院感细菌培养操作

1.目的: 医院是病原微生物较集中,抵抗力低的人群密集的地方,加之化疗、放疗等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因，增加消毒灭菌的难度，致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍，直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。

2.设备、试剂与材料

2.1 VITEK 2 compact鉴定药敏分析系统

2.2 VITEK 32鉴定药敏分析系统

2.3美国FORMAⅡ级生物安全柜

2.4显微镜

2.5酒精灯

2.6接种环

2.7恒温培养箱

2.8各种培养基

2.9 革兰氏染色液

2.10触酶试剂

2.11氧化酶试剂

2.12移液器

2.13无菌吸嘴

3.院感标本采集

3．1空气的采样

3．1．1采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。

3．1．2采样高度与地面垂直高度80-150CM。

3．1．3布点方法室内面积＜30m2，设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m 处各取一点；室内面积＞30m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。

3．1．4采样方法用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后送检。

3．2物体表面采样

3．2．1采样时间选择消毒处理后4小时内进行采样。

3．2．2采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面＞100cm2，则取100cm2。3．2．3采样方法用5×5 cm2的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。3．3医护人员手采样

3．3．1采样时间在接触病人、从事医疗活动前进行采样。

3．3．2采样面积及方法被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双手指曲面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30 cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（cm2）计算。

3．4医疗用品采样

3．4．1采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。

3．4．2采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2，取100cm2。

3．5使用中消毒剂的采集

3．5．1采样时间采取使用中的消毒剂。

3．5．2采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml被检样品，加入10ml稀释液混匀。（对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80和0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80，以中和被检样液的残效作用。）

3．6内镜的采样

3．6．1咽喉镜、支纤镜用10ml戊二醛中和液冲洗内镜后，送检实验室。

3．6．2胃镜、消化镜、宫腔镜用10ml0.1%硫代硫酸钠中和液冲洗内镜后，送检实验室。3．6．3鼻咽镜、过氧化氢消毒的腔镜类用10ml生理盐水中和液冲洗内镜后，送检实验室。

3．7透析液的采样用灭菌的空试管取透析液10ml送检。

4.院感标本的运送及交接签收

4．1标本的采集

4．1．1空气标本的采集由临床科室负责完成，标本采集完毕，由临床各科在规定的时间内将标本安全送回实验室。

4．1．2物体表面、医务人员手、消毒剂、内镜等由院感科负责组织采样，在规定时间内将标本安全送达实验室。

4．2采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6小时，若样品保存于0-4℃条件时，送检时间不得超过24小时。

4．3标本收回实验室后,将标本的信息登记在“院感监测登记本”上。

4．4微生物室工作人员的验收根据微生物室院感标本拒收标准进行检查，对不符合要求

的，将拒收，立即退回给送检人员，指出问题，告知标本重取，所有拒收标本均需在《标本拒收记录本》上登记。拒收情况如下：

4．4．1空气培养平板数目击者不正确（房间小于30平方米做3个平板培养，房间大于30平方米做5个平板培养）。

4．4．2未注明标本采集科别、来源和培养目的。

4．4．3标本明显受污染。

5.检测步骤见本文件末面流程图

5．1空气标本的检测

5．1．1细菌室收到标本后，将标本编写当日日期，用平板压住验单，直接放入35℃培养箱培养48小时后，观察结果。

5．1．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。

5．1．3结果计算及菌落换算空气细菌菌落总数（cfu/m3）=50000N/AT，式中A——平板面积，cm2；T——平板暴露时间，min；N——平均菌落数，cfu/平皿。即平皿上1个菌落等于空气中菌落数为157 cfu/m3 ，如果标本为3个点时换算=平皿上的菌落数×157÷点数。5．2物体表面样本检测

5．2．1细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80次后，吸500ul于普通琼脂平板中，把平板摇均匀，放入35℃培养箱培养48小时后，观察结果。

5．2．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU 的标本时，还要排除沙门氏菌的检出。

5．2．3结果计算及菌落换算物体表面细菌菌落总数（cfu/c m2）=平皿上菌落数×采样液稀释倍数（A）/采样面积（cm2）。采样液稀释倍数即是采集液总量与接种的采集液量之比值，即平皿上1个菌落等到于物体表面上菌落数为0.2cfu/cm2。。。

5．3医护人员手样本检测

5．3．1将标本编号，振摇80次后，吸500ul于普通琼脂平板中，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU 的标本时，加做一个HE平板，以监测沙门氏菌的检出。把平板摇均匀，放入35℃培养箱培养48小时后，观察结果。

5．3．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。

5．3．3结果计算及菌落换算手细菌菌落总数（cfu/c m2）=平皿上菌落数×采样液稀释倍数（A）/30×2（cm2），即平皿上1个菌落等到于物体表面上菌落数为0.33cfu/cm2。

5．4灭菌或一次性医疗用品样本检测

5．4．1样本采集完成后，接种于肉汤培养基，置35℃培养箱培养7天，每天观察一次，培养基有混浊则转种普通平板继续培养，观察最后结果。

5．4．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌。

5．5使用中消毒剂

5．5．1细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80次后，吸500ul于普通琼脂平板中，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU 的标本时，加做一个HE平板，以监测沙门氏菌的检出。把平板摇均匀，放入35℃培养箱培养48小时后，观察结果。另接种于1个沙保劳培养基，置28℃培养箱培养7天，每天观察一次，观察最后结果。

5．5．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌及真菌。

5．5．3结果计算及菌落换算使用中消毒剂细菌菌落总数（cfu/ ml ）=平皿上菌落平均数×采样液稀释倍数（A）/采样体积（1ml），即平皿上1个菌落等于消毒剂中菌落数为10 cfu/ ml。

5．6灭菌效果监测

5．6．1压力蒸汽灭菌效果监测采用嗜热脂肪芽胞杆菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后，把里面的玻璃压碎，置于56℃培养箱培养48小时，如指示剂颜色为紫色，说明无嗜热脂肪芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有嗜热脂肪芽胞杆菌生长。5．6．2气体灭菌效果监测采用枯草芽胞杆菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后，置于35℃培养箱培养48小时，如指示剂颜色为紫色，说明无枯草芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有芽枯草胞杆菌生长。

5．7内镜标本检测

5．7．1将标本编号，用旋涡器充分震荡（振摇80次），取0.5ml，加入直径9CM的普通琼脂平板上，把平板摇均匀，放入35℃培养箱培养48小时后计数，观察结果。

5．7．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。

5．7．3结果计算及菌落换算细菌菌落数/镜=平皿菌落数×20

5．8透析液样本检测

5．8．1将标本编号，振摇80次后，吸200ul于普通琼脂平板中，反平板摇均匀，放入35℃培养箱培养48小时，观察结果。

5．8．2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌，、β溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。

5．8．3结果计算：透析液细菌菌落总数=平皿菌落数×5

6.质量控制

6．1做好培养基及样本采集液的质量控制，确保其无菌以及适宜于细菌的生长。

6．2标本采集严格按照采集要求进行。

6．3做好培养箱的温度控制。

7.各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌菌落总数卫生标准，见下表

7．2致病性微生物不得检出金黄色葡萄球菌，、β溶血链球菌及其他致病性微生物。在可疑污染情况下进行相应指标的检测，母婴同室、早产儿室、婴儿室、新生儿及儿科病房的物体表面和医护人员手上，不得检出沙门氏菌。

7．3医疗用品卫生标准

7．3．1进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤、粘膜的医疗用品必须无菌。

7．3．2接触粘膜的医疗用品细菌菌落总数应≤20cfu/g或100 cm2，致病性微生物不得检出。

7．3．3接触皮肤的医疗用品细菌菌落总数应≤200cfu/g或100 cm2，致病性微生物不得检出。

7．4使用中消毒剂卫生标准使用中消毒剂：细菌菌落总数应≤100 cfu/ml；致病性微生物不得检出。

7．5内镜消毒后的卫生标准细菌菌落总数应＜20cfu/件；致病性微生物不得检出。

7．6透析液消毒后的卫生标准

7．6．1入水口细菌菌落总数应＜200cfu/ml；致病性微生物不得检出。

7．6．2出水口细菌菌落总数＜2000cfu/ml；致病性微生物不得检出。

8.院感标本报告的录入

8．1在电脑点击“院感系统”，进入“院内检测”，在“环境卫生学及消毒灭菌效果监测结果”中根据检测的结果输入相关的项目。输入抽检科别、标本类别、抽检项目、报告结果/细菌总数、标本单位、检出细菌、送检日期、报告日期、检验者、院感受办抽查、次数。结果输完后按保存键，审核无误后按审核键。按录入键继续下一标本的录入。录入完毕退出系统。

8．2阴性院内感染监测标本的报告方式

8．2．1空气、物体表面、消毒液、灭菌生物监测菌片培养结果阴性发报告为“无菌生长”。8．2．2无菌物品培养结果阴性发报告为“无细菌生长”。

8．3阳性院内感染监测标本的报告方式

8．3．1空气培养结果阳性发报告为“XX cfu/m3”。

8．3．2物体表面培养结果阳性发报告为“XX cfu/cm2”。

8．3．3消毒液培养结果阳性发报告为“XX cfu/ml”。

8．3．4生物监测菌片培养结果阳性发报告为“检出枯草芽胞杆菌/嗜热脂肪芽胞杆菌”。8．3．5无菌物品阳性发报告为“检出细菌”。

9.参考文献

[1]中华人民共和国卫生部，制定，医院感染管理文件汇编，附录A：采样及检查方法。

[2]任南，主编，实用医院感染监测方法与技术，湖南，湖南科学技术出版社，2008.3.

院感标本处理流程图

备注：编号规则按手、物表、台面由1号起编，消毒液由101起编，大肠杆菌快速测试由201起编，生物菌片由301起编，无菌物品由401起编，空气培养由501起编。各类标本各自为序。