星形胶质细胞存在L型钙通道的新证据
收稿日期：2007-06-19；接受日期：2007-09-11
基金项目：国家科技部高技术研究发展计划（863计划）（2002AA2Z3115） *
通讯作者（Corresponding author ），E-mail: caijx@https://www.360docs.net/doc/8d16218565.html,
动 物 学 研 究 2007, Oct. 28(5): 485－490 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research
星形胶质细胞存在L-型钙通道的新证据
王 磊1,2，蔡景霞1,*
（1. 中国科学院昆明动物研究所 脑与行为实验室，云南 昆明 650223; 2. 中国科学院研究生院，北京 100049）
摘要：以纯化培养的小鼠星形胶质细胞(Astrocyte ，AS)为实验材料，采用激光共聚焦钙成像和荧光分光光度
计技术，探讨钙激动剂Bay k8644和钙拮抗剂nimodipine 对星形胶质细胞胞内钙离子浓度的影响。结果显示，Bay k8644在0.0001、0.001和0.01 mmol/L 浓度下均可显著增加星形胶质细胞的细胞内钙水平，而nimodipine 在0.001、0.01和0.1 mmol/L 浓度下均可显著降低星形胶质细胞胞内钙水平，并阻止KCl 引起的细胞内钙升高。上述结果表明星形胶质细胞对L-型钙通道激动剂和拮抗剂的反应与神经元的反应相似，提示星形胶质细胞胞膜上也存在L-型钙通道。
关键词: 星形胶质细胞；细胞内钙浓度；Nimodipine ；Bay k8644；L-型钙通道 中图分类号：Q25; Q421 文献标识码：A 文章编号：0254-5853-(2007)05-0485-06
New Proof for Astrocytes Having L-type Calcium Channels
WANG Lei 1,2, CAI Jing-xia 1,*
(1.Divison of Brain and Behavior, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences , Kunming 650223, China;
2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China )
Abstract: The laser scanning confocal microscope and fluorescence spectrophotometer were used to investigate the effects of the L-type calcium channel agonist 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-[2-(trifluoromethyl)phenyl] pyridine-3- carboxylic acid [(±)-Bay k8644] and antagonist nimodipine on intra-cellular calcium concentration ([Ca 2+]i ) of cultured mouse astrocyetes. The results showed that Bay K8644 can significantly increase the [Ca 2+]i in cultured astrocytes at doses of 0.0001, 0.001 and 0.01 mmol/L, whereas nimodipine can decrease the [Ca 2+]i at doses of 0.001, 0.01 and 0.1 mmol/L. Nimodipine can also decrease the elevation of [Ca 2+]i elicited by KCl. Our results suggest that the effects of L-type calcium channel agonist and antagonist on astrocyes are the same as those on neurons, it indicates that astrocytes also have L-type calcium channels.
Key words: Astrocyte; Intra-cellular calcium concentration([Ca 2+]i ); Nimodipine; Bay k8644; L-type calcium channel
星形胶质细胞是中枢神经系统中数目最多的一种胶质细胞。近年来发现，星形胶质细胞除了在中枢神经系统起支持、隔离、营养、清洁和防御的作用外，也参与调节中枢神经系统的发育和脑高级功能。
长期以来，人们普遍认为星形胶质细胞与神经元和胞外环境进行离子交换主要是通过间隙连接（gap junction ）完成的。但是近几年，随着膜片钳和钙成像技术的发展，人们发现星形胶质细胞也具有多种离子通道和神经递质受体。在星形胶质细胞对各种理化刺激作出反应的过程中，其胞内钙离子浓度的变化与其功能的变化相一致。
MacVicar et al (1984, 1988)在培养的星形胶质细胞上观察到了钙依赖性的动作电位的发放，之后又在培养的星形胶质细胞上记录到了nifedipine 敏感的L-型钙电流。应用经典的钙成像技术，MacVicar 等观察到星形胶质细胞在去极化时胞外钙离子内流，胞内钙离子浓度升高(MacVicar et al, 1991; Jensen & Chiu, 1991)。同时，在脑片上也有人记录到，钾离子可以增加星形胶质细胞的胞内钙离子浓度，这种反应可以被钙通道拮抗剂verapamil 抑制或者显著降低(Porter & McCarthy, 1995; Duffy
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& MacVicar, 1996)。这些研究结果都表明星形胶质细胞上存在电压门控型钙通道。
Bay k8644和nimodipine是双氢吡啶类化合物（DHPs），已证实均作用于神经元的L-型钙通道。在化学结构上，DHPs类Ca2+激动剂与DHPs类Ca2+拮抗剂相反，在DHP环的3-和 5-位不是都有酯类物，这导致了4-位碳原子的不对称性及异构体的存在。DHPs类Ca2+激动剂与拮抗剂的不同作用，就是由不同结构DHPs分子所造成。Fanelli et al (1994)研究发现，nimodipine可以阻断海马神经元L-型钙通道活性，抑制去极化引起的神经元胞内游离钙离子增加。也已证明，Bay k8644为特异性的L-型钙通道激动剂，可以使海马CA1、CA3区的锥体神经元L-型钙通道的开放概率明显增加，并可增加单通道长时程开放比例等(Hirasawa et al, 1998)。
迄至目前，尚未见Bay k8644和nimodipine对星形胶质细胞胞内钙含量影响的报道。本研究采用激光共聚焦和荧光分光光度计技术直接测定Bay k8644和nimodipine对培养的小鼠星形胶质细胞胞内钙浓度的影响，拟提供星形胶质细胞上存在L-型钙通道的新证据。
1 材料和方法
1.1 试 剂
DMEM培养基（高糖），GIBICO公司产品；新生牛血清，杭州四季青公司产品；多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）、胰酶、Bay k8644、Frua-2/AM、Fluo-4/AM、nimodipine和EDTA均为SIGMA公司产品；GFAP免疫组化ABC试剂盒，VECTOR公司产品；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.2 仪器设备
LSM510 META倒置激光共聚焦扫描电子显微镜（德国Zeiss公司），PE LS-50B荧光分光光度计（美国Perkin-Elmer公司），CO2培养箱（美国Shellab公司），Axiovert 200倒置相差显微镜（美国Zeiss公司），SW-CJ-IB超净工作台(中国苏州净化设备厂)。
1.3 实验动物
昆明小鼠种鼠由昆明医学院医学院实验动物中心提供，新生小鼠由本实验室繁殖。
1.4 细胞培养
按照McCarthy & Devllis(1980)的方法进行星形胶质细胞的原代培养。取昆明种小鼠（出生0—3 d）或胎鼠（孕17—20d），酒精消毒，剪断肋骨，暴露整个心脏，剪开右心耳，用注射器吸取1mL Hank’s液由心尖部经左心室先快后慢地推入灌流直至脑部变白，目的是去除脑部血液以清除血细胞。然后剪开头部皮肤，去除颅骨，用眼科镊夹取两侧大脑皮层，放入盛有冰冷Hank’s的培养皿中，用Hank’s液洗一次，仔细剥去血管和脑膜，再移入3 mL的小烧杯中，用虹膜剪剪碎呈糜状，移入到盛有适量0.125%胰蛋白酶的溶液中，在37℃水浴锅中消化10 min左右，消化至组织块略粘时，用含10％小牛血清的冰冷的DMEM终止消化后换DMEM液，用巴氏管轻轻吹打数次，200目钢网过滤，滤液在1000r/min下离心5m in，去上清液，以彻底清除胰蛋白酶，最后用DMEM悬浮细胞制成细胞悬液后种植到培养瓶内，用含10%新生牛血清、1% Penicillin和Streptomycin(100μg/mL)的DMEM培养基，在37℃、95%空气和5%CO2条件下恒温培养7—9 d，待细胞长满瓶底，用恒温摇床法去除表面的神经元和成纤维细胞层，用胰酶解离贴壁的星形胶质细胞传代培养。经2—3次传代培养后，用免疫组织化学的方法鉴定，胶质原纤维酸性蛋白（glia fibrilary acidic protein，GFAP）单抗染色阳性细胞即为星形胶质细胞。一般传代2次左右即可达到实验要求的95%的纯度(Vernadakis et al, 1994)。
1.5 星形胶质细胞免疫组织化学染色方法
使用GFAP ABC试剂盒进行免疫组化染色。将含有贴壁星形胶质细胞的盖玻片用PBS冲洗，4%多聚甲醛固定20min后，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶20m in，加入0.3%Triton X-100室温孵育20min，3%马血清中室温孵育30min，之后滴加单克隆抗GFAP抗体（1∶1000），4℃湿盒孵育过夜，滴加二抗（1∶200）于37℃孵育1.5h，滴加三抗（1∶100）于37℃孵育1.5h；各步之间用PBS冲洗3次，每次5m in，最后用DAB显色5m in，常规脱水、透明和封片。
1.6 激光共聚焦技术测定胞内钙荧光值
将备用的星形胶质细胞以胰酶解离，把细胞悬液调整至密度1×105个/mL，种于铺于多聚赖氨酸的无菌塑料培养板中，置于含有95%空气、5%CO2
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和37℃恒温湿化的培养箱内，进行单层细胞培养。培养5天后用Hanks液漂洗2—3次，洗去细胞表面的杂质，放入含有2μmol/L Fluo-4/AM的DMEM 培养基中，37℃负载45m in，用Hanks液洗涤2—3次，充分洗去细胞外的Fluo-4/AM，上机检测。激光共聚焦扫描显微镜检测设置：荧光探针Fluo-4/AM的激发波长494n m，发射波长516n m，扫描间隔为10s(Burnier et al, 1994; Liu et al, 2002)。先扫描静息状态下的星形胶质细胞60s，然后加入各浓度的nimodipine或Bay k8644，在同一视野下继续扫描，观察胞浆内钙荧光的动态变化。图像分析处理软件为ZEISS image examiner。
1.7 荧光分光光度计测定胞内钙浓度
将备用的星形胶质细胞培养瓶中DMEM培养基倒出后，用Hanks液冲洗，去除DMEM培养基中残留的血清，以利于胰酶的消化。在瓶中加入0.25%胰酶+0.02%EDTA消化液2—3m L，37℃孵育3—5min，至瓶内底层星形胶质细胞成球形后，将胰酶混合液倒出，以含10%新生牛血清的DMEM 培养基轻轻冲洗以去掉胰酶，终止消化。加入适量DMEM培养基用巴氏管轻轻吹打，将底层的星形胶质细胞吹散制成悬液状，200目钢网过滤，1000 r/min离心5min，去上清液，以彻底清除胰酶混合物，最后用DMEM重新悬浮细胞制成细胞悬液。将制备的细胞悬液密度调整至5×104—10×104个/mL，在37℃下预温5min后，加入0.5mmol/L的Fura-2/AM，使其终浓度为5 mol/L，于37℃水浴中孵育45min，离心，用Hank’s液洗两次，最后用Hank’s液悬浮细胞，并将细胞密度调整为1×105个/mL左右。测定前细胞预先于37℃复温3min。取2 mL细胞悬液于石英比色杯中，用PE LS-50B 荧光分光光度计测定，激发光栅10nm，发射光栅10n m，发射光波长500n m。先在300—400n m扫描，确定最大激发波长在340nm处后，用340/380nm 双波长交替测定荧光比值，待稳定后，先测定细胞静息期的荧光强度，溶剂对照组加10μL DMSO，实验组加入Bay k8644或nimodipine作用5 min后的荧光强度，然后再加入0.1% Triton-X-100测定最大荧光（R max）和10m mol/L EGTA测定最小荧光（R min），按公式计算细胞内游离钙浓度。计算细胞内钙离子浓度的公式为： [Ca2+]i=Kd×[(R－R min)/(R max－R)]×(Fa2/Fb2) 其中Kd为Fura-2-Ca2+的解离常数，37℃时为224 nmol/L，Fa2和Fb2分别为零钙和饱和钙条件下380 nm激发光产生的荧光强度，R为需测定的340/380 nm荧光比值，R max和R min分别为饱和钙和零钙时340/380n m激发光产生的荧光比值，Ca2+浓度的单位为nmol/L(Wu & Zhang, 1998)。此外，部分nimodipine组细胞悬液在加入Triton-X-100和EGTA前先加入40mmol/L的KCl，以观察nimodpine对钙激动剂的拮抗作用。
1.8 测试试剂浓度
加入的nimodipine终浓度分别为0.1、0.01和0.001 mmol/L，Bay-k8644终浓度分别为0.01、0.001和0.0001 mmol/L。
1.9 结果分析
统计方法采用双尾t检验，*P＜0.05为具有显著性差异。
2 结 果
2.1 免疫组织化学鉴定结果
培养的小鼠星形胶质细胞经过传代纯化后，以GFAP试剂盒进行免疫组化染色，发现GFAP染色阳性细胞达95%以上。图1为染色后的星形胶质细胞图片。图中染成棕黄色的细胞即为星形胶质细胞。
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2.2 激光共聚焦测定结果
Bay k8644在0.0001、0.001和0.01 m mol/L 浓度下均可增加培养的小鼠星形胶质细胞胞内钙荧光强度，并呈剂量依赖性（图2 A ）。图3 A 示加入Bay k8644 0.001 m mol/L 后，各时间点的星形胶质细胞胞内钙荧光强度动态变化图片，实际上加入Bay k8644（0.001 mmol/L ）10 s 后，即可以观察到同一视野内星形胶质细胞钙荧光强度明显增强。加入Bay k8644后20 s ，胞内钙浓度达到峰值，50 s 时，胞内钙荧光值下降，但仍显著高于溶剂对照组，加入后80 s 时，0.001和0.01 m mol/L 组的胞内钙荧光值恢复到溶剂对照组水平。加入Bay k8644 0.01 mmol/L 后，在细胞外可发现荧光颗粒，可能是胞内钙超载导致细胞破膜，钙离子外流所致。
Nimodipine 在0.001、0.01 和0.1 mmol/L 浓度下降低钙荧光强度，并且呈剂量依赖性（图2 B ）。图3 B 示加入nimodipine 后，星形胶质细胞胞内钙荧光强度的动态变化照片。加入各浓度
nimodipine
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20 s 后，钙荧光值明显降低，作用60 s 后荧光值降至最低，直至扫描结束仍未恢复基线水平。
空白对照组和溶剂对照组的胞内钙荧光强度在扫描过程中均无显著变化，两组之间也无显著差异。
2.3 荧光分光光度计测定结果
Bay k8644在0.0001、0.001和0.01 mmol/L 浓度显著增加星形胶质细胞胞内游离钙浓度（图 4 A ）。Nimodipine 在0.01 mmol/L 浓度显著降低星形胶质细胞内游离钙，在0.1 m mol/L 浓度时，因为药物本身黄色的严重干扰，此数据未列入（图4 B ）。0.001 和0.01 mmol/L 的nimodipine 可降低40 mmol/L KCl 产生的升钙作用（图5）。
空白对照组和溶剂对照组的胞内钙浓度两组之间无显著差异。
3 讨 论
由本研究中激光共聚焦钙成像和荧光分光光度计测定小鼠星形胶质细胞内钙浓度的实验结果表明，星形胶质细胞空白对照组和溶剂对照组之间，在钙成像荧光扫描的各时间点，其钙荧光值均无显著改变。说明实验中培养的星形胶质细胞的活性保持良好，本实验中DMSO 溶剂在0.5%浓度下对细胞的活性和胞内钙离子浓度没有影响。 已有报道（Yamamoto et al ，1984），DHPs 类激动剂Bay k8644可与L-型Ca 2+通道上的双氢吡啶受体结合，促进Ca 2+的内流。电生理学研究亦证实，
所有已知Ca 2+激动剂均能增加电压依赖型Ca 2+通道的Ca 2+内流，以延长动作电位的持续时间。Bay K8644延长L-型钙通道的开放时程，增加通道开放频率，使钙离子内流增加，引起神经元胞内钙离子浓度升高(Griffith et al, 1994)。而DHPs 类Ca 2+拮抗剂可以使L-型钙通道的长时程开放相改变为成簇的短时程开放相，即从第二开放方式（长时程）改变为主要为第一开放方式（短时程）。Nimodipine 通过这一机制使钙离子进入钙通道的速率减弱，而通道的电导不受影响，从而使神经元的胞内钙离子浓度降低 (Langley & Sorkin, 1989)。
本研究采用激光共聚焦和荧光分光光度计两种方法得到的结果一致表明，Bay k8644和nimodipine 对纯化的星形胶质细胞胞内游离钙浓度的影响与对培养的神经元的作用相同。即Bay k8644（0.001和0.01 m mol/L ）可导致培养的小鼠星形胶质细胞胞内钙显著增高；而nimodipine （0.01 mmol/L ）则使培养的小鼠星形胶质细胞胞内钙显著降低。MacVicar & Tse(1988)在培养的星形胶质细胞上以双微电极电压钳技术记录到了和神经元上L-型电流非常相似的钙电流，提示Bay k8644和nimodipine 通过作用于星形胶质细胞上的L-型钙通道改变其胞内钙水平。
MacVicar et al (1991)使用经典钙成像技术证明，用50 mmol/L 的KCl 导致培养了4—6周的啮齿类胚胎星形胶质细胞胞内钙离子浓度产生一个幅度为300—400 n mol/L 的增加。其被KCl 触发的
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胞内钙离子浓度的升高，可以被nifedipine抑制，并能被Bay k8644显著增强。此外有报道指出，在培养的大鼠皮层星形胶质细胞上，25—100mmol/L 的KCl会引起 [Ca2+]i大幅度增加，这种增加可以被nimodipine抑制(Fatatis & Russell, 1992)。本研究使用荧光分光光度计技术亦发现，nimodipine在0.001 mmol/L和0.01 mmol/L浓度时可以显著降低KCl造成的小鼠星形胶质细胞胞内钙离子浓度的升高。KCl引起的钙离子的内流亦是通过L-型钙通道实现的，进一步证明在星形胶质细胞上存在L-型钙通道。
迄今为止，尚未见有Bay k8644和nimodipine 对神经元钙通道作用时间的动态观察报道。本研究观察到，Bay k8644使星形胶质细胞的胞内游离钙浓度迅速升高，作用20 s时达到峰值，然后逐渐下降，80s时基本恢复到加入试剂前的基础值。而nimodipine在加入后50s才达到峰值，但持续作用时间较长，在加入试剂后80s，胞内游离钙浓度仍显著低于对照组。Bay k8644和nimodipine 对星形胶质细胞钙通道作用时间上的差异，可能与其作用靶点不同有关，此外还可能与它们对作用位点的亲和力、结合速率和解离速率不同有关，有待进一步研究。
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星形胶质细胞在脑缺血中的双重作用
星形胶质细胞在脑缺血中的双重作用 2013-03-29 18:09 来源：国际脑血管病杂志 作者：吴政政等 脑缺血可诱发从细胞能量耗竭到细胞死亡的一系列级联事件，包括兴奋性氨基酸过度释放、自由基形成、炎症反应等。以往研究多局限于脑缺血对神经元的损伤，但由于人大脑中的星形胶质细胞数量是神经元的数倍，因此，在脑缺血后保护与维持星形胶质细胞功能同样重要。目前，由神经元、胶质细胞和毛细血管构成的“神经血管单元”（neurovascularunit，NVU）日益得到认可和关注，其在包括缺血性卒中在内的多种神经系统疾病中发挥重要作用。缺血性卒中的治疗策略应致力于挽救整个NVU的功能，而星形胶质细胞正是NVU的重要组成部分。大量证据表明，星形胶质细胞在脑缺血中具有多方面的复杂作用，一方面可促进神经元存活，另一方面也可加重缺血性损伤。现对星形胶质细胞在脑缺血中的保护与损害作用做一综述，探讨其调控机制，旨在为缺血性卒中的治疗提供新的思路。 1 星形胶质细胞的生物学特性 星形胶质细胞是胶质细胞的一类，其数量为神经元的5倍，是整个中枢神经系统（central nervous system，CNS）的主要组成部分之一，在CNS的生理和病理学中发挥着关键作用。星形胶质细胞终足同时包绕着血管壁和神经突触，参与调控细胞代谢、血流、离子平衡、神经递质水平、神经传输和突触可塑性以及血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）。星形胶质细胞和神经元通过缝隙连接相互作用，对神经元的存活至关重要。神经元、胶质细胞和毛细血管构成的NVU在缺血性卒中的病程进展中具有重要作用，其中，星形胶质细胞作为NVU 的重要成分，一方面伸出大量终足参与BBB，另一方面参与形成神经元突触，被看作是继突触前和突触后成分之后的突触第三成分。脑缺血时，由于缺血核心区葡萄糖和氧供应完全终止，致使包括神经元和星形胶质细胞在内的所有神经细胞发生不可逆性损伤。但是，缺血半暗带内的葡萄糖和氧供应尚部分维持，使星形胶质细胞可存活较长时间。利用氧一葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型进行的研究显示，星形胶质细胞对OGD 的耐受性好于神经元；进一步的研究表明，星形胶质细胞在OGD时能利用糖酵解产生ATP 供能，从而发挥神经保护作用。然而，缺血性卒中时由于持续和严重的缺氧缺糖，星形胶质细胞的调控功能受损，严重影响着脑组织功能，如谷氨酸动态平衡、水平衡、BBB稳定、脑血流量调节、细胞外离子平衡、神经保护因子分泌等。 2 脑缺血与星形胶质细胞的活化 CNS发生的多种病理学变化，如卒中、外伤、肿瘤、变性性疾病等，均会导致星形胶质细胞活化。这种活化具有特征性的结构和功能变化，然而具体过程尚不清楚。星形胶质细胞是CNS的重要组成部分，在脑缺血时，缺血程度、血脑屏障破坏、炎症反应、代谢失衡、细胞兴奋毒性以及氧化应激均会影响星形胶质细胞活化程度。 虽然普遍认为星形胶质细胞活化是CNS疾病的病理学标志，但对星形胶质细胞活化的定义却并未能达成共识。目前认为，星形胶质细胞活化包括4个特征：（1）由任何形式及程度的CNS损伤和病变引起的一系列分子、细胞和功能水平的变化；（2）随着损伤程度的加重，其分子表达进行性变化，细胞进行性肥大，严重时发生细胞增生和癍痕形成；（3）其变化
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代 、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方 案 经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1.实验材料与试剂 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% 养瓶、CO 2 Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等 试剂配比： (1)DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)? (2)DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S? (3)SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS （DMEM/F12无血清培养基+生长因子） 25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长
因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)?Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37oC Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech) 2.实验步骤 2.1星形胶质细胞的混合培养
原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞定向分化的比较研究_曾琳
文章编号:1009-4237(2007)02-0160-03 论 著 原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞 定向分化的比较研究 曾 琳,李 民,刘 媛,龙在云,李书林,伍亚民 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042)摘要: 目的 探讨原浆型星形胶质细胞(pro t op l as m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fi brous astrocy t e ,FA S )对神经干细胞(neura l ste m ce ll ,N SC )定向分化的调控作用。方法 将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-D ia m i dino -2-phenyindo l e ,dilac t a t e ,DAP I )标记的NSC 分别与PAS 、FAS 共培养,10天后免疫组化法对分化神经元进行鉴定,显微镜下随机选取20个视野,每次计数100个细胞,计算NSC 分化为神经元的比 例。结果 N SC 与PA S 共培养后分化成的神经元比例较高,与胶质细胞的比例约为61%:39%;FA S 与N SC 共培养后分化神经元数量相对较少,以胶质细胞居多,其比例约为41%∶59%。结论 PA S 与FA S 相比更能促进NSC 向神经元分化。 关键词:星形胶质细胞;神经干细胞;分化 中图分类号:R 338 文献标识码:A Stud ies on regulatory effects of t he protoplas m ic and fi b rous astrocytes to the d irectional differentiation of neura l st e m cell Z ENG lin ,LI M in ,L I U Y uan ,et al . (S tate K ey L aboratory of T rau m a ,Bu rns and Co m bined In j ury ,D epa rt m entN o.3,Institute of Su rgery R esearch , Daping H ospit a l ,ThirdM ilitary M ed ica l Un i ve rsit y ,Chongqi ng 400042,Chi na )Ab stract : O b jective To study t he regula t o ry eff ec t o f pro toplas m ic astrocy te (PAS )and fibrous astrocy t e (FAS )on differentiation of neural ste m ce ll (N SC ).M ethod s I mmunohist o che m isty w it h DA P I wa s taken to cal -cu l a t e the proporti on of neurons w it h i n 100cells by 20fie l ds of v isi on chosen random ly fo r 10days .The da t a w ere analyzed in statistics by co -cu lt u re of N SC w it h PAS and FAS respec tiv l y .Resu lts The percentage of neurons in PA S group (61%)w asm uch m ore t han t hat of FA S g roup (41%).Con clusion The result sugge sted t ha tPA S w as m ore eff ec tive t o induce NSC diff e renti a ting into neuron in vitro . K ey word s :astrocy t e ;neu ra l st em cell ;d iffe rentia tion 基金项目:国家自然科学基金(30300364) 重庆市院士基金(7671) 收稿日期:2006-08-06;修回日期:2006-11-03通讯作者:伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科 研究所三室,重庆 400042) 星形胶质细胞(astrocyte ,AS )能分泌多种细胞因子[1-3] ,调控神经干细胞(neura l ste m ce ll ,NSC )分 化,而原浆型(protoplas m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocy t e ,FAS )又存在一定的 功能差异[4] ,对NSC 分化可能产生不同的作用。为此,本实验探讨以上两种AS 对NSC 向神经元分化的不同作用,从而为细胞联合移植治疗脊髓损伤奠定基础。 材料与方法1 实验动物 孕13～14天的大鼠和新生2天的大鼠。2 试剂与材料 胎牛血清(FBS ,H yclone ),2mm o l /L L -谷氨酰胺 (Sig m a ),0.6%葡萄糖,DME M /F 12培养基(H y -clone ),多聚赖氨酸,0.25%胰蛋白酶(S i g m a ),10mm o l /L L -l e uc i n e -m e t h y l -este r (S ig m a ),0.15mm o l / L E DT A ,H anks 液(自备),兔抗大鼠GF AP (Sig -m a ),小鼠抗大鼠NF -200(S i g m a ),羊抗兔TRI TC 、羊抗小鼠TR I TC 、0.4%Triton -X -100、甲醇、30%H 2O 2、0.01M PBS (北京中山公司)。3 实验方法 3.1 PAS 和FAS 的纯化培养参见Raff 等[4] 的培养方法。 3.2 PAS 和FAS 的鉴定 将上述细胞固定后,用0.5%H 2O 2/纯甲醇灭活内源性过氧化物酶,0.4%Trit o n -X -100处理,滴加正常山羊血清封闭,加入 GFAP 抗体37℃孵育2小时,用羊抗兔TRI TC Ig G 荧光抗体显色后DPX 封片,激光共聚焦显微镜观察,激发波长为543nm ,呈红色。 3.3 NSC 的培养和鉴定 参见本单位刘媛等建立的方法 [5] 。
星形胶质细胞
星形胶质细胞 *导读：星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。…… 星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。细胞突起的末端常膨大形成脚板(footplate)或称终足(endfoot)，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上(图1-2)，因 此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜(glia limitans)。在用尼氏法等一般染色组织切片中，星形胶质细胞的核比其他胶质细胞的核大，呈圆形或卵圆形，常染色质多，异染色质少而分散，故染色浅，核仁不明显。胞质中没有尼氏体，但具有一般的细胞器。胞质中含有大量交错排列的原纤维，伸人到胞突中并与胞突平行行走，是构成细胞骨架的主要成分。原纤维的超微结构是一种中间丝，称为胶质丝(glial filament)，其直径介于微管(25μm)和微丝(6μm)之间，由相对分子质量为47000—50000的蛋白质组成，此类蛋白质被称作为胶原原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)。利用细胞免疫法证明GFAP 仅存在于星形胶质细胞的胞体中，因此可利用GFAP的特异性抗
体来检测星形胶质细胞。 根据胶质丝的含量以及胞突的形状可将星形胶质细胞分为两种：纤维性星形胶质细胞(fibrous astrocyte)多分布在脑脊髓的皮质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝，又称蜘蛛细胞(spider cell);原浆性星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte)，多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。胞质内胶质丝较少，又称苔状细胞(mossycell)。电镜下星形胶质细胞的胞核有缺刻， 胞质较清亮，游离核糖核蛋白体和粗面内质网均很少，糖原颗粒丰富，有大量的胶质丝。纤维形星形胶质细胞的突起呈长圆柱形，而原浆性星形胶质细胞的突起呈薄片状，并常包裹着神经细胞及其突触(不伸人突触间隙)。星形胶质细胞的脚板与血管内皮细胞之间相隔一层基板，脚板质膜与基板接触处有半桥粒结构。 相邻星形细胞之间以及相邻脚板之间有缝隙连接。星形胶质细胞之间的细胞间隙狭窄，仅约3nm，内含组织液。缝隙连接又称缝管连接或接合膜(nexus)，是由大量连接小体(connexon)有规律 地成平板状排列的连接。每个连接小体又由6个亚单位镶嵌蛋白组成，这种蛋白被称为连接蛋白或接合素(connexin)。连接小体的中央有一中央小管(centralcanaliculum)通连相邻细胞。星形胶质细胞之间的缝隙连接主要由接合素43(CX43)构成。而少突 胶质细胞的缝隙连接由CX32构成。 星形胶质细胞比脑内其他任何类型的细胞具有更广泛的缝隙连接，由此使得星形胶质细胞类似于合胞体样结构。这种缝隙连接
胶质母细胞瘤与星型胶质细胞
胶质母细胞瘤与星型胶质细胞 一、胶质母细胞瘤 1、概述：胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤。肿瘤位于皮质下，多数生长于幕上大脑半球各处。呈浸润性生长，常侵犯几个脑叶，并侵犯深部结构，还可经胼胝体波及对侧大脑半球。发生部位以额叶最多见。 2.CT扫描 肿瘤呈边界不清的混合密度病灶，其中多有瘤内出血所致高密度表现，但钙化者较少。瘤内坏死及囊性变呈低密度影，而使其形态呈多形性，病灶周围多数脑水肿较重，肿瘤与脑组织无明显边界。脑室常被压迫变小、变形或封闭，中线结构常向对侧移位。增强后的部分肿瘤呈不均匀强化，常表现为中央低密度的坏死或囊变区周边增生血管区不规则的环形、岛形或螺旋形强化影。 3.MRI检查 肿瘤在T1加权像上呈低信号，T2加权像为高信号的边界不清的肿瘤影，与邻近脑组织不容易区分，占位效应十分明显。肿瘤内若有较大的坏死区则呈更低信号，若有出血呈高信号。胼胝体常受累，中线结构，如纵裂池可变形、变窄或移位。肿瘤在T2加权像呈混杂信号，以高信号为主。注射Gd-DTPA后肿瘤十分显著的对比增强使得肿瘤与邻近结构有明确的分界，且好发在脑深部，是特征性表现。 二、星型胶质细胞 1、概述：星形胶质细胞瘤（astrocytome）是最常见的胶质瘤，约
占颅内肿瘤的30%，占胶质瘤的78%以上，男性较多见，高峰发病年龄为30-40岁。肿瘤部位以大脑额叶和颞叶最多见。研究表明，该肿瘤中原癌基因C-sis有过度表达 2、病理变化： 肉眼观察：肿瘤大小可为数厘米大的结节至巨大肿块不等，一般境界不清，在肿瘤组织出现坏死出血时，似与周边组织境界分明，但边界外仍有瘤组织浸润。瘤体灰白色，质地视瘤内胶质纤维多少而异，或硬、或软、或呈胶冻状外观，并可形成大小不等的囊腔。由于肿瘤的生长，占位和邻近脑组织的肿胀，脑的原有结构因受挤压而扭曲变形。 3、组织分型 星形细胞瘤预后较好，按瘤细胞形态又分为纤维型、原浆型、肥胖型和混合细胞型等亚型。其中以纤维型星形细胞瘤（fibrillary astrocytome）最常见，瘤细胞分化好，但呈浸润性生长，瘤细胞之间可见红染的原纤维性背景。原浆型星形细胞瘤（protoplasmic astrocytoma）较少见，瘤细胞体积小，形态较一致，胞突少而短。肥胖细胞型星形细胞瘤（gemistocytic astrocytoma）瘤细胞体积较大，胞浆丰富，半透明，核偏位。电镜下在瘤细胞胞浆中可见成束排列的中间丝。星形细胞瘤胞浆均表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、S-100蛋白和波形蛋白（Vimentin）。 间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma）预后较差，光镜
星形胶质细胞在调节突触可塑性中的作用
星形胶质细胞在调节突触可塑性中的作用 【摘要】突触传递的可塑性被认为是学习和记忆的神经生物学基础，其取决于不同的神经元突触前和突触后机制。然而，最近有越来越多的研究涉及可塑性的第三个要素——突触周围的胶质细胞。传统观念一直认为星形胶质细胞(astrocyte，AS)仅是被动的辅助角色, 起支持和营养等作用。近年的研究发现，无论在中枢还是外周神经系统，星形胶质细胞都主动参与了信息的传递与整合，并通过其释放的神经胶质递质等直接影响突触的可塑性。本文结合近年来的研究结果，对AS在突触可塑性中的研究进展作一综述。 【关键词】AS；突触可塑性；神经递质；突触传递 在由神经元和胶质细胞构成的神经系统中，胶质细胞数量占90%，其中星形胶质细胞(astrocyte，AS)是体积最大，也是分布最为广泛的胶质细胞。过去认为AS主要是对神经元起支持和营养作用。然而，近年来越来越多的证据表明AS 在维持神经系统的正常生理活动、脑的发育和神经病理等过程中发挥着重要作用［1］。突触是神经元之间信息传递过程中的重要结构。最新观点认为，AS与突触前和突触后神经元共同构成三重突触(tripartite synapses)结构，参与信号的传导和整合［2］。 1 突触可塑性 突触可塑性是指突触在一定时期，一定条件下突触数目、结构和功能的改变，既包括突触传递效能的变化，又包括突触形态结构以及亚微结构的变化，来调节神经传导和神经分泌等［3］。 根据作用时间，突触可塑性可分为短时效的和长时效的。根据接收条件刺激的突触前纤维与传递效应改变的突触之间的对应关系，可分为同突触型，即条件刺激和可塑性改变发生在同一条突触通路上；和异突触型，指条件刺激作用于传入神经，而可塑性改变发生在没有接受刺激的突触通路上［4］。 2 AS与突触可塑性 AS与突触前、后神经元的位置关系密切，在神经系统内与突触结构紧密相连。早在1997年，Barres等［5］就报道，胶质细胞可以促进突触间的联系。与胶质细胞共同生长的神经元突触的活跃程度是独自生长的神经元突触的10 倍。后来，Barres 实验室又发现，去除视网膜神经节细胞(RGCs)中的AS后，电生理记录反映突触的活性很小；将AS加入后, 即使没有与胶质细胞接触, 神经元对多种刺激的反应程度也比那些独自生长的高出7倍, 且很少出现突触传递障碍。为解释上述现象,Mauch等［6］使用层析、2 d电泳和质谱分析等方法进行了细致的研究。结果表明，AS在突触囊泡的释放和再循环过程中也有重要作用。AS 释放的载脂蛋白/ 胆固醇被神经元内吞入胞内, 使RGCs的自身突触(autapse) 数目增加了8倍, 量子含量(quantal content)增加了10倍。近年来，使用细胞培
星形胶质细胞
目录一、星形胶质细胞的生物学特性 (一) 星形胶质细胞的异质性 (二) 胶质网络二、星形胶质细胞的功能 (一)分泌功能 (二)星形胶质细胞与神经的发育及再生 (三)星形胶质细胞具有对神经元微环境调控的能力 (四)免疫功能与血脑屏障调控三、星形胶质细胞功能的新近进展 (一)星形胶质细胞也具有可兴奋性 (二)星形胶质细胞与神经元的通讯或对话 (三)在突触形成和突触可塑性中的作用 (四)星形胶质细胞与神经发生胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体,约占中枢神经系统(CNS)细胞总数的90%,星形胶质细胞(astrocyte)是其中主要的组成成分 目的从新生鼠皮层中分离、培养并鉴定原浆型星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte,PAS)和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocyte,FAS).方法新生大鼠皮层分离的混合星形胶质细胞,经差速振荡法得到纯化的PAS和FAS;用免疫组化法分别对两种细胞进行鉴定.结果观察到两种细胞均特异性的标记为阳性.PAS外观扁平似圆盘状,细胞体 较大,突起宽而扁,分支少,均匀排列生长;FAS细胞体较小,呈圆形、卵圆形或多角形,突起较多,细长并有分支,呈交错生长.结论采用差速振荡法体外纯化培养两种AS,方法可行、有效,同时纯度达95%以上. 脑星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)内在数目占绝对优势的一类大胶质细胞,被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用.本文主要就参与星形胶质细胞调节神经元活动的主要功能分子,星形胶质细胞在中枢神经系统的生物学功能,及其与疾病的关系作一简要回顾. 目的观察星形胶质细胞(AST)分泌雌激素的规律,研究AST对大脑皮层神经元突触形成的影响及可能的分子机制.方法取新生大鼠大脑皮层进行AST原代及传代培养,分别于传代培养的第0 d、7 d、14 d、21 d进行细胞计数,同时用ELISA方法测定AST条件培养液(ACM)中雌二醇(E2)的浓度.以新生大鼠皮层神经元纯培养为模型,实验分成6组:神经元纯培养 组;ACM培养组;AST和神经元混合培养组;雌激素培养 组;ACM+Tamoxifen(雌激素受体阻断剂)培养组;Tamoxifen培养组.应用 免疫荧光技术和突触计数方法观察各组突触形成数量的差别.结果AST数量分别为1×104/ml、1.1×106/ml、1.4×106/ml、1.5×106/mi;ACM中雌二醇浓度分别为(ng/L):0、117±22、266±22、252±27.第0 d培养液中未检测出雌二醇,随着培养时间的延长雌激素浓度迅速增加,14 d左右达高峰,以后逐渐降低,但21 d时培养液中雌二醇仍保持较高浓度.各实验组突触荧光颗粒数分别为(个/细胞,培养第9 d):14±3;79±5;83±8;80±6;32±3;29±3.显示ACM能增加培养神经元突触形成的数目近6倍,外源性雌激素可基本模拟ACM的效应.Tamoxifen 能阻断ACM促突触形成效应的75%左右.结论体外培养新生大鼠大脑皮层AST能合成并分泌雌激素,分泌的雌激素可能参与了胶质细胞调节神经元突触形成的过程,而胶质源性的雌激素可能通过雌激素受体发挥促突触形成的作用. 星形胶质细胞(AS)是神经系统的重要组成部分,目前认为AS是构成突触结构的第三种成分.AS对突触的数量、形态结构、成熟过程以及突触传递都有影响.AS能够以多种方式和神经元相互作用,如通过谷氨酸-谷氨酰 胺循环、细胞内Ca2+浓度的改变等环节影响神经元的生物活性,进而发挥对神经突触可塑性的影响.最新研究表明,AS亦能够通过分泌多种介质,
小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立
万方数据
１８４ 物中心提供；ＤＭＥＭ干粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐ－ｓｉｎ）、青霉素一链霉素均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｄ—Ｈａｎｋｇ液为实验室自配；ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＧＦＡＰ单克隆抗体及ＣＹ５Ａｎｔｉ．Ｍｏｕｓｅ荧光二抗购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；Ｈｏｅｃｈｓｔ为Ｓｉｇｍａ公司产品。 ２．原代培养①取１—３ｄ的新生ＩＣＲ小鼠，将其断头处死，在无菌条件下由腹侧取出脊髓，置盛有Ｄ—Ｈａｎｋｇ液的小皿中，在解剖显微镜下剔除脊膜，随后换到另一干净的小皿中。②在小皿内剪碎脊髓，大小为１×１×１，再将其移人尖底离心管中，加２～３倍体积的０．２５％胰蛋白酶，在３７℃下消化１５ｍｉｎ，加入等体积的含血清培养基（不含抗生素）终止消化；轻吹２０次左右，静置片刻，将上清吸人另一离心管中，原离心管中加入１ｍｌＤ—Ｈａｎｋｇ轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中，在原离心管中加入ｌ～２ｍｌ的０．２５％胰蛋白酶再次消化１５ｍｉｎ，终止后连同上次消化的上清液一起１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，再加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，机械吹打使细胞分散，制成单细胞悬液。③血细胞计数板计数后调整密度到ｌ×１０５接种于无底物黏附的２５ｃｍ２玻璃培养瓶，在３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养。④每天倒置显微镜下对细胞进行观察，接种２４～４８ｈ后细胞第一次换液，以后每周换液两次。 ３．星形胶质细胞的纯化细胞培养７～１０ｄ待细胞分层生长后，置于３７。Ｃ摇床中２００ｒ／ｍｉｎ振荡６ｈ，弃含脱落细胞的细胞悬液，Ｄ－Ｈａｎｋｇ液洗３次，加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，放入３７℃，５％ＣＯ：培养箱中继续培养。为提高星形胶质细胞的纯度，可在传代后约５—７ｄ细胞融合时，再次放人摇床中振荡，重复上述操作。 ４．传代培养①取已培养１５ｄ左右的原代培养物，吸去旧培养基，用Ｄ—Ｈａｎｋ童液洗２次，然后滴加 ４００１ｚｌ０．１２５％胰酶一ＥＤＴＡ，倒置显微镜下观察，待细胞回缩，细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消 化，并轻轻左右摇动培养瓶，随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液，分别接种于另两个２５ｃｍ２的培养瓶，在３７℃，５％Ｃ０２条件下培养。②每天进行倒置显微镜下观察，根据细胞的生长情况及液体颜色改变加补液体或换液。 ５．星形胶质细胞的鉴定取第三代培养物接种于 六孔板内，２４ｈ后待细胞恢复后取出，吸去培养液，用ＰＢ快速洗两次，每孔分别加入少许４％多聚甲醛，室温下固定３０ｍｉｎ，去除固定液，用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗三遍，以含１０％马血清的０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ液在３７℃条件下封闭２０ｍｉｎ。加鼠抗ＧＦＡＰ的一抗（１：５００），放入４。Ｃ冰箱过夜，次日用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ清洗三遍后同时加入ＣＹ５标记的抗小鼠二抗（１：１００）和Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：４００），避光放人３７。Ｃ水浴孵箱ｌｈ，再用０．０１ｍｏＬ／ＬＰＢＳ洗三遍后晾干，用抗荧光衰减的封片剂封片，Ｏ．１ｙｍｐｕｓＦＶｌ０００激光共聚焦显微镜下观察。 结果 倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况良好。分离的小鼠脊髓细胞在培养（种植）４ｈ后，部分细胞即可长出细小的胞突；３６ｈ后，所有细胞均已贴壁，光晕明显，并长出突起，培养４—５ｄ后，细胞数量增多，约ｌＯｄ左右细胞达到８０—９０％会合，可进行摇床纯化。随着培养时间的延长，培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。 传代后细胞生长更活跃，培养５～７ｄ便可长满瓶壁，星形胶质细胞的比例增多，形态结构更加突出。相差显微镜下形态学特征：胞体较大而扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有１—２个核仁，星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长，呈放射状（图１，２），经ＧＦＡＰ特异性抗体的免疫荧光染色证实９８％为星形胶质细胞（图３）。 圈１．２倒置显微镜下传代培养８ｄ的胶质细胞（×１００，ｘ２００） 图３ｇ玳ｄｇ，养星形胶质细胞ｘ１０（激光共聚焦显微镜图象ｂａｒ＝４０ｔｔｍ）ｇＧＦＡＰ免疫荧光染色ｂＨｏ∞ｈｓｌ染色ｃ Ｃ，ＦＡＰ和Ｈｏｅｅｈｓｔ共定位图象 万方数据
炎症因子诱导星形胶质细胞凋亡及机制探讨_刘杰波
[收稿日期]2002-09-10;[修回日期]2003-04-30 [作者简介]刘杰波(1968-),男,博士,主治医师。主攻方向:小儿神经系统疾病。[通讯作者]刘杰波,深圳市罗湖区人民医院儿科,邮编:518000。#论著# 炎症因子诱导星形胶质细胞凋亡及机制探讨 刘杰波 (深圳市罗湖区人民医院儿科,广东深圳518000) [摘要]目的探讨L PS,I L-1B,T N F-A所致星形胶质细胞(AC)凋亡的机制及途径。方法原代培养的新 生SD大鼠前脑AC分为正常对照组、炎症组(L PS+I L-1B+T N F-A)与预处理组(L-N M M A预处理30min后加入 L PS+T N F-A+I L-1B)。培养72h后,M T T测定AC活力;分光光度仪测定细胞培养上清中N O2-/N O3-含量;电 镜、流式细胞术检测细胞凋亡;Wester n Blot检测胞浆内细胞色素C的表达;原位杂交检测A C Caspase-3mRNA表 达。结果预处理组细胞活力明显高于炎症组(0.81?0.29vs0.46?0.15),差异有显著性(P<0.01)。炎症组 AC活力与其分泌的一氧化氮(NO)呈负相关(r=-0.604,P<0.05)。预处理组凋亡率[(15.2?7.9)%]低于炎 症组[(29.7?10.4)%],P<0.05。预处理组胞浆内细胞色素C的含量较炎症组明显减少(14784?2096vs 31049?3784),P<0.01。炎症组的Caspase-3mRNA表达强于预处理组。结论1L PS,I L-1B,T N F-A可导致细 胞活力下降。其细胞活力的下降与其分泌的NO增多有关。o增多的N O可导致AC凋亡;NO导致的A C凋亡可 能与细胞色素C凋亡途径有关。[中国当代儿科杂志,2003,5(4):339-342] [关键词]星形胶质细胞;凋亡;一氧化氮 [中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-8830(2003)04-0339-04 Mechanism of Cytokine-Induced Apoptosis of Astrocytes in Rats Jie-Bo LI U.Dep ar tment of Pediatr ics,L uohu District H osp ital of Shenz hen,S henz hen,G uangdong518000,China (Email:j ieboliu@https://www.360docs.net/doc/8d16218565.html,) Abstract:Objective T o study the mechanism of L PS,I L-1B and T NF-A-induced apoptosis of astro cytes in r ats. Methods T he astrocytes of the neonatal rat were cultur ed in vitr o and randomely assigned into the inflammation group (tr eated w ith L PS,IL-1B and T N F-A),pre-treatment group(L-NM M A was administr ated half an hour before treatment with L PS,IL-1B and T N F-A)and normal control group.T he cell viability was assayed by M T T;apoptosis was evaluated by electr on micr oscope and flow cytometry;nitric ox ide(N O)content was measured by spectrophotometer;cytochrome C co ntent in cy toplasm was measured by Western Blot and Caspase-3mRN A ex pression was detected by hybridization in situ.Results T he cell v iability in the pr e-tr eatment gr oup was significantly hig her than t hat of the inflammation group (0.81?0.29vs0.46?0.15),P<0.01.T here w as a neg at ive co rrelation between the cell v iability and NO content produced by astr ocytes in the inflammation g roup(r=-0.604,P<0.05).T he apoptosis rate of the pr e-treatment group was lower t han that of the inflammation g roup[(15.2?7.9)%vs(29.7?10.4)%;P<0.05].T he cytochrome C content in cytoplasm of astrocytes of the pre-treatment g roup(14784?2096)decreased compared wit h that of the inflammation group(31049?3784)(P<0.01).T he expression of Caspase-3mRNA in the inflammatio n group was intensified compared with that of the pr e-treatment group.C onclusions Cytokines may lead to decrease of viability of astrocytes through increasing N O content produced by astrocytes.T he incr ease of N O content can induce astrocyte apoptosis,w hich is related to the r elease of the cytochrome C from mitochondria to cell plasma,and activating the ex pression of Caspase-3mRNA.[C hin J Contemp Pediatr,2003,5(4):339-342] Key words:Astrocyte;A poptosi s;N itric ox ide 星形胶质细胞(astrocyte,AC)在中枢神经系统中占有非常重要的地位。它通过对各种神经生长因
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代南京军区总院神经内科实验室许丽丽 2012-12-01 一、试剂 1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2)DMEM（Invitrogen,11995-065） 3)FBS（Invitroge,10099-141） 4)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 5)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） 6)DPBS（HyClone，SH30028.01B） 7)dd H2O 8)75％酒精 二、器械 1)手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟， WA3050）、显微剪x1 2)100 ml小烧杯 3)200目不锈钢筛 4)细胞计数器（求精） 5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790） 6)25ml培养瓶（Corning，430639）或75ml培养瓶（Corning，430641） 7)100ml玻璃瓶（蜀牛） 8)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 9)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 10)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）
11)注射器：50ml、5ml各 1 12)Pipette and pipette tips 13)冰袋、手套、口罩
Day 1 1、消毒 1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。 1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 2、包被培养板 2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。 2.3 以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶：3ml； 75ml培养瓶：8ml。过夜。 3、配置培养基、消化酶 3.1 DMEM with 10% FBS FBS：DMEM=1：10 取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。 3.2 0.125％胰酶 取0.25％Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。 将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。 4、消毒 操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。 Day 2 1、消毒
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
胶质细胞原代培养及纯化 2.1原代胶质细胞培养 1）于细胞培养前1d，用0.05% PLL(or PLO)包被培养瓶，置5% CO2培养箱中6 h以上，使用前用HBSS液冲洗3次，备用； 2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中； 3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0. 25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7 min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀； 4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化； 5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多； 6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次； 7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块； 8）1000 r/min×5min，弃上清； 9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL； 10）接种24 h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片； 11）细胞每3 d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5 h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。一般使用17～30d内的星形胶质细胞。