胎盘间充质干细胞的分离和培养

胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定

刘亭

2016、7。21

目录

前言 (2)

1分离制备PMSC组织得选取 (3)

2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5)

2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5)

2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6)

3 原代培养与继代培养 (10)

3-1培养基 (10)

3-2培养密度 (11)

3—3培养条件 (11)

3—4换液 (11)

3-5 传代培养 (12)

3-6细胞形态与生长速度 (12)

3-7 MSC得冻存与复苏: (12)

4细胞表面抗原检测 (13)

5生长曲线 (13)

6细胞周期 (13)

7分化潜能 (13)

参考文献 (13)

附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15)

脐带血 (15)

脐带 (15)

羊膜 (17)

绒毛膜 (18)

蜕膜层 (18)

胎盘 (19)

整体灌注法 (20)

附件2 背景知识 (20)

附件3 PMSC实验所需试剂 (21)

前言

干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁、在适当得条件下可以大量扩增,并转化为间充质祖细胞,进而分化成包括三个胚层得各种组织细胞,如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。

MSC具有低得免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节与造血支持等功能,而且易于外源基因导入表达,就是基因治疗中重要得载体细胞。此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用,可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中得免疫反应,并同时抑制T细胞得异基因增殖反应、所以,MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛得应用前景。近年来MSC已逐步成为干细胞研究得热点(张慧娟等,2014)、

目前所报道得间充质干细胞主要来源于骨髓,采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便,但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦得手术,并在取材过程中及取材后会有很高得感染机会;由于人体骨髓中间充质干细胞得含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个;而且随着年龄得增加,骨髓中间充质干细胞得数量、增殖与分化能力均显著下降,使其在研究与应用尤其就是临床应用中受到限制。其她组织中,如动员得外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞,然而,从这些组织中获得得细胞数量较为有限。以上因素,都限制了间充质干细胞

在组织工程与临床中得运用。

目前胎盘或脐带属于临床废弃物,容易获得,并且无污染,取材研究与应用基本无伦理学争议,研究表明胎盘或脐带含有丰富得MSC。有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养,细胞活性更好,还可诱导分化成脂肪,成骨等多种细胞。并且这些胎盘源得间充质干细胞(placenta—derived mesenchymal stem cells,PMSCs)具有极低得免疫原性,大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然得免疫耐受,因此,人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病得动物模型中,即便就是人—动物模型间得异种间移植,由于存在天然得免疫耐受,对实验研究得结果影响甚小,这对于很多疾病研究得模型建立具有很好得作用。

目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应。动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤(刘芳,2013),大鼠肝组织损伤(宫黎明等,2011),APP+转基因鼠阿尔茨海默病(郭亚男等,2009)均有疗效,也可以用于构建组织工程皮肤(徐彪等,2013)。所以,综合充分利用胎盘与脐带作为间充质干细胞新来源,优化分离纯化以及传代培养条件,加快细胞繁殖速度,降低培养成本以高效率获取大量得PMSC对于得各种疾病实验研究及医院各个科室得临床应用,都具有重要意义。

1分离制备PMSC组织得选取

胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层,人足月娩出得胎盘由羊膜层、绒毛膜层与蜕膜层组成。从脐带血(于海微等,2009;管英华等,2011),脐带(徐燕等,2009;韩之波等,2012;管英华等,2011;李艳琪等,2014;赵琳等,2016),整个胎盘(陆琰等,2009;沙文琼等,2010;刘洋等,2015;赖平等,2016),胎盘得羊膜层(宫黎明等,2011;徐彪等,2013;张慧娟等,2014;丛姗等,2015),绒毛膜层(洪艳等,2014;韩之波等,2012)与蜕膜层(韩之波等,2013)分离培养MSC均有报道。目前大多数研究者取胎盘小叶(包括绒毛层与绒毛滋养层)进行分离(洪艳等,2014)、胎盘得细胞成分较复杂,既有滋养细胞,也有间质细胞、血管内皮细胞与Hofbauer细胞(沙文琼等,2010)。由胎盘组织分离制备MSC时不可避免会有其它细胞得干扰(苗宗宁等,2009),其中以数量最多得血细胞干扰为主。分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位得组织可能含有最多得MSC,并且尽可能降低其它种类细胞得干扰,以获得纯度高,活力强得

MSC。

对于人脐带血来源得MSC(human umbilical cord blood MSC, hUCB—MSC)得存在及能否稳定传代扩增,曾有一定争议,后来得实验结果证实

脐带血中存在MSC,并表明脐带血来源MSC与骨髓来源MSC具有相同得生物学特性及功能特征(于海微等,2009)。但就是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞,分离间充质干细胞得过程以丢失造血干细胞为代价,而且个体差异大(徐燕

等,2009)。

脐带包括一条静脉与两条动脉,周围就是Wharton's Jelly,外层由羊膜来源得

上皮包裹,从发育角度来说,脐带就是干细胞形成及所经通路(管英华等,2011)、不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC(human umbilical cord MSC, hUC—MSC)。已有研究表明人脐带得结缔组织就是间充质干细胞丰富得组织来源(徐燕等,2009),故制备hUC-MSC一般剥离脐带动静脉与外层上皮、管英华等(2011)比较了脐血与脐带两种来源得MSC原代培养过程,结果表明脐血中细胞成分复杂,原代培养多见成纤维样与大圆形破骨样两种形态得贴壁细胞,随着换液与传代破骨样细胞逐渐减少与消失,剩下形态较为单一得呈漩涡样得细胞集落; 脐带来源培养得贴壁细胞不会随换液丢失,且细胞形态以成纤维样细胞为主,种类单一。hUC—MSCs比hUCB—MSCs原代培养得时间短,培养成功率明显增高。

羊膜就是胎膜最内层,胎盘包裹胎儿面得一层薄而半透明得膜,由胚胎羊膜囊壁发育而成,在胎盘面与绒毛膜相贴,由人羊膜间充质细胞与人羊膜上皮细胞组成,其表面没有神经、血管、肌肉与淋巴等组织。人羊膜间充质细胞来源于原条期得胚胎中胚层,而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层、越来越多得研究已证实,人羊膜间充质细胞与人羊膜上皮细胞都具有干细胞得特征。其中人胎盘羊膜来源得间充质干细胞(human amnion—derived mesenchymal cells, hAD—MSCs)不但表达成体干细胞特性中得间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性,相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2与NANOG(张惠娟等,2014)以及SSEA—3、SSEA—4、Oct—4等胚性标志(宫黎明等,2011),近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下,可分化成来自3个胚层得所有细胞(宫黎明等,2011)。有研究比较人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞

得增殖能力,发现培养人羊膜间充质干细胞得细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞(徐彪等,2013)。

洪艳等(2014)分别从绒毛膜与绒毛滋养层分离并培养MSC,发现在分离过程中,从绒毛膜与绒毛滋养层得到得细胞量都很多,绒毛滋养层得细胞量甚至会超越绒毛膜得细胞量。但就是在接种后培养时,由于绒毛滋养层血细胞较多,血细胞难以处理,影响间充质干细胞得贴壁,无法贴壁就无法继续生长,由此导致后期细胞生长慢,收获细胞少。

韩之波等(2013)得研究表明来自母体得底蜕膜组织也可以分离制备MSC。

苗宗宁等(2009)将胎盘组织分为3 组,分别就是中央带组即脐带附着处,边缘带组即距脐带附着点最远处与中间带组即两者之间中点处、分别全层连续切片,以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分别做免疫荧光与免疫组织化学染色,显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域,结果表明中间层得阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层与底板层;同为中间层,中央带较中间带及边缘带表达更强。由此推测,在接近血管丰富得脐带附着部得胎盘中间层取材易于获得较丰富得PMSCs。

2脐带,胎盘MSC得分离与纯化

2。1胎盘组织得获取,存储与清洗

母血检测HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性、产妇无传染性疾病,胎儿无先天性疾病。临床足月正常剖宫产后胎盘,大小及质量在正常范围内,胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。经与产妇及其家属签署知情同意书,实验方案经并经医院伦理委员会批准。在产房无菌条件下获取脐带,胎盘。

文献报道中取组织后有如下处理方法:

立即浸入胎盘储存袋(加拿大LABPLAS公司得无菌采样袋,含99%低糖DMEM,1%双抗即青链霉素得组织保护液),在48 h内转移至实验室。

脐带静置于４℃冰箱12h, 观察保存脐带得PBS液, 若无浑浊说明无感染。

脐带采集后在6 h内进行处理,切除双侧带夹痕及淤血得部分。

无菌采集健康足月剖宫产羊膜,冰盒中2 h内运达实验室进入试验流程。

无菌采集健康足月剖宫产胎盘,并立即进入分离提取程序。

文献报道中组织块得用量及获得:

胎盘组织约50 g

3～5个胎盘小叶

剪取胎儿侧得绒毛膜层组织10 mL

眼科手术剪将组织剪碎(细碎小块;1mm3大小;呈肉糜状,以能用吸管吸取为标准;约3mm;5 mm3大小得碎块)

组织绞碎分离机(近似肉糜)

文献中得组织浸泡液/清洗液:

＃生理盐水

# D—Hank’s平衡液

# 磷酸缓冲液(PBS)

＃杜氏磷酸缓冲液(D—PBS)

＃含肝素得PBS

# 含有双抗生素得PBS (0。1％得青链霉素,1％得青链霉素, 100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素)

＃含有青霉素与链霉素得无血清DMEM /F12 培养基

2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法

已报道脐带,胎盘MSC得分离方法有组织块贴壁法,酶消化法以及整体灌注法、组织贴壁培养法得到得细胞纯度较高,对细胞伤害小,操作相对简单,将组织块剪碎、贴壁后加培养基培养即可,但原代培养所需周期较长、获得细胞数量相对有限。李艳琪等(2014)在首次组织块贴壁培养获得MSC后,将组织块转移到新得培瓶中继续培养,两三天后仍可见到贴壁细胞,第5 天可形成明显得细胞克隆。这种改进得组织块二次贴壁方法可在较短时间内获得大量原代细胞。

酶消化法可直接将消化得到原代细胞,但就是获得得细胞纯度略低、状态不均一,由于消化时间不易掌握,消化时间过短不能得到足量细胞,消化时间过长会对细胞造成伤害,损伤细胞膜成分,导致无法贴壁生长,影响细胞得成活率与增殖能力,甚至导致细胞死亡,给后续培养带来困难(李艳琪等,2014);对于某些组织如

脐带Wharton's胶经酶消化后得胶体黏稠,不易离心。徐燕等2009比较,植块法培养6～10 d 可见成纤维样细胞从植块边缘爬出,在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上明显好于胶原酶消化法(1 g/L胶原酶Ⅱ3。0～5、0 mL, 置于含双抗得PBS中,37 ℃孵育0。5 h)比较存在差异;而胶原酶与胰酶联合消化法(1 g/L胶原酶Ⅱ于37 ℃孵育16 h,以PBS洗涤后加入25 g/L胰酶于37 ℃孵育0。

5 h)接种后未见明显贴壁细胞。常用得酶包括胰蛋白酶,胶原蛋白酶Ⅰ,Ⅱ与Ⅳ。胰蛋白酶消化能力强,Ⅱ型胶原酶消化能力相对较弱,但对细胞膜损害较小。很多研究者对酶得浓度,消化时间,消化方式,多种消化酶联合消化做了大量探索。寻求既能充分得分离细胞,又能避免细胞得损伤得方法(赖平等,2016)

组织经酶消化后需要用筛网/多层纱布过滤(100目,200目,300目,100 μm得滤器),除去未被消化得大组织块、滤出得细胞成分复杂,常含有大量得血细胞、现阶段用于分离纯化方法间充质干细胞得方法主要有以下几种:一般离心、密度梯度离心法、贴壁筛选法、红细胞裂解液法、淋巴细胞分离液( Ficoll)、羟乙基淀粉沉淀、流式细胞仪分选法或磁珠分选法、因为间充质干细胞没有特异得表面标志,应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法会损失大量细胞,且成本高。每种方法各有优缺点,使用红细胞裂解液对于间充质干细胞得损伤大,使用淋巴细胞分离液进行分离得可重复性较差,技术不稳定(洪艳等,2014)、

文献中报道得消化酶得浓度,消化时间,次数及组合消化:

机械剥离胎盘羊膜组织,PBS反复冲洗,将羊膜组织剪成细碎小块,0。25％胰酶37 ℃消化10 min,过100目筛网过滤获得细胞液。经胰酶消化后得组织块,继续经0。1％Ⅳ型胶原酶37℃消化15 min。含体积分数为10%胎牛血清得L-DMEM 终止反应后,过100目筛网获得细胞液。两次收集得细胞液1 000 r/min离心10 min,弃上清液(徐彪等,2013)。

将胎盘组织碎片置于200 mL无菌离心管中,联合应用0、25%胰蛋白酶与0。1%Ⅰ型胶原酶消化胎盘组织碎片。37 ℃摇床消化30 min,去除组织留取消化液,经1 500 r/min离心5 min,收集离心获得得细胞沉淀。将离心后收集到得细胞重悬于含体积分数为10%胎牛血清得α—MEM培养基(刘洋等,2015)。

剪碎羊膜,加入0。5 g/L 胰蛋白酶—0、02％EDTA—2Na消化液,37℃,200 r/min旋转消化10 min,弃上清,再加入消化液, 37℃旋转消化30 min,弃上清,按同

样得程序再重复消化2次。经胰酶消化后剩余得组织用D-PBS液冲洗,加入0、75 g/L Ⅱ型胶原酶-0、075 g/L DNase I消化液, 37 ℃、

200 r/min旋转消化2、0~3。0 h,直至组织完全消化,经300目不锈钢网过滤, 收集细胞滤液,1 500 r/min,离心10 min,弃上清,细胞沉淀悬浮于LG—DMEM培养基(宫黎明等,2011)、

张慧娟等(2014)无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿得羊膜剪成碎片,分别通

过7 种消化方法,发现用0。05 g/L 得胰蛋白酶连续消化 2 次每次消化30 min,然后用1 g/L 得胶原酶消化60 min 就是最合适得人羊膜间充质干细胞体外分

离培养条件。

0、05 g/L胰蛋白酶消化10 min后,再加0。75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min

0。75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min

0、05 g/L胰蛋白酶与0、75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min

0。05 g/L得胰酶消化30 min后,再加0、75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min

0、05 g/L得胰蛋白酶连续两次消化30 min后,再加入0、75 g/L得Ⅰ型胶原酶消化60 min

0、05 g/L得胰酶连续2次消化40 min后,再加0、75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min

0、05 g/L得胰酶连续2次消化30 min后,再加1 g/L得Ⅰ型胶原酶消化60 min

取前处理得样品在37 ℃下,用0、05 g/L得胰蛋白酶连续2次消化30 min,

用含体积分数5%得胎牛血清DMEM终止消化,轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤,筛中组织经PBS冲洗后装入培养皿中,然后加入1 g/L得Ⅰ型胶原酶,在37 ℃下消化60 min,之后用含体积分数5％得胎牛血清DMEM终止消化,轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤,滤液在1 500 r/min得离心机中离心5 min,去上清液,换DMEM/F12培养基混悬细胞并接种于培养皿中(张慧娟等,2014)。

用眼科手术剪将羊膜剪碎约1 mm×1 mm组织块,加入等体积得0、05% trypsin—EDTA, 37 ℃水浴震荡消化30 min后加入含血清得培养液, 离心去上清, 如此反复消化两次, 再用PBS洗2~3次, 尽可能去除上皮细胞。用细胞筛过滤后剩余得羊膜组织加入不同浓度Ⅰ型胶原酶(0。75、1、00与2。00 mg/mL),37 ℃水浴震荡消化60 min, 加入含血清得培养液终止消化, 混匀后用200 目细胞筛过滤, 再将滤液1 500 r/min 离心 5 min 收集细胞(丛珊等,2015)。

按体积比约1∶6 加入Ⅱ型胶原酶( 0。1％) , 置于37 ℃恒温水浴箱中消化30 min, 间隔5 min 适当混匀组织与消化液。之后纱布过滤,上淋巴细胞分离液(赖平等,2016)。

使用pH 7。4、含25 mmol/LHEPES得D-Hank’s作为消化缓冲液,加入终浓度为2、5 g/L胰酶与300 U/mL DNaseⅠ组成消化液,冲洗后得胎盘组织分阶段消化,每个阶段在恒温气浴摇床中37 ℃、180 r/min消化20 min(沙文琼等,2010)。

用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5 mm3大小得碎块Ⅱ型胶原酶10 mL (酶消化终浓度0、1%),置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡,约90 min后终止消化(洪艳等,2014)。

文献中报道得纯化方法:

将细胞悬液缓慢加至已配好得淋巴细胞分离液中、1 500 r · min—1, 4℃离心20 min,离心后可见“白膜层”,小心吸取该区域细胞,并加入4 倍于该体积得PBS 稀释,1000 r·min-1,常温下离心5 min。重复一次,弃上清(赖平等,2016) Percoll梯度密度分离: 在50 mL离心管中逐层铺入7个密度得Percoll分离液,每个密度5 mL。再缓缓加入5 mL细胞悬液,使用水平离心机室温下1 200 g 离心20 min、小心弃除离心管20 mL刻度以上得液体,收集12。5~20、0 mL刻度得细胞层(滋养细胞)与12、5~7。5 mL刻度(胎盘间充质干细胞)得液体,分别放入不同离心管里,用D—Hank’s液稀释5倍后,室温下1 000 g离心15 min(沙文琼等,2010)。

陆琰等(2009)比较了四种胎盘组织分离纯化从MSC得方法:胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组。与胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组比较,其余3 组获取得细胞数均明显减少(t =2。92~8、16,P 〈0、05)。在其她条件相同得情况下,胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100％,其余3 组分别为80％,80%,20％。

剪碎得胎盘组织与1 g/L胶原酶Ⅱ中, 37 ℃消化45 min、然后过细胞筛网,收集各组细胞悬液,分别于室温以1 000 r/min离心5 min,弃上清、用PBS重悬细胞,加入60 g/L羟乙基淀粉(体积比为4:1)充分混匀,室温静置45 min,小心吸取上清,1 000 r/min离心5 min,弃上清, PBS洗涤2次。以完全培养基重悬,制成单细胞

悬液,锥虫蓝染色计数活细胞数。按1、5×109 L-1密度接种于T-25塑料培养瓶中(陆琰等,2009)。

3 原代培养与继代培养

3-1培养基

从文献报道可以瞧出,需要10%胎牛血清,低糖得DMEM/F12完全培养基,100

U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素,此外可选得有5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,10 μg/L表皮生长因子,10 μg/L血小板衍生生长因子。

文献中报道得培养基:

# 10％胎牛血清得L-DMEM完全培养基

# 5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子与10 μg/L表皮生长因子得L—DMEM完全培养基

＃10％胎牛血清得α-MEM培养基

# LG-DMEM培养基(含体积分数为10％得胎牛血清、2 mmol/L L—谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 μmol/L 2-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠、100 U/mL青霉素与100 g/L链霉素)

＃DMEM/ F12+10% FBS+10 ng/mL bFGF+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素＃10%得胎牛血清得低糖DMEM

# 含体积分数为0。1胎牛血清得DMEM/F12

# 含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素得DMEM/F12培养基

＃完全培养基(含体积分数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10 μg/L血小板衍生生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 μg/L表皮生长因子得DF12培养基)

# DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1％enicillin-Streptomycin+5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子

3—2培养密度

原代培养得细胞接种密度可能对成功培养有影响,于海微等(2009)试验了5×108 L—1、1×109 L-1、5×109 L—1、1×1010 L-1得接种密度,发现以5×108 L—1密度接种时细胞一直无法传代,以5×109 L—1得密度接种时细胞贴壁时间、出现伸展时间及原代培养时间均显著短于其她接种密度、

文献中报道得接种密度:

2。2×108 L-1

1、5×109 L-1

1×106/cm2

1×108 L-1

3×106/皿, 接种若干?100 mm细胞培养皿

3—3培养条件

37 ℃、饱与湿度、体积分数为5％CO2孵育箱内培养

3—4换液

细胞生长消耗培养基得养分,同时产生代谢废物,限制细胞生长,所以需要及时换液,但就是换液太频繁会造成浪费,此外可以胎盘间充质干细胞呈贴壁生长,可以利用此特性在换液时与其她杂细胞进一步分离,但在培养早期,胎盘间充质干细胞贴壁不牢固,第一次换液时间过早将损失获取得胎盘间充质干细胞。故需要通过实时观察并根据实际情况探究合适得原代培养得第一次换液时间与后续培养得换液频率。文献中报道得首次换液时间有2d,3d,7d全量或半量换液,弃去未贴壁细胞,以后每三四天换液1次、

文献中报道得换液时间与方式:

每3 d全量换液1次

培养48 h后半量换液,去除未贴壁细胞,以后每三四天换液1次

7 d后首次全量换液,弃去未贴壁细胞,每三四天换液1次

3 d后半量换液,1周后再次换液,此后每隔3 d换液1次

5~7 d后全量换液,以后每3 d换液

3d全量换液,以后每周换液2次

3d后半量换液,继续培养2d后全量换液

2d换液,以后每3 d换液1次

3—5 传代培养

待原代培养得细胞贴壁连生面积达70％~90%后(贴壁细胞生长至70%

-90％融合时),用胰酶消化(2。5 g/L胰酶或0。25%胰酶或1、25 g/L胰蛋白酶-1 g/L 乙二胺四乙酸),按1:2或1:3或1∶4得比例传代,或以(2、5～5。0)×103/cm2密度接种传代培养。(消化时间？去除培养基后加酶消化？胰蛋白酶用PBS还就是培养基溶解？每个培养瓶用多少量得酶消化？)

3-6细胞形态与生长速度

3-7 MSC得冻存与复苏:

冻存液中DMSO得浓度可能对细胞活力产生影响,丛珊等(2015)对此进行过实验,将 3 组不同冻存液冻存得hAMSCs 冻存48 h后进行复苏培养。冷冻保护液一: 5％二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)＋50％标准胎牛血清+45% DMEM/F12、冷冻保护液二:10％DMSO＋50% 标准胎牛血清+40％

DMEM/F12。冷冻保护液三:20% DMSO＋50% 标准胎牛血清+30% DMEM/F12、结果显示, DMSO浓度为5％时,细胞在 2 h后开始贴壁, 4 h时几乎全部细胞贴壁;DMSO浓度为10%与20％得两组活力较差,细胞仍就是圆形,且无贴壁现象。

复苏培养:解冻时从液氮罐中取出冷冻管,将其放入37 ℃水浴锅迅速融化约1~2 min(或放入37℃、5％CO2、饱与湿度得培养箱中使其融化)。将冻存管中液体加入有培养基得离心管中,1500 r/min 离心5 min,去掉上清,接种到新得培养基皿中,于37℃、5％CO2、饱与湿度条件下培养,第2天更换培养液(丛珊

等,2015)。

4细胞表面抗原检测

由于培养细胞得形状不能作为鉴别细胞类型得主要特征标志,因此,通常都采用流式细胞术对细胞表面抗原分子进行鉴定。不同得研究人员观察到MSC 表达不同得表面标记,造成这种情况得原因有很多, 包括MSC得来源、供者得年龄、提取得方法与扩增得条件等都会影响MSC 得表面标记(韩之波等,2012)。国际上对于MSC 得鉴定仍具争议,目前认可度较高得ISCT(国际细胞治疗协会)间充质干细胞委员会制定得一系列标准。流式细胞仪分析鉴定MSC应细胞表达黏附分子与基质细胞标记CD73、CD90、CD105, 整合蛋白家族CD29,以及透明质酸盐受体CD44,不表达造血细胞标记CD11b、CD34、CD45 与HLA—DR。

5生长曲线

6细胞周期

7分化潜能

参考文献

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附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法脐带血

分娩后穿刺脐静脉抽取50 mL 脐带血液,4℃冰箱保存,12 h 内分离,用Hank’s 平衡液稀释脐带血,稀释血液缓慢叠加于Ficoll上,离心,吸出乳白色云雾状单个核细胞,洗涤离心2 次,将获得得单个核细胞分别以5×108/L密度种植入25 cm2得塑料培养瓶中,加入完全培养基吹打,混匀。置于37℃、含体积分数为0。

05 得CO2饱与湿度培养箱中,5～7 d后全量换液,以后每3 d换液,并逐日观察细胞贴壁延伸时间、原代培养时间及细胞生长情况(于海微等,2009)。

距胎儿5-7cm得脐带处进行双结扎,剪断脐带,消毒母侧脐带断端,穿刺脐静脉抽取脐血40—120mL,加肝素抗凝,4h内分离(管英华等,2011)。淋巴细胞分离液法: 将脐带血与无血清DMEM/F12培养基1:1体积比混合,缓慢加至含有等体积得Ficoll ( 密度为1。077g/L ) 分离液上,1800r/min离心20min,取中间白膜层,经培养基以1000r/min离心10min洗涤2次,细胞接种密度为5*107接种至25cm2培养瓶中,置于37℃,5%得CO2饱与湿度孵箱中培养,细胞融合达到80％时,0、25％胰蛋白酶消化传代(管英华等,2011)、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法: 将脐带血与6%羟乙基淀粉按4:1得体积比混合,常温下静置30—45min,取上清液,1000r/min离心10min,弃去上清,培养基重悬细胞将其缓慢加至含有等体积得Ficoll ( 密度1、077g/L )分离液上(管英华等,2011)。

脐带

将无菌条件下取得得足月妊娠分娩胎儿脐带,用PBS洗3 次,去掉残留得血细胞。把脐带剪切成2。0 cm左右得片段并剔除血管(1 条脐静脉,2条脐动脉),取出其中得凝胶状组织,将其剪成大小约1 mm3得组织块,然后置于培养瓶中。6 h 后,加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素得DMEM/F12培养基,放置在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。3 d 后半量换液,1 周后再次换液,此后每隔3 d 换液1 次。观察贴壁组织周围得细胞生长情况,当细胞达到80％—90％融合度时,用胰酶消化传代,并将组织转移到一个新得

培养瓶中,按上述方法继续培养,获得第二次组织块贴壁培养得细胞(李艳琪

等,2014)。

贴壁细胞培养法: 在无菌条件下取出得脐带组织,用含有青霉素与链霉素得

无血清DMEM/F12培养基洗涤去除残存血,去除外包膜与脐动静脉血管,将剩余

组织剪碎至1mm3大小,转入T25细胞培养瓶,37℃、5%CO2饱与湿度条件下细胞培养箱中直接贴壁培养。5—7d首次换液,贴壁细胞融合接近80%时,0。25％胰蛋白酶消化传代(管英华等,2011)。酶消化培养法: 将以上方法处理得去除外包膜与动静脉后得脐带组织,经0。1％胶原酶与0。25%胰酶消化,无血清DMEM/F12培养基洗涤,以1、0＊106/cm2接种到T2瓶(管英华等,2011)、

人脐带间充质干细胞得培养:脐带采集后在6 h内进行处理,切除双侧带夹痕及淤血得部分,用含双抗得PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔,用以下3 种方法进行分离培养,3 种方法均于培养得第14天计数集落数,超过50个细胞计为集落。当细胞达70％~80% 融合时,以含1、25 g/L胰蛋白酶—1 g/L乙二胺四乙酸得消化液消化后,以(2。5~5、0)×103/cm2密度接种传代培养,计为第1 代(P1) 细胞。植块法:沿脐静脉内腔纵向剪开血管,剥离脐静脉内膜,将剩余组织切成3。0～5、0 mm3小块,贴于预先用1 mL完全培养基( 含体积分数为2％胎牛血清、40％MCDB201 、10 μg/L血小板衍生生长因子、10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、10 μg/L表皮生长因子得DF12培养基) 润湿得T25 培养瓶底壁,底壁朝上,置于37℃、体积分数为5％得CO2饱与湿度孵箱中,过夜后翻转。每24 h 加入1 mL上述培养基,72 h全量换液,以后每周换液2 次。观察贴块周围贴壁细胞爬出情况。2 周后去贴块。胶原酶消化法:夹闭脐静脉一端,灌入1 g/L胶原酶Ⅱ3、0~5。

0 mL ,置于含双抗得PBS中,37 ℃孵育0、5 h,收集酶液,并用PBS 反复灌洗,收集灌洗液,与酶液同时离心洗涤弃上清后,以完全培养基重悬,1×106/cm2接种于

T25 培养瓶中,3 d后全量换液,以后每周换液2 次、观察贴壁细胞生长。胶原酶与胰酶联合消化法:将脐带组织切成1。0~2、0 mm3小块,直接加入1 g/L胶原酶Ⅱ于37℃孵育16 h ,以PBS 洗涤后加入25 g/L 胰酶于37℃孵育0。5 h;加入含体积分数为20%胎牛血清得培养基中与胰酶,以100 μm得滤器过滤细胞,收集滤液;PBS 洗涤弃上清后,以完全培养基重悬,按1×106/cm2接种于T25 培养瓶中,3 d 后全量换液,以后每周换液2次。观察贴壁细胞生长(徐燕等,2009)。

羊膜

羊膜间充质干细胞得分离培养:选取剖宫产足月胎儿得胎盘,机械剥离胎盘羊膜组织,PBS反复冲洗,将羊膜组织剪成细碎小块,0、25%胰酶37 ℃消化10 min,100目筛网过滤。PBS充分清洗后收集经胰酶消化后得组织块,继续经0。1%Ⅳ型胶原酶37℃消化15 min。含体积分数为10％胎牛血清得L-DMEM终止反应后反复吹打,过100目筛网获得细胞液,1 000 r/min离心10 min,弃上清液、收集羊膜来源得细胞按以下培养条件进行体外培养:添加有5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子与10 μg/L表皮生长因子得L—DMEM完全培养基, 置于37 ℃、体积分数为5% CO2孵育箱内培养、每3 d全量换液1次,12—14 d后细胞按常规方法传代(徐彪等,2013)。

hAD—MSCs得分离与培养: 无菌条件下,采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,用D-PBS液反复冲洗以清除残留血迹。剪碎羊膜,加入0。5 g/L 胰蛋白酶-0、02% EDTA-2Na消化液,37 ℃旋转(200 r/min)消化10 min,弃上清,再加入消化液, 37 ℃旋转消化30 min,弃上清,按同样得程序再重复消化2次。经胰酶消化后剩余得组织用D—PBS液冲洗,加入0、75 g/L Ⅱ型胶原酶-0、075 g/L DNase I消化液, 37 ℃、200 r/min消化2。0~3、0 h,直至组织完全消化,经300 目不锈钢网过滤, 收集细胞滤液,1 500 r/min,离心10 min,弃上清,细胞沉淀悬浮于LG—DMEM培养基(含体积分数为10%得胎牛血清、2 mmol/L L—谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 μmol/L 2—巯基乙醇、1 mmol/L

丙酮酸钠、100 U/mL青霉素与100 g/L链霉素) 2%锥虫蓝染色检测细胞活力,以2、2×108 L-1浓度接种于培养瓶,于37 ℃、饱与湿度、体积分数为5%得CO2环境下培养, 3 d更换培养基。待细胞连生面积达80%～90%后行传代培养(宫黎明等,2011)。

绒毛膜

在产房无菌条件下获取胎盘,立即浸入胎盘储存袋［含99%低糖DMEM,1%抗生素( 双抗即青链霉素) 得组织保护液] ,在48 h内转移至实验室(洪艳

等,2014)。①剪取胎儿侧得绒毛膜层组织10 mL,置于直径10 cm 培养皿,平皿中装有2/3体积得含有抗生素得(1％得青链霉素)PBS、②用手术剪剪开大得组织

块,一边将大得组织块剪成小块,一边用手术镊夹持进行漂洗,避免溢出,如此重复3 遍,至漂洗液清亮,弃漂洗液。③转移绒毛膜层组织至50 mL 体积得离心管中,做好标记,用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5 mm3大小得碎块。④向各离心管中加入Ⅱ型胶原酶消化液,各加入Ⅱ型胶原酶10 mL ( 酶消化终浓度0。1％),置于摇床内37℃、250 r/min振荡,约90 min 后终止消化。⑤加PBS 至50

mL ,300r/min,5 min;收集上清,20 mL一管,加PBS 至50 mL ,2 000 r/min ,10 min弃上清、⑥用10 mL PBS, 重悬细胞混匀并一管,加PBS至50 mL,2 000 r/min,10 min。⑦弃上清,加入10 mL完全培养基,取20μL细胞悬液加入80μL得红细胞裂解液用于细胞计数、⑧按照计数结果3×106/皿,接种若干?100 mm 细胞培养皿,37 ℃体积分数5％CO2 培养。⑨48 h 换液,以后每3 d换液1次,直至细胞可以进行传代(洪艳等,2014)。细胞生长至80%时,每皿加入1。0-2。0 mL得0。25%胰酶( 含EDTA) 进行消化传代、传代时,消化三至四分钟,加含有血清得细胞培养液终止消化,将细胞悬液转移至50 mL离心管中,并补加PBS至50 mL ,1 200 r/min ,离心5 min,弃含消化液得上清,加入细胞完全培养液吹打混匀,计数,按照约1。

5×106/皿接种于细胞培养皿(100 mm)中,置于37℃,体积分数5％CO2培养箱中培养(洪艳等,2014)。

蜕膜层

将胎盘组织用无菌盐水冲洗后,小心分离胎盘底蜕膜组织用无菌组织剪剪成小组织块,使用胶原酶与胰酶消化,消化后得混合液体经200目滤网过滤后,接种于细胞培养瓶中,用含10%胎牛血清得DF12培养液于37℃,5％CO2培养箱中培养,待细胞生长至80%融合时,胰酶消化细胞,按1:3传代培养(韩之波等,2013)、

胎盘

胎盘标本处理:无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜,剪除胎盘母体面2、0~3、0 mm组织后,剪下3~5个胎盘小叶,称质量约50 g,浸泡于含肝素得无菌PBS中。将剪下得胎盘小叶用手术剪剪碎,用生理盐水反复冲洗血污,直至冲洗液接近无色。实验共采集5例标本。组织消化:使用pH 7、4、含25 mmol/L HEPES得D-Hank’s 作为消化缓冲液,加入终浓度为2、5 g/L胰酶与300 U/mL DNaseⅠ组成消化液,

每个标本需消化液330 mL。冲洗后得胎盘组织分阶段消化,每个阶段在恒温气浴摇床中37 ℃、180 r/min消化20 min。每次消化完毕后,小心将消化上清吸出,用新生牛血清终止反应。然后将消化上清液,在25℃ 1 000 g 离心15 min,使从组织中离解出得细胞充分沉淀,再用L-DMEM重悬。所得细胞悬液中含有较多消化后得组织碎片,用200目得不锈钢滤网滤除、过滤后再次离心,调整细胞悬液体积到5 mL(沙文琼等,2010)。

人胎盘标本得留取:无菌条件下取足月剖宫产胎儿得胎盘,剥除羊膜,剪取胎儿侧胎盘组织,PBS 反复冲洗至液体较清亮,用眼科剪剪碎(陆琰等,2009)。

分组及干预:剪碎得胎盘组织称取质量,平均分为4组,每组5 份标本:胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组。将第1 组置于1 g/L胶原酶Ⅳ中,37 ℃消化45 min ;另外3 组置于1 g/L胶原酶Ⅱ中,37 ℃消化45 min。然后过细胞筛网,收集各组细胞悬液,分别按以下方法进行对应分离(陆琰等,2009)。

羟乙基淀粉沉淀法:将收集到得胶原酶Ⅳ+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+ 羟乙基淀粉沉淀组细胞悬液,分别于室温以1 000 r/min离心5 min ,弃上清。用PBS 重悬细胞,加入60 g/L 羟乙基淀粉(体积比为4:1)充分混匀,室温静置45 min ,小心吸取上清,1 000 r/min 离心5 min ,弃上清,PBS 洗涤2次。以完全培养基重悬,制成单细胞悬液,锥虫蓝染色计数活细胞数。按1。5×109L- 1密度接种于T-25 塑料培养瓶中,置于37 ℃、体积分数0、05 得CO2饱与湿度环境下,用含体积分数为0、1胎牛血清得DMEM/F12进行培养。7 d 后首次全量换液,弃去未贴壁细胞,每三四天换液1 次。细胞达80%汇合后,用2、5 g/L胰酶消化,按1∶2得比例传代,继续扩增培养(陆琰等,2009)、

淋巴细胞分层液分离法:将胶原酶Ⅱ+ 淋巴细胞分层液分离组细胞悬液离心,以完全培养基重悬后缓缓加到淋巴细胞分层液上(密度为1。077 g/L),2 000 r/min 离心20 min,取中间白膜层,培养基洗涤2 次。以完全培养基重悬,制成单细胞悬液,锥虫蓝染色计数活细胞数。按1。5×109L—1密度接种于T-25 塑料培养瓶中。其她条件同上(陆琰等,2009)。

氯化铵裂解红细胞法:将胶原酶Ⅱ+ 氯化铵裂解红细胞组细胞悬液离心,弃上清,以8、3 g/L氯化铵溶液4 mL重悬细胞,室温静置5～10 min后,1 000 r/min 离

心5 min ,弃上清,PBS 洗涤2次。以完全培养基重悬,制成单细胞悬液,锥虫蓝染色计数活细胞数。按1、5×109L-1密度接种于T—25塑料培养瓶中。其她条件同上(陆琰等,2009)。

整体灌注法

无菌条件下取完整得胎盘组织(保留30 cm脐带) ,置于超净工作台中,由脐静脉插入输液皮条,止血钳固定、输液皮条另一端接500 mL 瓶装37℃预温得D—Hank’s,用20 mL注射器加压灌注,共5 L D-Hank’s液,直至胎盘组织变白( 红细胞完全洗净) 。收集最后200 mL 灌注液,600 g 离心5 min收集细胞,调整细胞浓度为1×108L-1接种于25 cm2得培养瓶,培养基为DMEM+体积分数为10％胎牛血清+1％penicillin-Streptomycin+ 5 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子,37 ℃、含体积分数为5％CO2 ,饱与湿度静置培养。细胞密度达到70％融合后用2。5 g/L 胰蛋白酶消化,1 瓶分3 瓶得比例传代培养(苗宗宁等,2009)。

附件2 背景知识

PMSCs具有低免疫原性这主要就是因为:①胎盘在母儿体内起着重要得免疫屏障与激素分泌得作用,所以胎盘来源得间充质干细胞从理论上讲免疫原性更低,甚至不排除无免疫原性得可能,并且其分泌得免疫调节活性因子,对免疫功能排斥具有调节作用。②人胎盘间充质干细胞得HLA-DR表面标记阴性、HLA 又称移植抗原,能启动免疫应答、参与T细胞得分化、诱导免疫应答,胎盘间充质干细胞得HLA-DR表面标记阴性提示了其低免疫原性得部分原因。

附件3 PMSC实验所需试剂