拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆
拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆
摘要：随着农田生态系统中氮肥的过量施用对生态系统造成的污染日益加重，提高作物对氮素的利用效率、减少氮肥对生态系统的污染成为目前的一个研究热点，迫切需要加强对调控NO3-的基因及其分子机理的研究。本研究对硝酸调控基因突变体进行筛选，并利用图位克隆技术对突变基因进行克隆，完成突变基因的初步定位，为下一步精确定位打下基础，进而发现调控硝酸代谢的新基因，并研究其功能和分子机理，为作物的高氮效利用提供理论依据。
关键词：拟南芥；硝酸调控基因突变体；突变体筛选；图位克隆
Map-based cloning of the nitrate regulatory mutant gene
in Arabidopsis thaliana
Abstract:The excessive application of nitrogenous fertilizer has exerted a severe threat on the ecosystem. Improving the nitrogen use efficiency of crops, reducing the pollution of nitrogen fertilizer on ecosystems has become a new hotspot of research globally, The urgent need is to strengthen the research of NO3-regulated genes and their molecular mechanism. This research is to verify one nitrate regulatory mutant and clone the corresponding gene. Further study including new gene’s function and molecular mechanism will be helpful to decipher the network of NO3- regulation pathway. This will provides more theoretical basis for breeding new varieties of crops with high nitrogen use efficiency. Key words:Arabidopsis thaliana; nitrate regulatory gene mutant; mutant screen; map-based cloning.
1 前言
氮素是植物生长发育所需要的最主要的大量元素之一，对作物最终产量的贡献为40%-50%，是植物体内蛋白质、核酸、磷脂和某些生长激素的重要组分之一[1]，
通过对植物光合作用、内源激素、水分吸收利用、体内抗氧化系统的影响直接或间接左右着植物的生长发育[2],因此施用氮肥可提高并保持作物的高产。氮素的缺乏一方面可导致植物生长缓慢,产量下降;另一方面可使粮食作物籽粒蛋白质含量下降,降低品质[3]。由于氮肥生产原料可直接来自大气,几乎不受限制,因此在过去的几十年里，在发达国家和一些发展中国家例如中国和印度，农业上的施氮量急剧增加[4]，使农业产量得到很大的提高。
然而，施到土壤中的氮肥并没有全部被作物吸收利用，相当一部分流失到环境中，造成了极大的资源浪费。研究表明，全球的氮肥有效利用率从1960年的80%下降到2000年的30% [5]；中国目前氮肥年施用量是2500万吨，是世界平均水平的3倍，但是氮肥的利用效率却只有30%。同时，氮肥的过量施用也带来了严重的环境问题。未被吸收的氮素通过地表径流、淋洗、以及挥发等途径流失，导致了地表水源的富氧化作用、饮用水的硝酸盐污染和土壤酸性化[6、7]；硝态氮的反硝化和铵态氮的挥发都可使氮素通过气体形式损失,并对大气造成污染,一方面导致温室效应,另一方面对臭氧层也有破坏作用。这些问题日趋明显，亟待解决。
提高氮肥利用率,减少浪费和污染,一是要通过改进氮肥品质和施肥技术，二是要提高植物对氮肥的吸收利用效率，而提高作物的氮素利用率是解决这些问题的关键。氮素利用率高的品种只需要较少的氮肥，就能获得并保持高产，从而可以降低施氮量，这样既节省能源，又减少环境污染，并且降低农民的土地投入成本。因此，培育高氮效的作物新品种对于发展可持续农业、改善生态环境和保持人类健康都具有非常重要的意义。近些年来，世界上的一些发达国家（如美国、英国等）和国际著名的公司（如孟山都、杜邦等）均设立了专门的作物氮素利用研究机构，以加强这方面的基础研究和新品种选育。我国在提高小麦、玉米等作物的氮素利用率方面也做了大量工作。但迄今为止在高氮效新品种选育方面的进展尚十分有限[8]，主要原因在于控制植物氮素吸收利用的过程和分子机制还不清楚。因此，迫切需要加强-的基因及其分子机理的研究。
对调控NO
3
植物能够吸收土壤中的NO3-、NH4+和有机氮，其中以NO3-形式为主。在NRT1和NRT2家族的NO3-转运蛋白的作用下，NO3-被植物的根所吸收并转运到细胞内；进入细胞后，被NO3-还原酶（NIA）还原成NO2-，然后由NO2-还原酶（NiR）将NO2-转变成NH4+，最后NH4+被同化，形成各种氨基酸[9-11]。NO3-既具有营养的作用，又是一个信号分子。NO3-处理拟南芥会在几分钟内诱导NO3-代谢途径中基因（NRT2.1，NIA1，NiR）的表达[12]，其它一些与碳代谢和能量代谢有关的基因也受到诱导[13]。植物对NO3-的长期效应则表现在根的生长、根系结构、根与地上部的比
率和发芽率等方面的变化[14，15]。
关于植物对氮相应的调控基因及机理，前人通过反向遗传学和系统分析的方法进行了研究[16，17]，已发现下面几个基因参与氮的调控，较早发现的是1个转录因子：ANR1，在最近几年又报道了NLA、AtCIPK8、AtCIPK23、microRNA167、LBD37/38/39和AtNLP7 [18]，Tsay实验室发现了植物的第一个NO3-感应基因NRT1.1[19]。
但长期以来，由于缺乏一个有效的正向遗传学方法，在调节NO3-的基因及机理方面的研究受到严重阻碍。世界上有多个实验室试图用受NO3-诱导的启动子构建NO3-突变体筛选系统，但鲜有能有效筛选出NO3-突变体的成功报道，主要原因在于调节NO3-的顺式元件和反式因子过多，难以找到有明显调控突变的单一突变体。Crawford实验室经过多年的努力，发现了第一个NO3-的顺式元件，并将之与一个单一的增强子片段和YFP相连接，从而开发合成了一个响应NO3-的启动子。利用这一启动子，设计了一套筛选NO3-调控突变体的方法。通过该方法已经筛选出了2个拟南芥突变体，并将其成功地克隆出来，经进一步鉴定，这两个基因都参与NO3-的调控[20]，证明该系统能有效地筛选出NO3-调控突变体。该系统采用的NO3-顺式元件和增强子片段长度都较短（分别为180bp、131bp），而且只响应NO3-，不响应NH4+，所以选出转录因子上游基因突变体的机率比用pNRT2.1::LUC系统选出的机率更大，选出的NO3-调控突变体类型会更多。
图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了。
目前，利用上述由NO3-顺式元件、增强子和YFP构建的NO3-调控突变体筛选系统开展的拟南芥突变体筛选工作，已经得到了2个新的突变体GD75和GD69，初步的测序结果表明这2个突变体不是已知调控基因突变造成的。
本实验利用图位克隆法对拟南芥NO3-调控突变体GD75的突变基因进行克隆：首先将以Col为背景的SS204-9经EMS诱变得到突变体，再将其与Col野生型回交两次（清除其它可能的突变）后得到突变体GD75（遗传分析表明该突变体是由隐性突变造成的），其NO3-调控基因（以A表示正常基因）经诱变发生了突变（以a表示突变基因），之后与Ler野生型（AA）杂交得到F1代（Aa）。F1代的两条同源染色体分别为携带突变基因a的Col染色体（Col-a）与携带正常基因A的Ler 染色体（Ler-A），之后F1经自交得到F2代，在此过程中同源的染色体可发生交叉
互换，但在Col的突变位点附近发生交叉互换的几率较低。，所以F2代群体中含有AA、Aa、aa三种基因型，筛选出aa基因型进行初步定位（Rough mapping）。设计特异性引物，使其可同时扩增Col片段与Ler片段，但所扩的Col片段（150 bp）略长于Ler片段（130 bp）。当引物与突变基因连锁时，二者相距较近，所以只能扩出突变位点附近未发生交叉互换的Col片段；当引物与突变基因不连锁时，二者相距较远，所以能扩出发生交叉互换的Col-Ler片段。找到与突变基因连锁的引物，即完成初步定位（见图1-1）。在此基础上进一步设计引物进行精细定位（Fine mapping），不断缩小范围，最终将突变基因定位于较小范围内，再通过测序得到其基因序列，通过与正常基因序列的比对找到突变碱基。
图1-1 初步定位流程
Fig.1-1 Process of rough mapping.
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
本实验所用植物材料为以拟南芥Col生态型为背景的SS204-9、GD75、以及GD75与Ler野生型杂交得到的F1代经自交得到的F2代。
2.1.2 酶和试剂
2.1.2.1 酶
Taq DNA Polymerase （天根生物公司）
2.1.2.2 试剂
异丙醇，ddH2O，70%乙醇溶液，75%乙醇溶液，2.6%次氯酸钠
吐温水：5滴Tween-20，500 mL ddH2O
KNO3培养基：
Compound Final concn Stock mL of stock / liter medium
KPi (pH6.0) 10 mM 1 M 10
KNO3 2.5 mM 1 M 10
MgSO4 2 mM 1 M 2
CaCl2 1 mM 1 M 1
FeNa2EDTA 0.1 mM 20 mM 2.5
MN solution 1x 500x 2
Sucrose 0.5%(w/v) 50%(w/v) 10
Agar 10
500x MN solution:
Compound Final concn 500x Stock Per liter stock
H3BO350 microM 25 mM 1.55g
MnSO4.H2O 12 microM 6 mM 1.01g
ZnCl2 1 microM 0.5 mM 68mg
CuSO4.5H2O 1 microM 0.5 mM 125mg
Na2MoO4.2H2O 0.2 microM 0.1 mM 24mg FeNa2EDTA stock solution:0.744g Na2EDTA，0.556g FeSO4，100mL H2O
NH4NO3营养液：
Compound Final concn Stock mL of stock / liter medium
KPi (pH6.0) 10 mM 1 M 10
NH4NO3 2.5 mM 1 M 10
MgSO4 2 mM 1 M 2
CaCl2 1 mM 1 M 1
FeNa2EDTA 0.1 mM 20 mM 2.5
MN solution 1x 500x 2
Sucrose 0.5%(w/v) 50%(w/v) 10
DNA extraction buffer：
Compound Stock mL of stock / liter medium
Tris-HCl(pH8.0) 1M 100mL
EDTA(pH8.0) 0.5M 100mL
NaCl 5M 100mL
SDS 10% 125mL
H2O 575mL
电泳母液[20x]：
Compound mL of stock / liter medium
Tris base 242g
glacial acetic acid 57.1mL
EDTA (0.5M) 100mL
电泳工作液,琼脂糖凝胶（2%）,Taq Reaction Buffer（10×），dNTP（2.5 μmol/L）
2.1.3 仪器和设备
Eppendorf移液器，台式离心机，漩涡振荡器，电子天平，超纯水仪，PCR仪，微波炉，真空抽气泵，酸度计，电泳仪，超净工作台，恒温摇床，凝胶成像仪，荧光电子显微镜，高压蒸汽灭菌锅。
2.1.4 PCR引物
PCR引物由生工生物工程（上海）公司合成。
编号名称序列（5’- 3’）Col片段Ler片段Chr.Ⅰ
1 NGA63-1 ACCCAAGTGA TCGCCACC 111 89
NGA63-2 AACCAAGGCACAGAAGCG
2 F26F24F1 ACAAAGCATTTTGACTTCCT 187 160
F26F24R1 CCGAGGAATGAATTTA TTTA TGGTA
3 F1054F1 CA TGCTA TAGATAGAAACAACGTTCA 166 93
F1054R1 CACAACA TA TAACTCATGAAGAAGACG
4 NGA280-1 GGCTCCATAAAAAGTGCACC 10
5 90
NGA280-2 CTGATCTCACGGACAA TAGTGA
5 NGA111-1 TGTTTTTTAGGACAAATGGCG 128 162
NGA111-2 CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG
Chr.Ⅱ
6 F15L11F1 AGAGGCTGATCGGTCTGAAA 158 115
F15L11R1 ACGGTACTGGGAGATTGTGG
7 CLW3-1 GAAACTCAATGAAA TCCACTT 230 200
CLW3-2 TGAACTTGTTGTGAGCTTTGA
8 T9J22F1 TGGAAGCTTCTCTGGACACA 110 94
T9J22R1 AAAAA TAAATCTTCGTTTGTTAGTTGA
9 NGA168-1 GAGGACA TGTATAGGAGCCTCG 151 135
NGA168-2 TCGTCTACTGCACTGCCG
Chr.Ⅲ
10 NGA172-1 CATCCGAATGCCATTGTTC 162 136
NGA172-2 AGCTGCTTCCTTA TAGCGTCC
11 NGA162-1 CTCTGTCACTCTTTTCCTCTGG 107 89
NGA162-2 CATGCAATTTGCA TCTGAGG
12 MQP15F1 TTGGATCTTCACGTGTTTGG 131 116
MQP15R1 ATGGCGGTTGACTTGGATAG
13 NGA6-1 A TGGAGAAGCTTACACTGATC 143 123
NGA6-2 TGGA TTTCTTCCTCTCTTCAC
Chr.Ⅳ
14 ClW5-1 GGTTAAAAATTAGGGTTACGA 164 144
ClW5-2 AGATTTACGTGGAAGCAAT
15 ClW6-1 CTCGTAGTGCACTTTCAATCA 162 148
ClW6-2 CACATGGTAGGGAAACAATA
16 M4122F1 CACTTTCA TCGGCAAGTGAC 195 174
M4122R1 CCCATCTCCAAAAA TCGAAA
17 NGA1107-1 CGACGAA TCGACAGAATTAGG 150 140
NGA1107-1 GCGAAAAAACAAAAAAATCCA
Chr.Ⅴ
18 MXM12F1 GCCCA TTTGAAACCAACACT 117 102
MXM12R1 ACTTTGGGCCTCAGGTGTTA
19 NGA151-1 CAGTCTAAAAGCGAGAGTATGATG 150 120
NGA151-2 GTTTTGGGAAGTTTTGCTGG
20 NGA139-1 GGTTTCGTTTCACTATCCAGG 174 132
NGA139-2 AGAGCTACCAGA TCCGATGG
21 ClW9-1 CAGACGTATCAAA TGACAAATG 165 145
ClW9-2 GACTACTGCTCAAACTATTCGG
22 MBG8F2 AACAAAA TCAAGTGCAAA TCCA 151 133
MBG8R2 AGCAACCAAAGAAGCCAAAA
2.2 实验方法
2.2.1 植物材料预处理
对植物种子材料（SS204-9、GD75、F2代）进行消毒处理，具体方法如下：（1）取适量种子于1.5 mL Eppendorf管中。
（2）用移液器取1 mL 70%乙醇溶液于管中，上下颠倒轻轻混匀，充分接触乙醇溶液，静置处理5 min（注意勿使种子残留于管壁或管盖上以防影响处理效果），之后用移液器将乙醇轻轻吸出（勿吸出种子）。
（3）用吐温水冲洗一遍。
（4）用移液器取1 mL 2.6%次氯酸钠溶液于管中，上下颠倒混匀，静置处理10min。
（5）用吐温水冲洗五遍。
（6）置于4 C保存待用。
2.2.2 荧光筛选
2.2.2.1 配制培养基
按配方配制KNO3培养基，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理（121?C，20 min），倒入培养皿中，具体方法如下：
（1）将方形培养皿于超净工作台中铺好，开紫外灯灭菌15 min。
（2）于灭菌锅中取出培养基，冲洗降温至60?C左右。
（3）关闭紫外灯，迅速将约40 mL培养基倒入培养皿中。
（4）将培养基开盖静置约15 min，待其凝固。
（5）用保鲜膜包裹，注明培养基种类、制备日期。
（6）置于4?C保存待用。
2.2.2.2 种子的准备
具体过程如下：
（1）在超净工作台中，取已消毒处理的种子（SS204-9、GD75、F2代），用灭菌牙签沾取种子，轻轻点播于培养基中（防止将培养基划破），每板播3行，每行约点播30粒左右。
（2）在盖上进行标记，标明种子种类、点播日期。
（3）用封口膜进行密封。
2.2.2.3 种子的处理
将铺好的种子置于4?C避光保存2 d。
2.2.2.4 种子的培养
将种子移到组培室中长日照竖直培养5 d。
2.2.2.5 筛选突变体类型植株
当用硝酸处理对照SS204-9时，会激发YFP产生强烈荧光，而对突变体GD75进行同样处理时显微弱荧光，因此可根据荧光的强弱挑选出F2代中显微弱荧光的突变体类型植株。
具体方法如下：
（1）利用荧光显微镜观察SS204-9及GD75幼苗根部，确定荧光明暗标准。
（2）利用荧光显微镜观察F2代幼苗根部，挑取显微弱荧光的植株，剔除强烈荧光及不发光的个体，记录。
（3）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70?C 保存待用。
2.2.3 根长筛选
2.2.
3.1 营养液的配制
按配方配制NH4NO3营养液，用高压蒸汽灭菌锅处理（121?C，20 min），4?C 保存待用。
2.2.
3.2 种子的准备
用6孔培养板进行水培，具体方法如下：
（1）在超净工作台中，取6孔板，标记，SS204-9、GD75各一孔，F2代四孔。
（2）于每孔中加入1.5 mL NH4NO3营养液。
（3）用灭菌牙签沾取种子，播入营养液中，其中SS204-9 30粒，GD75 30粒，F2代每孔30粒（见图2-1）。
（4）用封口膜进行密封。
2.2.
3.3 种子的处理
将铺好的种子置于4?C避光保存2 d。
2.2.
3.4 种子的培养
将种子移到组培室中，在长日照条件下摇床培养（90转/min）5 d。
2.2.
3.5 筛选突变体类型植株
突变体的NO3-调控基因发生突变，影响其对硝态氮的吸收利用，进而影响其根系的生长发育，因此其植株与野生型相比在相同培养环境中根系生长缓慢且短小，故可根据这一表型对突变体进行筛选。
具体方法如下：
（1）取出摇床培养4 d的6孔培养板于超净工作台中，取一玻璃圆皿，用镊子夹取SS204-9、GD75各若干株。
（2）以所取SS204-9、GD75为标准从F2代幼苗中选取突变体，用直尺测量根长，明显短于SS204-9、约与GD75相等的个体，无法确定的植株亦剔除，记录。
（3）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70?C 保存待用。
图2-1 水培示意图
Fig.2-1 Schematic diagram of the hydroponics.
2.2.4 双重筛选
结合荧光筛选与根长筛选两种方法，进行两次筛选，确保筛选出的突变体的准确性。
具体过程如下：
（1）取出摇床培养4 d的6孔培养板于超净工作台中，取一玻璃圆皿，用镊子夹取SS204-9、GD75各若干株。
（2）以所取SS204-9、GD75为标准从F2代幼苗中选取突变体，用直尺测量根长，明显短于SS204-9、约与GD75相等的个体，无法确定的植株亦剔除，记录。
（3）利用荧光显微镜观察SS204-9及GD75幼苗，确定荧光明暗标准。
（4）利用荧光显微镜观察挑出的幼苗，挑取显微弱荧光的植株，剔除强烈荧光及不发光的个体，记录。
（5）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70 C 保存待用。
2.2.5 突变体的图位克隆
2.2.5.1 提取突变体基因组
以筛选出的突变体幼苗为材料，提取其基因组DNA，具体方法如下：
（1）取材于1.5 mL Eppendorf管中，标号，加液氮充分研磨。
（2）加入500μL DNA extraction buffer/异丙醇（1:1）溶液，用振荡器迅速混匀。
（3）室温静置5 min。
（4）13000 rpm离心10 min。
（5）用真空泵吸去废液，加入75%乙醇溶液。
（6）13000rpm离心5 min。
（7）用真空泵吸去废液，室温开盖静置至样品干燥。
（8）加入适量ddH2O（按所得基因组DNA多少而定）。
（9）用振荡器混匀，13000 rpm离心1 min。
（10）4?C保存待用。
2.2.5.2 PCR扩增突变体基因组
利用所设计的引物，以所提取的突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增。按下表所示的配方混合扩增反应体系，然后进行反应。反应程序为94?C预变性5分钟；循环参数为94?C 变性30秒，58?C 退火30秒，72?C 延伸45秒，运行50个循环；在72?C后延伸3分钟，反应结束。取12 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
模板 2.0 μL
引物1 1.0 μL
引物2 1.0μL
Buffer（10×） 2.0 μL
dNTP（2.5 μmol/L）0.4 μL
rTaq酶（2.5 U）0.2 μL
ddH2O 13.4μL
Total 20.0 μL
首先将所提取的突变体基因组DNA每个样品取2μL混为突变体基因大样（F2Mix），同时混制等量Col/Ler（1:1）作为野生型对照，以这两种模板配以22对引物进行PCR扩增，之后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像初步筛选哪种引物具连锁可能（如图2-2）。
引物1引物2 引物3Marker
图2-2 筛选引物加样示意图
Fig.2-2 Schematic diagram of loading for primers’ screening.
然后以各突变体基因组DNA样品及野生型Col/Ler（1:1）用所筛选引物再次进行扩增、电泳、成像，通过观察引物在各样品中连锁频率来验证该引物与突变体基因是否真正连锁，若连锁，即完成初步定位（Rough mapping）（如图2-3）。
样品1
样品2 样品3 样品4 样品5 野生型Marker
Fig.2-3 Schematic diagram of loading for primers’ determining.
3 结果与分析
3.1 荧光筛选结果
3.1.1突变体类型植株筛选结果
在KNO3培养基中培养5 d的野生型与突变体在荧光电镜下表现出明显的荧光强弱区别（如图3-1）。通过荧光电镜对F2代进行筛选，选择出荧光微弱的个体，即突变体。筛选结果如下：
培养皿编号亮微亮不亮总数突变体比例理论比例
1 49 6 19 74 3/37 (≈8%)3/16(≈19%)
2 24 7 17 48 7/48 (≈15%)
3 28 9 13 50 9/50 (≈18%)
4 44 18 14 76 1/7 (≈14%)
5 35 14 19 68 7/34 (≈21%)
图3-1 荧光筛选标准
A:Mu(GD75):荧光微弱；B:WT(SS204-9):荧光强烈
Fig.3-1 Standard of the fluorescent screening.
A:Mu(GD75):the weak fluorescence；B:WT(SS204-9): the strong fluorescence. 3.1.2连锁引物筛选结果
将筛选出的20个突变体样品提取基因组，混为FM（F2Mix），与野生型CL（Col：Ler=1:1）一起，利用设计的22对引物进行PCR扩增、电泳成像，观察连锁情况。当FM与CL相比只存在Col带或Col带亮度明显强于Ler带时，说明该引物与突变位点具连锁可能。
1-11号引物（如图3-2）：由电泳结果可见5号引物FM样中两条带明暗对比鲜明，又由引物表（见2.1.4）查得5号引物所扩增的Col带为128bp，Ler带为162bp，所以Col带强于Ler带，故5号引物具有连锁可能。
图3-2 1-11号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-2 The 1st to 11th primer electrophoretogram of PCR products.
12-22号引物（如图3-3）：由电泳结果可见12号引物FM样中两条带明暗对比鲜明，又由引物表（见2.1.4）查得12号引物所扩增的Col带为131bp，Ler带为116bp，所以Col带强于Ler带，故12号引物具有连锁可能。
图3-3 12-22号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-3 The 12th to 22th primer electrophoretogram of PCR products.
3.1.3 连锁引物验证结果
将筛选出的5号、12号引物分别与20个突变体基因组及2个野生型（Col、Ler）基因组进行PCR扩增、电泳成像，观察连锁情况。当F2样品中与Col、Ler相比只存在Col带或Col带占绝大多数时，说明该引物与突变位点确实具连锁可能。
5号引物（如图3-4）：由电泳结果可见5号引物所扩20个突变体中符合连锁条件的个数为12，该比例证明5号引物与突变基因无连锁，故排除5号引物可能性。
图3-4 5号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-4 The 5th primer electrophoretogram of PCR products.
12号引物（如图3-5）：由电泳结果可见12号引物所扩20个突变体中符合连锁条件的个数为11，该比例证明12号引物与突变基因无连锁，故排除12号引物可能性。
图3-5 12号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-5 The 12th primer electrophoretogram of PCR products.
3.2 根长筛选结果
3.2.1突变体类型植株筛选结果
在NH4NO3培养基中培养5天的野生型与突变体的根长呈现明显区别（如图3-6、图3-7）。通过测量根长对F2代的筛选，选择根系较短的个体，即突变体。
图3-6 根长筛选标准
A:Mu(GD75):根系短小；B:WT(SS204-9):根系发达
Fig.3-6 Standard of the root’s length screening.
A:Mu(GD75):the short root；B:WT(SS204-9): the long root.
图3-7 平均根长比较
Fig.3-7 comparison of average length of the roots.
筛选结果如下：
植株突变体个数总数突变体比例理论比例
F2 22 120 22/120≈0.18 1/4(=0.25)
3.2.2 连锁引物筛选结果
将筛选出的22个突变体样品提取基因组，混为FM（F2Mix），与野生型CL（Col：Ler=1:1）一起，利用设计的22对引物进行PCR扩增、电泳成像，观察连锁情况。当FM与CL相比只存在Col带或Col带亮度明显强于Ler带时，说明该引物与突变位点具连锁可能。
1-11号引物（如图3-7）：由电泳结果可见7号、9号、10号引物FM样中两条带明暗对比鲜明，又由引物表（见2.1.4）查得7号引物所扩增的Col带为230bp，Ler带为200bp；9号引物所扩增的Col带为151bp，Ler带为135bp；10号引物所扩增的Col带为162bp，Ler带为136bp。且Col带强于Ler带，故7号、9号、10号引物具有连锁可能。
图3-7 1-11号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-7 The 1st to 11th primer electrophoretogram of PCR products.
12-22号引物（如图3-8）：由电泳结果可见所有引物FM样中两条带明暗对比均不鲜明，且与野生型无较大差别，故12-22号引物均无连锁可能。
图3-8 12-22号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-8 The 12th to 22th primer electrophoretogram of PCR products.
3.2.3 连锁引物验证结果
将筛选出的7号、9号、10号引物分别与20个突变体基因组及2个野生型（Col、Ler）基因组进行PCR扩增、电泳成像，观察连锁情况。当F2样品中与Col、Ler 相比只存在Col带或Col带占绝大多数时，说明该引物与突变位点确实具连锁可能。
7号引物（如图3-9）：由电泳结果可见7号引物所扩22个突变体中符合连锁条件的个数为6，该比例证明7号引物与突变基因无连锁，故排除7号引物可能性。
图3-9 7号引物的PCR产物电泳图谱
Fig.3-9 The 7th primer electrophoretogram of PCR products.
9号引物（如图3-10）：由电泳结果可见9号引物所扩22个突变体中符合连锁条件的个数为12，该比例证明9号引物与突变基因无连锁，故排除9号引物可能性。
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径 拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125 Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。 基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。不论 要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
拟南芥的图位克隆技术
拟南芥基因的图位克隆技术 浙江大学生命科学学院徐冰 浙江杭州310029 1 国内外研究现状 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。 从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。 图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002） 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/8810431839.html,
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
图位克隆基因研究进展
图位克隆基因研究进展 宋成标 摘要图位克隆是在不清楚基因产物结构和功能的情况下，根据基因在染色体上都有稳定的基因座实现的。随着各种分子标记技术和高质量基因组文库构建技术的发展，图位克隆现已经成为分离生物体基因的一种常规技术。本文主要概述了图位克隆的一般步骤，包括目的基因的初步定位、精细定位和遗传做图、染色体步行和登陆及利用功能互补实验鉴定目的基因。最后，对图位克隆技术存在的局限和发展前景作了初步的分析。 关键词图位克隆, 分子标记, 精细定位, 基因组文库 Abstract Map-based cloning is based on the functional genes have their particular gene locus on chromosomes,when we know about the structure and function of gene products unclearly.With the rapid development of molecular marker technologies and constructing high quality genomic library technologies, map-based cloning had already become a common bio—technique for gene isolation. This article summarized mainly the processes of the map-based cloning in principle,including first-pass mapping of candidate gene、fine scale-mapping and building genetic map、chromosome walking or landing and finally complement experiment for identifing candidate gene. Finally the problems and the prospects in the map-based cloning are analyzed Keywords Map-based cloning, Molecular marker, Fine maping, Genomic library 从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表型突变去进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径是根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳定的位置来实现的。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Coulson 等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着模式物种（拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和各种数据库的完善。图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。本文将对图位克隆技术的相关策略作一介绍。 1图位克隆的策略 自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到ABI3(Girauda et al., 1992)基因和F AD3 (Arondel et al., 1992)基因以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因（图1）。 初步定位（First-pass maping）-------构建遗传图谱（constructing genetic map）-----精细定位（fine maping）---------构建物理图谱( constructing physical map)------染色体步移、登陆（chromosomal walking、landing）-------确定侯选基因（Consider candidate genes）----遗传互补验证目的基因（Through genetic complementation (transformation) to identify candidate gene）（请帮我画一个简易图表，把内容填进去） 图1 图位克隆的主要步骤 Figure 1 Key steps in map-based cloning process
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
水稻基因的图位克隆技术
水稻基因的图位克隆技术 吴自明 (江西农业大学,作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室,农业部双季稻生理生态与栽培重点实验室,江西省作物生理生态与遗 传育种重点实验室,江西南昌330045) 摘要 综述了水稻图位克隆技术的原理、技术环节及其在水稻基因克隆上的应用,分析了当前存在的主要问题,并对其应用前景作出了展望。 关键词 水稻;图位克隆;基因 中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)34-14905-02 Map based C lo ning T echnique of R ice Genes WU Zi m ing (Key Laboratory of C rop Ph ysiology,Ecol ogy and Genetic B reeding,Mi nistry of Ed ucation,Key Laboratory of Ph ysiology,Ecology and C ultivati on of Double C roppin g Rice,Mini stry of Agriculture,Key Lab oratory of Crop Physi ology,Ecology an d Genetic Breedin g of Jian gxi Province,Jiangxi Agricultural Uni versi ty,Nanchang,Jiangxi 330045)Abstract The p rinciple an d tech nical links of m ap based gene cloni ng techniq ue i n rice an d its applications in the gene cloni ng of rice were s um ma rized .And the mai n existing problems at present were analyzed .And its applicati on foregrou nd was p redicted.Key w ords Rice;Map based cloni ng;Gene 基金项目 江西省教育厅项目(GJJ09477);江西农业大学博士启动基 金;江西农业大学校自然科学基金。 作者简介 吴自明(1974-),男,江西鄱阳人,副教授,从事植物分子 生物学研究。 收稿日期 2008 10 06 近年来,水稻基因组研究进展非常迅速,高密度遗传图谱和物理图谱的构建,全基因组序列的公布,数以万计ES T 、全长c DN A 等序列及功能分析数据的释放以及新型水稻分子标记及其高效检测技术的发展等,为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。同时,这些新的进展也能够使基因的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化,使基因的图位克隆朝着更加简便、快速的方向发展。1 图位克隆技术原理 图位克隆(Ma p based Cloning)又称定位克隆(Positional Cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Co ulson 提出[1]。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行,无需预先知道基因的D N A 序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息,而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 近几年来,水稻各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的日趋完善,在很大程度上得益于以粳稻日本晴和籼稻9311为代表的基因组测序的完成[2-3]。目前已有几十种技术可用于分子标记筛选,其中最常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性(Inser tio n/Deletio n,InDel)[4-7]。Shen 等利用日本晴和9311基因组序列构建了水稻基因组水平的D NA 多态性数据库,其中包括1703176个单核苷酸多态性(Single Nucleo tide Polymor phis m,SNP)和479406个插入缺失多态性(InDel)[8]。Fe ltus 等通过对除去多重拷贝序列及低质量序列后的日本晴和9311基因组草图的比对分析,得到408898个D N A 多态性,包括SNP 和单碱基I nD el [9],这些差别的核苷酸通常位于非编码区[10]。 目前,常把SNP 多态性转化成基于P CR 的剪切扩增多态性(Cle ave d Amplified P olymorphic Se que nc es,CAPS)或CAPS 衍生的dCAPS 标记[11-12]。CAPS 标记是PCR 反应和酶切相结 合产生的一种分子标记。如果不同材料间在PCR 扩增区域有S NP 位点,且该位点是限制性内切酶作用位点,那么不同 材料的PCR 扩增产物经特定的酶切后,再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。当SNP 恰好位于限制性酶切位点比较少时,这种情况可以在CAPS 标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,则可以结合SNP 位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS 标记类似的多态性,这就是dCAPS 的方法。用CAPS 或dCAPS 的方法则可以将几乎所有的SNP 位点转化成以P CR 为基础的分子标记[12] 。 2 图位克隆技术环节 2.1 构建遗传作图群体 对于基因图位克隆而言,构建特殊的遗传作图群体是筛选与目标基因紧密连锁分子标记的关键环节。常用的作图群体有F 2、近等基因系、重组自交系等群体,水稻常用F 2群体。创建F 2群体应注意优先选择基因组已测序的日本晴、9311和培矮64S 等品种为亲本之一。2.2 基因初定位 一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F 2群体,需借助于进一步子代测验,以分辨F 2中的杂合体。为此,Mic helmo re 等发明分离群体分组分析法(Bulke d Se gre ga nt Ana lysis,BS A)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记[13]。其原理是将目标基因的F 2(或BC)代分离群体各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲表型分为2群,每一群中各个体D N A 等量混合,形成2个D N A 混合池(如抗病和感病、不育和可育),并且用目的基因附近的所有分子标记对混合D NA 样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DN A 池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大提高分子标记分析效率,减小D NA 提取工作量。 2.3 基因精细定位 一旦把目标基因初步定位在2个标记之间后,就可以从国际水稻基因组测序计划(IRG SP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分P AC/BAC 克隆序列。利用软件SSRI T 搜索克隆序列中的微卫星序列,然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR 引物的设计。也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较,如寻找R GP 基因组数据库(粳稻)与中国华大基因组数据库(籼稻)的单核苷酸多态性(SNP)序列差异,设计CAPS 或dCAPS 标记和插入/缺失多态 安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri.Sci.2008,36(34):14905-14906 责任编辑 张彩丽 责任校对 张士敏
植物基因克隆技术的发展与展望
植物基因克隆技术的发展与展望 摘要:基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览植物基因克隆的理论和技术的发展创新历程．对各种技术体系、正向遗传学途径、反向遗传学途径(包含定位克隆和同源序列克隆及随后发展起来的电子克隆)进行了综述。随着后基因组时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。 关键词：基因克隆、定位克隆、转座子标簦法、基因芯片电子克隆 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术巾最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物T程手段应用到生产实践巾去。一般来讲，基因克隆的策略町分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。现对在植物基因克隆过程巾运用的主要技术进行综述．以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。 1、定位克隆 定位克隆技术(positional cloning)又叫图位克隆(map—based cloning)．是枞据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因、其基本原理是根据功能基因在基因组巾存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组义库(如BAC和YAC)．用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chro—lnosolne landing)的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆．或以大片段克隆作探针筛选cDNA义库：从而将目标基因确定在一个较小的DNA片段上并进行序列分析．通过遗传转化和功能互补试验分析，签定获得目的基因【1】。 植物巾运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物巾分离了几十个重要的基因，并以抗病基因的克隆居多．如番茄的埘基因121．Hero基因；马铃薯的Cpa2基因?，拟南芥的RPW8基因?、PBSI基因?、Rppl3基因?和水稻的Pita、Xal、Pi —b等基因。随着比较基因组研究的兴起．利用同科异种植物问染色体的共线性进行比较作图．如以拟南芥、番茄和水稻为巾介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，将成为一个新的发展方向 2、转座子标签法 转座子(Transposon)是口J从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米巾发现的．随后的研究表明，在生物界巾转座子是普遍存在的．并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是．利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点．以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子捕入而功能失活的基因，如果某基因的突变是巾于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就nr从变异株的基因组巾筛选出带有此转座子的部分基因．再以突变基因的部分序列作探针，即口J从野生型义库巾克隆m完整的基因，在植物中利用转座子的有玉米的Ac／Ds．En／Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是AciDs双因子系统【2】。 利用转座子标记技术目前已克隆y-0的植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml、Hm2“．番船抗叶霉病基因a之、a4d、cf巧、Cf-9、C}9B及cf一磁P型“。1?．烟草抗花叶病毒病基因
常用的植物目的基因克隆技术
常用的植物目的基因克隆技术 常用的植物目的基因克隆技术 1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（Cp TI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』 虮嗦氲氖芴逯 浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担 圆≡ し⒆拥鞍孜 咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』 颍 绶 延胛薅净 騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最差不多单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研 究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了（图1）。