生物样本前处理技术

【讨论】生物样本前处理技术

样本前处理技术在分析方法中占有极其重要的地位，很多分析问题都可以通过样本前处理解决，本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述，以期形成一个系统。本文将分为

1.样本分类及采集

2.初步处理

3.游离药物分离

4.萃取技术

5.萃取后过程

五个部分进行分别阐述。

其中有不少为个人观点，希望各位战友能不吝指正（纠正错字，纠正观点，进行讨论都欢迎），希望和园内战友共同学习。

-------------------------------------------------------------------------------- 楼主快点介绍吧。

-------------------------------------------------------------------------------- 1.1 生物样本分类

生物样本多种多样，有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。（以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年）生物样品可大致分为

①均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液；

②非均匀样品：心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。

Ruth Endacott[1]总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用。

[1]:Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5.

1.2 生物样品采集

1.2.1 血样

组成

血样包括血浆、血清和全血，其中最常用的是血浆。一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况，而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。

欲借助血药浓度来了解药物体内的转运规律和用于剂量调整, 应待药物在血液中分布均匀后再取样。直接抽取动脉血或自心脏取血无疑是最理想的方法，因为动脉血中的药物已充分混匀，但此法仅适用于动物实验研究。就采血方式而言，目前使用较多的方法是自静脉采血，并且视采血次数的多少和实验方法需要，一般每次采血1－5ml。做动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一，以免因血流动力学改变而影响研究结果。表1列出常见动物的采血方法。标准的犬类或猫类动物收集血样方法参见Lucas RL 的综述。血样储存及储存条件参见下表2。

血浆及血清

血浆(plasma)的取得是在加肝素、草酸盐、枸橼酸等抗凝剂的全血经离心后分取上层清液，其量约为全血的一半。血清(serum)则是由血液中纤维蛋白原等影响下引起血块凝结而析出，离心后取上层清液而得，血块凝结时，往往易造成药物吸附的损失。通过制备后的血清一般可以得到全血的40%，而血浆会比血清多，大约占全血的50％，个体差异较大。

血清和血浆有以下三点区别：1。血清中没有纤维蛋白原 2。血清中无参与凝血机制的血浆

蛋白 3。血浆无一些凝血过程中血小板释放的物质。

在药代研究中两者各有优缺点：

1。血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA），可能会干扰化合物的检测（结合等），血清则无。2。血浆中蛋白稍多，可能会在SPE中产生诸如堵柱子等情况，干扰样本制备过程（这一点其实差别不明显）。

3。血浆制备快速，直接低温或常温离心后即可分离，血清制备耗时较长。这一点对药代试验影响较大，因为给药后4小时内一般取血点都较为密集。

但血清分离胶的出现可解决这个问题，详见本文

4。血清的凝血过程可能会因为与药物产生吸附作用，从而减少血清的含量，并且有可能造成浓度不平行现象。

血样采取量受到一定限制，尤其是连续取样时，病人感到负担，不易得到配合。血样一般每次取1-5mL，但随着高灵敏度测定方法的建立，取样可少到0.1-0.3mL，可改用手指取血，从而易为受试者接受。

全血

全血(whole blood)也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。

对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中浓度成正比，全血不能提供更多数据，全血药物浓度往往不能很好反映药物的药理作用强度，不能作为作用部位药浓的可靠指标。常选用血浆或血清进行体内药物分析，其原因如下：

1. 血细胞中药物暂时仅作为药物“储库”而失去药理作用，不是反映作用部位药浓的改变，因而不能与药效建立相关关系。

2. 血细胞密集现象。有一些药物如米帕林，它主要集中于白细胞内，只要有生理病理因素导致白细胞增加，就会引起全血药物浓度相应升高，其全血药物浓度变化仅反映白细胞数量的改变，而不是反映作用部位药浓的改变。有些药物(如氯噻酮)可与红细胞结合，其动力学行为与在血浆中不同。

3. 全血净化手续较烦、尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。

但有时必须使用全血进行体内药代动力学研究。在如下情况下，需要使用全血进行PK研究：1. 如环孢A广泛分布于血液各成分中，已采集的血液样品内CsA在血浆、单核细胞和红细胞中的分布会随室温发生变化，见表3。

温度升高后CsA自红细胞中释放量增多，血药浓度上升，因此抗凝血离心分离血浆过程中，室温对血浆药浓就有影响，并且难以控制。抗凝血即使在同一室温条件下，不同时间离心的血浆中CsA浓度亦有变化，在0－1hr内药浓逐渐降低，1－3小时才恒定。另外，由于CsA 有效血药浓度较低，并且药物又大量分布于血细胞中，因此血浆/血清测定其浓度时，达不到仪器检测灵敏度要求。鉴于上述原因，在进行CsA PK研究时就常使用全血样品，而不用血浆或血清[2]。

2. 有时作药物筛查时也会使用全血样本。

全血样品是由血浆和血细胞（包括抗凝剂）组成，是非均匀溶液，测定时必须使血细胞破裂（如测定CsA时加入氢氧化钠，超声或冻融）使之成为均匀溶液。

[2]:《生物药物分析（第二版）》曾经泽 1998年 p33

溶血

血浆如果处理不当会造成溶血现象，溶血大致由以下几方面造成：

a 强烈振荡（包括真空管采血时，抽血针内径太细而导致红细胞破裂；血液注入容器中时未取下针头，或用力推出产生大量气泡；抽血速度过快针尖在静脉中探来探去；注射器与针头连接不好）

b 加入渗透压低于0.9％生理盐水的溶液导致红细胞破裂

c 将全血冷冻导致红细胞破裂

d 一些临床原因，如在有血肿的地方采集血样；病人自身有溶血性疾病；压脉带捆扎时间过长，淤血过久（为避免淤血，压脉带压迫时间最好不要超过三十秒）；穿刺不顺利损伤组织过多；抽血消毒时酒精未干就进行抽血；注射器和容器不干燥，不清洁。

1.2.2 尿样

尿药测定主要用于药物剂量回收、药物肾清除率及代谢物类型等研究，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢多态性等研究。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型或代谢物及缀合物形式排出。尿液药物浓度较高、收集量可以很大，但尿液浓度变化较大，所以要测定一定时间内药物总量(一般收集4小时内累计量)，这就需要记录排出的尿液体积及尿药浓度，若药物排泄与尿液pH有关，还需要测定尿液的pH。

尿样的优缺点：所有体液样品中尿样最容易获得，并且样品量多．内含药物(母体药物与代谢物)浓度高，正常尿液中仅含微量蛋白，不需去蛋白处理，所以尿样常用作药物体内代谢研究的首选样品。但是，由于尿中药物浓度改变不直接反映血药浓度，并且在尿液排出过程中，不仅包括肾小球的滤过，还包括肾小管的重新吸收，因此，尿液与血液中药浓的相关性很不理想。此外，尿液的采集还具有在短时间内不可能多次取样，排尿时间较难掌握以及不易采集完全的缺点。而且，尿液成分复杂，已知内含具有紫外吸收的化合物就达数十种，其中很多是极性高的化合物，部分能随药物一道混入提取物中，当用HPLC—UV测定时，常出现特大的紫外吸收杂质峰，因此，分析尿药浓度时，应选择合适的萃取条件，使样品充分净化后再测定。相比血浆而言，尿样还是比较干净的。

1．2．3 唾液（saliva）

1．2．3．1 唾液组成

唾液用作药浓监测及药代动力学研究的报道近年逐渐增多。唾液中药物浓度通常与血浆浓度相关，因此利用唾液作为样本，就成为一种简便的、无损害的并能反映血药浓度的方法。唾液的采集不受地点、时间的限制，容易获得，且许多用于血浆测定的方法稍加改进即可用于唾液的药浓测定。唾液是分别由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌汇集而成的混合液体。唾液分泌量每日约1200mL，pH范围一般在6.2-7.4之间。唾液内含电解质与细胞外液相似，如含K+, Na+, Cl-颌HCO3-，以及蛋白质、粘液和淀粉酶等有机成分，蛋白含量很低，仅为血浆中的十分之一左右。

1．2．3．2 唾液采集

唾液的采集一般是在漱口后15min左右，收集口腔内自然流出的唾液（混合唾液）。若需专门收集某一腺体（如腮腺）分泌的唾液，则需用导管将其导出，分开收集。采集混合唾液也可使用刺激唾液分泌的方法，如咀嚼一些惰性材料（如石蜡或塑料片）或用味觉刺激法（如用酒石酸、维生素C等）。刺激唾液分泌方法可获得大量唾液，但或引起唾液成分改变。唾液样品收集好后，应离心分出上清液，将黏附蛋白去除后，冷冻保存直至测定。

1．2．3．3 唾液样品的优缺点

唾液样品的优点是采样为非伤害性方法（nonincasive method），病人易接受，可避免穿刺血管采样时可能引起的交叉感染。唾液采样不受时间、地点限制，一些灵敏度较高的血药浓度分析方法可直接或稍加改进后用于测定唾液药浓。目前还发现一些药物在唾液中的浓度与血浆中游离浓度十分接近，存在用唾液药浓代替血浆中游离药浓，直接与药物药理作用强度相联系的可能性。

唾液样品的缺点是唾液药浓一般低于血浆药浓（见表3），并且不同唾液腺分泌不同的唾液，其成分也不相同，即使同一唾液腺也可因是否受到刺激或因生理、病理状况的改变，其分泌的成分有差异。采用刺激法增加唾液分泌虽然可获得较多样品，但可能影响药物的浓度。当唾液pH变化时，还会影响一些弱酸性药物和弱碱性药物（pKa 5.5-8.5）的电离，电离后的