ELISA检测甲胎蛋白

实验设计

ELISA一步法检测甲胎蛋白试验精密度分析

一、实验原理：

1、用抗-AFP单克隆抗体包被反应板，加入标准品和辣根过氧化物酶标记的抗-AFP多克隆抗体，然后进行温育、洗涤，形成复合物，加入底物，显色，用酶标仪检测出吸光度。然后对所测得的吸光度值进行精密度分析。

2、精密度是在相同条件下，对同一被测物多次测量，每次测量结果之间的接近程度；用标准差（S），变异系数（CV）,组内相关系数（ICC）来衡量一组平行测定值的精密度。

二、实验材料

1、实验仪器：加样器（20ul，50~250ul）、恒温箱或恒温水浴箱、洗板机、酶标仪、吸咀、吸水纸（或卫生纸）、消毒缸，垃圾桶。

2、实验试剂: 甲胎蛋白（AFP）定量检测试剂盒（抗—AFP单克隆抗体的微孔板、酶结合物试剂、AFP 标准品1 20ng/ml、标准品2 400ng/ml 、浓缩洗涤液、显色剂A显色剂B 、终止液、封板膜）

三、实验方法

1）用前30分钟从冰箱中取出试剂和待测标本，恢复至室温。

2)将恒温箱或恒温水浴箱调至反应温度37C0。

3）将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水稀释至500ml后备用。

4）编号：将微孔按序编号。AFP 标准品1 20ng/ml 和AFP标准品2 400ng/ml 各20 孔。

5）加样:加入标准品和辣根过氧化物酶标记的抗-AFP多克隆抗体各50ul，轻轻

振荡摇匀。

6）温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。

7）洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机每次浸泡20秒5次，最后一次结束后在纸上尽量拍干。

8）显色：每孔加显色剂A 和显色剂B 各50ul 或1滴，轻轻振荡混匀，置室温避光显色5分钟，温育10分钟。

9）加终止液：每孔加终止液50微升，轻轻振荡混匀。

10）比色测定：设定酶标仪主波长为450nm ，次波长为630nm (用双波长检测），测定出各孔的吸光度。

四、实验结果判断

1、标准偏差越小表示精密度越好。（分为优、良、中、差）

2、变异系数越小表示精密度越好，且变异系数<15% 。

3、计算组内相关系数（ICC ），-------ICC 表示测量对象个体差异的方差占总方差的比例，0≦ICC ≦1，ICC 越接近1，说明个体差异对总方差的影响越大，测量误差对总方差的影响越小。一般认为ICC ≧0.75时，说明测量结果的可重复性较好。

五、实验计算及统计学处理

标准差（s ）=1

2x)^(--∑n x 变异系数（CV ）=x

S

组间均方（MSa ）=Va

SSa

组内均方（MSe ）=

Ve SSe 组内相关系数（ICC ）=

MSe

n MSa MSe MSa )1(-+- 六、质量控制 1.对所选的标准液进行校准。

2.对所使用的方法（包括标准分析方法）自行配置标准物和选用质控样品进行方法精密度和准确精密度的准确测定，通过标准物稳定性的观察，使用频繁的方法绘制质量控制图。

七、注意事项

1、使用前试剂应摇匀，滴瓶应垂直滴加，同一厂商不同批次或不同厂商的试剂盒中各组分不得混用或互换。

2、冰箱保存标本在使用前应恢复到室温，轻轻摇匀，若标本有沉淀，应离心去除，并确定未变质才能使用。

3、加标本和液体试剂时必须用加样枪，并进行校对其准确性。加入不同标本或不同试剂组分时，应更换加样器吸头，以防止出现交叉感染。

4、严格控制每步反应温度和时间，操作应紧凑。

5、显色时必须先加底物液后加显色洗液，以免显色过低。

6、用酶标仪比色读取结果时，应檫干酶标板底部，且孔内不能有气泡，不要碰触底部的外壁，指印或划痕都可能影响A 值。

7、封板膜不能重复使用。

8、所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。

9、终止液为2M 硫酸，使用时应注意安全。

八、影响因素

试剂、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。