皮下注射给4只成年615小鼠，均发生白血病，平均存活时间为29.7 d，以患病小鼠的脾脏为瘤源，在615小鼠连续移植传代，能百分之百发病，且存活时间逐渐缩短，达30代后建成稳定的白血病模型．称L615白血病。

L615小鼠存活时间为(6.7±1.2) d，除皮下接种外，腹腔接种亦可百分之百发病，存活时间稍短，但无腹水形成。L615小鼠白血病对各类抗肿瘤药物有不同程度的敏感性。在7种抗代谢类药物中，6种有明显疗效，如6-巯基膘吟、5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶核苷可使40％以上的动物存活1个月以上；16种烷化剂中，14种有明显疗效，其中环磷酰胺等9种药物可使部分动物存活1个月以上。L615 T细胞白血病小鼠的脾细胞悬浮体外培养还建立了L615 T细胞白血病细胞系，可在体外长期传代培养，亦可长期冷冻保存备用。L615 T细胞白血病小鼠，亦是我国自己建立的T细胞白血病小鼠动物模型。它是人类T细胞白血病发病机制、药物筛选及药效、预后等研究的很好的动物模型。在此基础上建立了我国特有的小鼠白血病模型系统，如L7212、L7710、L7711、L759、L7811等均为T淋巴系统白血病。

2．粒单核细胞白血病（WEHI-3）小鼠模型(animal model of myelomonocytic leukemia)

【造模机理】

【造模方法】

用矿物油注入小鼠体内造成产生白血病的体内环境。1966年．Qsserman等建立粒—单双系细胞的白血病动物模型，用7周龄雄性BALB/c小鼠18只，每只小鼠腹腔注射医用石蜡油0.4 mL，在11周龄与15周龄时各重复注射一次。在7周龄与14周龄之间，皮下注射丙酸睾酮0.01 mg(溶于0.05 m1橄榄油中)，每周5次，17同龄时再皮下注射睾酮0.25 mg 一次。其个11只小鼠发生肿瘤，第一批是在6月龄时（即停止注射石蜡油2个月后)发生肿瘤，其余是在9~15月龄间发生。这种肿瘤称为wEHI-3。

从原代粒—单核细胞白血病小鼠取数个实体瘤制备单细胞悬液，移植传代给8只受体小鼠．全部发生肿瘤，移植后17~21d取其中的4只小鼠脾细胞悬液再移植传代，每种悬液注入4只受体小鼠，每组小鼠继续移植传代，头3次的移植传代时间为20 d，以后的传代时间则为14 d。获得4个亚系即为WEHI-3A、B、C、D。A亚系，绿色白血病，当粒细胞达50%以上时，其绿色是由于髓过氧化物酶与内颗粒结合所致，与原代肿瘤一样，有40条染色体，B亚系：非绿色白血病、39条染色体，在体外培养能形成集落。C亚系：非绿色白血病．40条染色体。D亚系：绿色白血病，为四倍体核型。其核型在移植传代过程中可发生变化，如B亚系，第2、第3次移植传代时，39条染色体有1条具有近端着丝粒的标记染色体，而在第14~15次移植传代之间就变成中间着丝粒的标记染色体，在移植过程中患粒一单核细胞白血病的BALB/c小鼠血象与骨髓象均有变化。

3. 人类白血病的小鼠模型(mice model of human myeloid leukemia)

【造模机理】

用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型，这是当今研究人类髓系白血病最理想的动物模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。

【造模方法】

(1) SCID-hu小鼠：CB-17 scid/scid 繁殖的近交小鼠(SCID)，6~8周龄时用抗生素处理。在无菌条件下，从19~23 妊娠周龄的胎儿取出股骨和胫骨，剪成5mm×５mm×l０mm的骨片，植入SCID小鼠皮下，并从每个胎儿供体制备胸腺细胞用于检测同种异体HLA。

(2) 白血病细胞注射：急性髓性白血病患者骨髓细胞(0.4～2) ×104个活细胞(常用冻存解冻后的细胞)悬浮于含10％胎牛血清的ＲPMＩ1640培养液20 d,用微注射器将细胞悬液直接注射人6~8周前植入SCID-hu小鼠的人胎骨片内。选择移植骨与白血病细胞的供体是HLA 同种异型，便于追踪人肋骨移植片中细胞的来源。白血病细胞的体内传代：将已生长有白血病细胞的骨移植片再制备细胞悬液，取(0.5~2)×106个活细胞，注入第2个SCID-hu受体小鼠的移植骨片内。处理小鼠MHC-I(主要组织相容性复合体I类)抗原的单抗，直接与染料荧光素异硫氰化物或藻红蛋白结合，用流式细胞仪将细胞分类并分析细胞来源。

胎骨植入后2～3周时，骨片内有坏死与纤维化，CFU－GM与BFU－E减少，未见造血中心；移植4～5周时，骨片内出现由淋巴系与未成熟的髓系细胞组成的造血中心；6～8周后，植入胎骨片结构与正常胎儿造造血骨髓类似，并能维持正常造血达20周。用MEＭ

－43(人类细胞抗原的特异抗体)与Ly5.1(小鼠血细胞的特异抗体)检测，植入骨片的细胞中人类细胞占70％以上，而小鼠细胞仅占5％~20％。胎儿骨片内的人类基质细胞可刺激人的造血干细胞的增殖与分化，以维持正常造血。将人的急性髓性白血病细胞注入SCID-hu小鼠的一块胎骨片内，4~6周后，胎儿骨片内的正常造血细胞被急性白血病细胞的增殖所取代，而且还选择性地转移到植入的其他胎骨片内。

【模型应用】

该模型是人类白血病细胞生长在小鼠体内的人类造血微环境中，因此能更精确地用来研究人类自血病发病机制与对新疗法的评价，是目前研究白血病的最佳动物模型。该模型的建立原理与方法也适用于其他白血病与恶性肿瘤动物模型的建立。但应注意植入小鼠的胎儿骨片与成人骨舱造血钉些不同。

4. 急性B 淋巴细胞白血病动物模型的建立

【造模机理】

急性白血病是儿童常见的血液系统肿瘤,急性淋巴细胞白血病(ALL ) 约占70% , 其中80%来自B 细胞系,N alm-6 是急性人B 淋巴细胞系白血病细胞株,在普通的RMPI-1640 培养

基中容易生长，繁殖快，恶性度高, 能引起弥散性疾病, 可移植入裸鼠或SC ID 小鼠。裸鼠T 淋巴细胞缺陷，而SC ID 小鼠T、B 淋巴细胞联合缺陷, 更容易移植成功, 但是价格昂贵。为此，本实验采用裸鼠建立白血病动物模型。

【造模方法】

①用无菌PBS 液将环磷酰胺浓度调整到10 mg/mL, 腹腔注射环磷酰胺2 mg/只, 连续注

射2 d; 24 h 后,收集处于对数生长期的N alm-6 细胞, 1 000 r/min 离心5 min 后, 悬浮于无菌PBS 中, 调整细胞密度至2. 5×107个/mL, 尾静脉注射5×106个/只(200 μL)

②每隔1～2 d 观察小鼠症状, 以后肢出现瘫痪为发病标准, 记录小鼠发病和死亡日期。

③待小鼠濒死时, 颈椎脱臼法将其处死, 立即取小鼠的肝、脾、肺、心脏、肾、肠、脑

组织、骨髓、胰腺、睾丸、卵巢等, 经10% 中性福尔马林固定脱水、透明、浸蜡、包埋, 制成石蜡切片, H-E 染色后在光镜下观察各个组织肿瘤细胞浸润情况。

图1 裸鼠B 系ALL 白血病动物模型

Fig.1 The nude mice model of B-ALL

肿瘤模型小鼠组织内有大量肿瘤细胞浸润(见箭头所示)

图3小鼠组织病理检查结果(×100 倍)

Fig.3The histopatho logical exam ination of each organ (×100)

【模型特点】

白血病小鼠的发病时间不仅与小鼠周龄有关, 也与注射的肿瘤细胞数目有密切关系, 但与雌雄关系不大。Gunther 用6 周龄的SCID 小鼠, 每只注射1×106个N alm-6 细胞, 平均32 d后肢行动迟缓, 39 d 瘫痪; U ckun 用6～7 周龄的雌性SCID 小鼠[ 5 ] , 每只注射1×106个N alm-6细胞, 有56% 的小鼠平均33 d 发生瘫痪, 39 d全部死亡, 两研究小鼠发病时间相似; Herrera用10～13 周龄的SCID 小鼠[ 6 ] , 注射5×106个N alm-6 细胞后平均36 d 发病。本研究采用5～6 周的裸鼠, 每只注射5×106个N alm-6 细胞, 平均20 d 发病, 模型建立成功率100% , 但是发病时间比上述报道早, 可能是由于使用的小鼠周龄小, 注射肿瘤细胞数目多, 进入小鼠体内后生长繁殖较快, 导致小鼠发病较早。

【模型应用】

2.人慢性粒细胞白血病动物模型的建立

【造模机理】

目前建立人慢性粒细胞白血病动物模型的方法主要有3 种,包括用慢性粒细胞白血病细胞种植免疫缺陷鼠(SCID 或NOD/SCID) 、用表达P210bcr/abl逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植入正常鼠体内和构建bcr/abl转基因鼠。

【造模方法】

免疫缺陷小鼠－人慢粒白血病模型：

2002 年Ramshaw 等发现在体外半固体培养基上用人GM－CSF 拮抗剂E21R 可抑制全部7 个CML 患者CML 细胞的克隆形成，继而他们采用人CML 细胞(1×108细胞／只) 分别输入SCID 鼠和人GM－CSF 转基因SCID 鼠体内，发现人CML 细胞在SCID 小鼠体内难以定植，而在转人GM－CSF 基因的SCID 小鼠体内6 周后CML 细胞数量可达到高峰，证明人CML 细胞在体内、体外生长均依赖人GM－CSF[7 ] 。Nicolini 等用表达人特异性的造血生长因子IL23、GM－CSF、SF 的逆转录病毒载体转染的小鼠骨髓细胞接种NOD／SCID 小鼠，324周后小鼠血清IL23、GM－CSF、SF 可达ng／ml 水平,将人造血干细胞或胎肝细胞移植到这些NOD／SCID 小鼠体内，和未转染造血生长因子的NOD／SCID 小鼠相比，发

现人髓系白细胞数明显增加，人造血干细胞明显向髓系方向分化, 而红系细胞和淋巴系细胞明显减少[8 ] 。由此可见，转人GM－CSF 基因的SCID 鼠或NOD／SCID 小鼠可用于制备较为理想的人CML 动物模型。

用表达P210bcrPabl 逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植正常鼠：Daley 等分离雌性BALB／c 小鼠的骨髓细胞，用表达bcr／abl 融合基因的逆转录病毒载体转染，筛选后注入到5 只6～12 周龄经致死剂量(900 cGy) 照射的同源雄性BALB／c 小鼠体内，小鼠出现CML 相关症状以及急性淋巴细胞性白血病[9 ]。

bcrPabl 转基因小鼠模型：Honda 等[18 ] 对P210bcr／abl转基因小鼠进行深入研究。他们克隆分析小鼠Tec 基因的启动子序列和功能，发现由Tec 启动子调控的基因仅特异性地表达在造血干细胞的细胞质中。他们用小鼠的Tec 基因的启动子序列( -1948 至+ 22) 代替以前所使用的MT 启动子作为调节序列，制备转基因载体。在所产生的87 只转基因鼠中,有84 只转基因小鼠首先出现粒细胞异常增生、高血小板血症，经一定时间后发生骨髓增殖综合征(MPD)，和人CML 极为相似。其中只有两只转基因鼠在出生后即表现为急性白血病，但它们的子代经过一段潜伏期后表现骨髓增生综合征。这一研究表明选择恰当的启动子对构建CML 转基因鼠是十分重要的。

【模型特点】

【模型应用】

CML 动物模型的研究发展迅速,分子遗传学和分子生物学技术的进步使我们有可能制备出更加完善的CML 动物模型,用于我们对CML 发病机理的研究和有效治疗方法的探索。

六、出血性疾病动物模型

出血性疾病种类很多，根据参与止血机制的系统可分为血管因素的异常、血小板因素的异常、凝血系统的异常以及纤溶系统的异常。特发性血小板减少性紫癜（ITP），因血小板因素异常导致。获得性血友病A则因凝血系统的异常导致。目前，该两种疾病已有相应的动物模型，均为兔和小鼠。

1. 特发性血小板减少性紫斑(idiopathic thrombocytope nic purpura,ITP)兔、小鼠模型

【造模机理】

用含抗血小板抗体的血清注入实验动物．注人的抗血小板抗体与相应抗原发生反应，使动物体内血小板消耗而导致血小板数量减少．故又称为免疫性消耗性血小板减少症。

【造模方法】

ITP兔模型：采用新西兰白兔，雄雌均可，体重2～4kg；脉鼠，大于3月龄均可，雌雄不拘。

(1) 豚鼠抗兔血小板血清的(GP-APs)制备：用米巴比妥钠(30 mg/kg体重)从耳缘静脉注射麻醉免，按6:1(V/V)从免颈动脉取全血与酸性枸椽酸右旋糖(Acid citrate dextrose，ACD )混合，pH值4.5，经离心，分离血小板，并洗涤，用生理盐水稀释制成混悬液。用上述血小板混悬液(10９血小板)注人豚鼠腹腔，此后每间隔1个月注射一次，连续2次，共注射3次(3×10９个血小饭)。末次注射后的第6天，从脉鼠心脏穿刺取血，离心后取上层血清，随即分别用等量1:1(V/V)兔压紧红细胞和洗涤过的兔淋巴细胞各吸附血清一次，用生理盐水稀释，

即为豚鼠抗免血小板抗血清，分装后储存于-70℃冰箱待用、按ELISA法和放射免疫沉淀法检测抗血清效价。

(2)兔ITP模型的建立：

1）急性短期兔ITP模型：苯巴比妥钠麻醉兔，插入颈动脉套管后。耳缘静脉注射豚鼠抗兔血小板血清(根据抗血清效价与降血小板之间的量效关系，确定抗血清的注射量)。间隔15min，从颈动脉套管取全血注入装有EDTA的管内做血小板计数，在注射后的90 min，再从颈动脉套管取血，置于装有ACD的试管内，测定血小板结合的免疫球蛋白(platelet associated IgG，PA IgG)。

2）慢性持续性兔ITP模型：方法同上，于0、1、2、4、6、8 d分别从耳缘静脉注射脉鼠抗兔血小板血清(GP-APS)。在末次注射后分别在15 min和90 min取血做血小板汁数及检测PAIgG，GP-APS的注射量和次数可根据血小板计数的结果进行调整。

ITP小鼠模型：采用BALB/c小鼠，8周龄，体重18~22g，雌雄均可；豚鼠大干3月龄，雄雌不拘。

(1) 豚鼠抗小鼠血小板抗血清的制备：①BALB/c小鼠乙醚麻醉后，从心脏取全血置于EDTA-Na2抗凝管内，分离血小板并洗涤，用生理盐水稀释成混悬液；②取上述血小板混悬液，分别与等量完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂混合成油包水状。制备抗原，取含福氏佐剂抗原于0周注射豚鼠足掌、背及腹部皮下至少4点；取含不完全福氏佐剂抗原，分别于1、2、4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少4点，第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，离心后取上层血清，即为豚鼠抗小鼠血小饭抗血清(GP-APS)。随后用BALB/c小鼠红细胞吸附至少两次，用生理盐水稀释成不同浓度的GP- APS。储存于-20℃冰箱待用。

参照ELISA法，可用国产冻干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶蛋白A酶标抗体，检测抗血清效价。

(2) ITP小鼠模型的建立

1）急性短期ITP模型：于BALB/c小鼠腹腔内注射抗血清(100μL)，造成小鼠一过性血小板减少。

2) 慢性持续性ITP模型：于0、l、2、4、6、7 d分别于小鼠腹腔注射APS，每次100μL，造成小鼠慢性持续性血小板减少。

兔和小鼠免疫性血小板减少性紫癫的共同特征是：（1）抗血小板血清注入动物后，可引起血小板计数显著减少和PAIgG水平升高，二者呈负相关；（2）PAIgG升高水平与注入抗血小板血清的量以及血小板减少的严重性在一定范围内呈正相关，即注入的抗血清越多，PAIgG升高越多，血小板减少程度越严重；（3）血小板的寿命缩短；（4）伴有发热、紫癫及止血障碍等。这些特征与人类ITP的病人是相似的。其他方法如用ADP、马利兰、环磷酰胺、γ射线照射等均能引起血小板减少，PAIgG水平正常。因此采用免疫法建立的兔或小鼠的血小板减少模型优于其他方法，这对于人类ITP的发病机制的研究、抗血小板减少新药物的筛选更有意义。

2. 获得性血友病A动物模型：

【造模机理】

【造模方法】

获得性血友病A兔模型：Turecek等于90年末建立了该方法。输注获得性血友病A患者血浆入健康新西兰兔体内，测定注射血浆前30 min及注射血浆后30 min、60 min、90 min、120 min时间点兔血浆活化部分凝血活酶时间（aPTT），观察获得性血友病A患者体内FⅧ抑制物对兔血浆aPTT值的影响，以等量正常人血浆注入新西兰兔作为对照。

获得性血友病A小鼠模型：【模型特点】

【模型应用】