微生物基本操作规范样本

培养基制备

培养基概念：

是指以液体、半固体或固体形式，包括天然或合成成分，用于增进微生物繁殖或保持其活力物质构成。由于各类微生物对营养规定不同，培养目和检测需要不同，因而培养基种类诸多。咱们可依照某种原则，将种类繁多培养基划分为若干类型。

培养基分类：

按功能分类：基本培养基、营养培养基、鉴别培养基、选取培养基、特殊培养基。

按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

液体培养基：所配制培养基是液态，这种培养基被用来微生物增菌和生长状态观测。

固体培养基和半固体培养基：在液体培养基中加入适量凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。惯用作凝固剂物质有琼脂。固体培养基琼脂用量1.5-2%，半固体培养基琼脂用量在0.5～1%之间。固体培养基用作微生物分离、鉴定、计数、保藏等。半固体培养基被用来观测微生物动力和保藏菌种。

今天给人们展示一下各种培养基制备。

培养基制备基本过程：

调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查和保存

所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。

（1）调配成分：

在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml，1％蛋白胨，0.5％NaCL，0.3％牛肉膏（g/v），精确称取各种成分，使其充分混合。[注意事项]

培养基调配溶解：

先在锥形瓶底加入少量蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅，搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁和铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0.14mg/L时抑制细菌毒素产生，含铜量超过0.3mg/L时抑制细菌生长）。培养基中若需加入染料，胆盐，批示剂等，应在校正pH后加入。

（2）溶解：

将配制好混合物微波炉加热8min，使其完全溶解，补足失水。（3）校正PH：

不同细菌需要在含不同pH培养基上生长，普通将培养基pH调至7.2～7.6。商品化试剂配制后可省略该环节，无需校正PH。依照所需培养基用途不同分别加入不同含量琼脂，制成半固体培养基和固体培养基。

（4）分装：（液体培养基、半固体培养基和某些固体培养基分装可在灭菌钱也可在灭菌后）

①基本培养基：普通分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；

②琼脂斜面：普通在融化后分装于试管，量约为试管高度1/4~1/3，灭菌后倾斜放置。

③半固体培养基：分装量为试管容量1/4~1/3，灭菌后直立放置。

④液体培养基：分装量为管长1/5，灭菌后直立放置。

（5）灭菌：

分装好培养基惯用高压蒸气灭菌，条件为103.43kPa，温度121℃15~20min；含糖培养基以68.95kPa，10~15min为宜，以免破坏糖类物质；不耐高热物质配制成培养基，惯用流通蒸气灭菌或滤过除菌。琼脂平板制备：先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径75mm平皿约8-9ml），水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。

营养平板制备：先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作加入10%无菌脱纤维羊血（临用前置37℃水浴预温30min），轻轻摇匀（避免产气愤泡），倾注于灭菌平皿内（内径75mm平皿约8-9ml），水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。

[注意事项]

平板浇注：倾注培养基时，切勿将皿盖所有启动，以免空气中尘埃及细菌等微生物落入。倾注时若培养基温度过高，则冷凝水过多，易致污染，不易分离到菌落；若温度过低，某些琼脂凝固，倾注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝，这样利于蒸气散发，减少平板内冷凝水。倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产气愤泡，倾注时适时转动锥

形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面气泡。

（6）质量检查：

需做无菌实验和效果实验。

①无菌实验：将灭菌后培养基置37℃孵育24h，无任何微生物生长为合格。

②效果实验：将已知原则参照菌株接种于待检培养基中，检查细菌生长繁殖状况和生化反映与否与预期成果相符和。

（7）保存：

通过质量检查合格培养基注明名称，制作日期存储于冷暗处或4℃冰箱（固体培养基应将平皿底朝上，盖朝下或用保鲜袋包裹，以减少水分蒸发，液体培养基应直立放置，以免污染）。

微生物分离培养和接种技术

接种：将微生物接到适于它生长繁殖人工培养基上或活生物体内过程叫做接种。将微生物混和培养物通过一定接种技术接种到人工培养基中得到纯培养过程称为分离纯化。今天给人们展示一下各种培养基分离培养接种技术和细菌生长状态。

1.接种所需物品：接种工具（接种环、接种针等）、酒精灯、待接种菌种。接种环用于固体和液体培养基接种，接种针用于固体培养基和半固体培养基接种。接种技术规定：用灭菌工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于灭菌培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

接种工具灭菌办法：普通接种环或接种针在火焰上外焰灭菌。灭菌后接种工具在接种微生物前需先冷却，可接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新培养基上。接种后将接种工具再次灭菌才可放置。

2.接种环境：为避免接种过程中标本中微生物污染环境及空气中微生物污染培养物，微生物接种应在特定环境内接种。惯用设备有接种罩、超净工作台或无菌室等。

3.接种办法：依照待检标本性质、培养目和所用培养基性质采用不同接种办法。

（1）平板划线分离培养法：通过平板划线分离培养使混合细菌培养物在培养基表面分散生长，各自形成菌落，依照菌落形态及特性，挑选单个菌落，通过移种而获得纯种细菌（纯培养）。平板划线分离培养法惯用来分离、鉴定、检查杂菌、计数、保藏、生物测定等。依照划线方式不同有持续划线分离法、分区划线分离法、棋盘划线分离法等。

a.持续环线分离法：

先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少量。左手拿起平板，并用拇指和食指将平板盖打开，右手迅速将取有培养物接种环从打开空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作持续划线接种，线与线间留有恰当距离，将整个平板表面划满曲线。注明标记后，置35℃培养箱中培养，普通在18~24小时后观测成果。