在体生物光学成像技术的研究进展

第34卷第12期自动化学报Vol.34,No.12 2008年12月ACTA AUTOMATICA SINICA December,2008

在体生物光学成像技术的研究进展

李慧1,2戴汝为2

摘要在体生物发光成像和在体荧光成像是近年来新兴的在体生物光学成像技术,能够无损实时动态监测被标记细胞在活体小动物体内的活动及反应,在肿瘤检测、基因表达、蛋白质分子检测、药物受体定位、药物筛选和药物疗效评价等方面具有很大的应用潜力.本文详细介绍了在体生物发光成像和在体荧光成像的特点、系统及应用,比较了它们的异同,综述了在体生物光学成像技术的基本原理和应用领域,讨论了将其应用于临床的进一步发展方向.

关键词在体生物光学成像,生物发光成像,荧光成像

中图分类号R319

Development of In Vivo Optical Imaging

LI Hui1,2DAI Ru-Wei2

Abstract With the emergence of in vivo optical imaging,bioluminescence imaging and?uorescence imaging can be used to non-invasively monitor the activities and responses of cells marked with optical signals in real time,which are considered to be promising tools for tumor detection,gene expression pro?ling,protein molecular detection,drug receptor localization,drug screening,and therapeutic evaluation.In this paper,the features,imaging systems,and applications of in vivo bioluminescence imaging and in vivo?uorescence imaging have been introduced and compared in detail.The basic theories,application?elds,and development of in vivo optical imaging in future are reviewed.

Key words In vivo optical imaging,bioluminescence imaging(BLI),?uorescence imaging(FI)

随着荧光标记技术和光学成像技术的发展,在体生物光学成像(In vivo optical imaging)已经发展为一项崭新的分子、基因表达的分析检测技术,在生命科学、医学研究及药物研发等领域得到广泛应用,主要分为在体生物发光成像(Biolumi-nescence imaging,BLI)和在体荧光成像(Fluores-cence imaging)两种成像方式[1?2].在体生物发光成像采用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA,在体荧光成像则采用荧光报告基团,如绿色荧光蛋白(Green?uorescent protein,GFP)、红色荧光蛋白(Red?uorescent protein,RFP)等进行标记[3].利用灵敏的光学检测仪器,如电荷耦合摄像机(Charge coupled device camera,CCD camera),观测活体动物体内疾病的发生发展、肿瘤的生长及

收稿日期2007-08-08收修改稿日期2007-11-19

Received August8,2007;in revised form November19,2007国家自然科学基金(30500131),北京市优秀人才资助项目(20061D0501600216),中国博士后科学基金(20070410146)和中国科学院王宽诚博士后工作奖励基金资助

Supported by National Natural Science Foundation of China (30500131),Research Fund for Beijing Distinguished Specialists (20061D0501600216),Chinese Postdoctoral Science Foundation (20070410146),and Chinese Academy of Sciences K.C.Wong Postdoctoral Fellowships

1.首都师范大学教育技术系北京100048

2.中国科学院自动化研究所复杂系统与智能科学重点实验室北京100190

1.Department of Education Technology,Capital Normal Uni-versity,Beijing100048

2.Key Laboratory of Complex Sys-tems and Intelligence Science,Institute of Automation,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190

DOI:10.3724/SP.J.1004.2008.01449转移、基因的表达及反应等生物学过程,从而监测活体生物体内的细胞活动和基因行为[4?8].

相对于其他成像技术,如核磁共振成像(Mag-netic resonance imaging,MRI)、计算机层析成像(Computed tomography,CT)、超声成像(Ultra-sonic imaging)、正电子发射断层成像(Positron emission tomography,PET)、单光子发射断层成像(Single photon emission computed tomography, SPECT)等,在体生物光学成像具有巨大的优越性,堪称是分子基因检测领域的革命性技术.它具有如下优点:较高的时间/空间分辨率;在肿瘤和良性/正常疾患之间有高的软组织对比度;成像对比度直接与生物分子相关,适于重要疾病的基因表达、生理过程的在体成像;获得信息丰富、适于多参数复合测量;价格适中等.尽管其测量范围与测量深度有限,但适用于小动物的整体在体成像和在体基因表达成像.表1和表2(见下页)分别给出了几种主要成像技术的应用场合及参数比较[5,9],可以看出,基于分子光学标记的在体生物光学成像技术已经在活体动物体内基因表达规律方面展示了较大优势.近年来,随着生物光学成像设备的研制以及转基因动物的研究,国外发达国家已经将在体生物光学成像技术广泛应用于肿瘤免疫及治疗、基因治疗、药物研发等领域并取得了许多成果[4?8].

本文分别介绍了在体生物发光成像和在体荧光成像的特点、系统及主要应用,比较二者在分子探

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表1成像技术的主要应用

Table1Primary uses of di?erent imaging techniques

成像方法主要应用

核磁共振成像(MRI)表型、生理成像和细胞跟踪的最好的全方位成像系统等

计算机层析成像(CT)肺、骨癌成像等

超声成像血管和介入成像等

正电子发射断层成像(PET)分子代谢,如葡萄糖、胸腺嘧啶核苷等的成像等

单光子发射断层成像(SPECT)探针,如抗体、肽等的成像等

荧光反射成像(FRI)表面肿瘤分子事件的快速成像等

荧光介导分子层析成像(FMT)对深部肿瘤靶向标记或荧光染料标记进行定量成像等生物发光成像(BLI)基因表达、细胞追踪成像

生物发光断层成像(BLT)细胞、分子、基因水平的表达成像

表2常用成像技术的参数比较

Table2Parameters of imaging techniques

成像方法空间分辨率时间分辨率测量深度造影剂价格核磁共振成像(MRI)10～100m min/h无限制钆,镝和氧化铁离子$$$计算机层析成像(CT)50m min无限制碘$$超声成像50m min mm微型气泡$$正电子发射断层成像(PET)1～2mm min无限制18F,11C,15O$$$单光子发射断层成像(SPECT)1～2mm min无限制99mTc,111In（铟）$$荧光反射成像(FRI)1～2mm s/min<1cm荧光蛋白,近红外荧光染料$荧光介导分子层析成像(FMT)1～2mm s/min<10cm近红外荧光染料$$生物发光成像(BLI)mm min cm荧光素$$生物发光断层成像(BLT)mm min cm荧光素$$

表中:$表示价格<10万美元;$$表示价格在10～30万美元之间;$$$表示价格>30万美元

针、成像原理、光在生物组织中的传输模型和重建算法等方面的异同,综述了在体生物光学成像技术的基本原理和应用领域,讨论了将在体生物光学成像应用于临床的进一步发展方向.

1在体生物发光成像

1995年,Contag[3]首次在活体哺乳动物体内检测到含Lux操纵子(由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成)的病原菌,在不需要外源性底物的情况下,发出持续的可见光.1997年,他又观察到表达Fluc基因的转基因小鼠,注入底物荧光素(Luciferin)后,荧光素酶蛋白与荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应,将部分化学能转变为可见光能释放.由于这种生物发光现象只有在活细胞内才会发生,而且发光强度与标记细胞的数目成正比,因此已被广泛应用于在体生物光学成像的研究中.

荧光素酶的每个催化反应只产生一个光子,通常肉眼无法直接观察到,而且光子在强散射性的生物组织中传输时,将会发生吸收、散射、反射、透射等大量光学行为[10?11].因此,必须采用高灵敏度的光学检测仪器(如CCD camera)采集并定量检测生物体内所发射的光子数量,然后将其转换成图像.在体生物发光成像中的发光光谱范围通常为可见光到近红外光波段,哺乳动物体内血红蛋白主要吸收可见光,水和脂质主要吸收红外线,但对波长为590～1500nm的红光至近红外线吸收能力则较差.因此,大部分波长超过600nm的红光,经过散射、吸收后能够穿透哺乳动物组织,被生物体外的高灵敏光学检测仪器探测到,这是在体生物发光成像的理论基础.

根据成像方式的不同,在体生物发光成像主要有生物发光成像(Bioluminescent imaging,BLI)和生物发光断层成像(Bioluminescent tomography, BLT)两种.其中,BLI的输出是二维图像,即生物体外探测器上采集的光学信号.其原理简单、使用方便快捷,适用于定性分析及简单的定量计算,但无法获得生物体内发光光源的深度信息,难以实现光源的准确定位[11?12].目前,已有相应的产品问世,如精诺真(Xenogen)公司的IVIS成像系统等.而BLT 则利用多个生物体外探测器上采集的光学信号,根据断层成像的原理,采用特定的反演算法[13?15](如

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基于多层自适应有限元方法的BLT重建算法等),得到活体小动物体内发光光源的精确位置信息.目前,BLT的光源定位和生物组织光学特性参数的反演问题已经成为国内外在体生物光学成像研究的重点和难点之一,但还仅限于实验室研究阶段,没有达到临床实验的阶段,所以尚未有成熟的成像系统.典型的BLT原型系统是由美国University of Iowa 的Bioluminescence Tomography Laboratory开发的[16?18].

2在体荧光成像

从20世纪80年代后期开始,一些研究者尝试向生物体内注射外源性的荧光染料作为对比剂,通过非侵入性或内窥的光学测量手段,在肿瘤检测中区分病态和正常组织.1994年,Chal?e等[19]首次报道了绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的成功表达.此后,作为一种理想的活体标记分子,绿色荧光蛋白被迅速应用于各种生物学研究,特别是肿瘤学的研究[20].在体荧光成像主要以荧光报告基团(如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)作为标记物或对比剂,用特定波长的激发光激发荧光染料,使其吸收入射光产生能级跃迁,到达高能量状态,然后经过特定的时间衰减回基态,并发出波长长于入射光的发射光.与在体生物发光成像相似,红光在哺乳动物体内的穿透性比蓝绿光要强得多,因此在体荧光成像中通常选择红光为激发光,得到近红外波段的发射光.由于荧光蛋白本身对细胞无毒性,无种属、组织和位置特异性,不需要任何反应底物及其他辅助因子,且检测简单,因此在体荧光成像已广泛应用于肿瘤检测和脑功能成像的研究中.

根据成像方式的不同,在体荧光成像主要有荧光成像(Fluorescence imaging,FI)和荧光介导分子层析成像(Fluorescence molecular tomography, FMT)两种.其中,FI通常为平面或反射成像,生物体外探测器上采集的二维图像是从活体动物体表射出的荧光信号的总和,它可以快速、便捷、远距离、无损伤地获得小动物的整体在体成像.代表性产品为Xenogen的IVIS成像系统,可检测波长400～950nm的荧光.但成像深度往往受限(<5mm),难以获得来自深层组织的更加精细和定量的信号.随着对光和生物组织之间相互作用的研究,20世纪90年代后期出现了一种对生物组织光学特性参数(如吸收系数、散射系数等)进行成像的近红外光学散射断层成像技术,也称为荧光介导分子层析成像(FMT).它能够对组织内的荧光报告基团进行量化从而获得高清晰度图像,采用高灵敏度的体外探测器对被测物体进行多点测量和采集;然后,根据光子在强散射性生物组织中的迁移规律和光传播的数学模型,采用特定的反演算法,重建出生物组织内部的荧光光学特性(组织的光学特性参数、荧光寿命、聚集度、量子产额等)的分布图像.FMT 已在小动物模型上得到了有效验证[21?22],2002年Ntziachristos等[23]用FMT开展了小鼠体内组织蛋白酶B活性的影像研究.

随着生物学的发展,在体荧光成像尤其是近红外荧光成像能够实现分子水平的功能检测,在基因表达图谱、受体定位、蛋白质功能研究、细胞通路的解释和小分子蛋白之间相互作用的检测等生物技术方面发挥了重要作用.除此之外,与其他成像方式相比,近红外荧光成像还具有以下优点:探测系统简单,成本较低;无电离辐射,染料稳定,适合长期或频率高的监测;成像结果具有一定的定量性.在体荧光成像中,当荧光进入生物组织时,一部分被皮肤表面和生物体内各器官表面反射,另一部分则被生物组织吸收和散射.因此,荧光报告基团越深,到达荧光报告基团的激发光信号越少,产生的发射光也就越少.目前,克服组织内的吸收和散射是荧光报告基因的研究者所面临的最大挑战.

3在体生物发光成像与在体荧光成像的比较

3.1分子探针

在体生物发光成像和在体荧光成像的分子探针均为报告基因(Reporter gene).在体生物发光成像的分子探针主要为荧光素酶,分为两类:一类为Fire?y luciferase,底物为Luciferin,形成的产物为绿色;另一类为Renilla luciferase,底物为Coelen-terazine,形成的产物为蓝色.而在体荧光成像的分子探针主要为荧光蛋白,最常用的有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白.其中,绿色荧光蛋白是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,当受到紫外或蓝光激发时可自发地发射绿色荧光.因此,适合作为报告基因来研究基因表达、基因调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等.

在体生物发光成像中,采用荧光素酶光学信号标记细胞,其显著特点为:1)体内检测的高灵敏度;

2)极低的背景噪声,极高的信噪比;3)由于荧光素酶和底物的特异作用而发光,特异性极强;4)单位细胞的发光数量很稳定,分子标记物随目标细胞的繁衍而增多,因此外部信号与动物体内的目标细胞数成正比,不会随细胞群体数目的增多而降低信号,可用于精确定量.因此,在体生物发光成像已经成为研究活体动物体内成像的最为有效的工具[6,24?28].荧光素酶和绿色荧光蛋白的在体光学成像[29](见下页表3)表明:荧光素酶比绿色荧光蛋白更灵敏,但由于在体生物发光成像(BLI和BLT)前,需对小动

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表3荧光素酶和绿色荧光蛋白的在体光学成像比较

Table3Comparison of in vivo optical imaging based on luciferase and GFP

报告基因信噪比底物成像时间灵敏度特异性其他

GFP低无Milliseconds(200～300ms)低低无

Luciferase高Luciferin Minute(10min)高高需要与氧进行氧化反应产生光能

物注射荧光素酶底物,导致很难反复长时间成像,而且成像时间长,因此在不追求高灵敏度的情况下,可以选用在体荧光成像(FI和FMT).

与荧光素酶等报告基因相比,绿色荧光蛋白作为活体组织中的报道基因具有明显优势:1)细胞内绿色荧光蛋白的检测仅仅需要激发光的激发,不需要加入底物进行酶–底物反应;2)绿色荧光蛋白的表达与种属无关,无论细胞的种类和位置如何,都能在细胞内自主表达,无需其他外源的辅助因子;3)绿色荧光蛋白对细胞和组织是无毒的,不会扰乱细胞的正常生长和功能;4)绿色荧光蛋白能够克服穿透、毒素、光漂白等不利因素.因此,它是在活体细胞中基因表达、蛋白质定位和发育生物学研究的极其有用的工具.但当受到激发光激发时,生物体的皮肤、毛发和各种组织等会产生非特异性荧光,因此在体荧光成像具有较强的背景噪声,其信噪比远远低于生物发光.而且,激发光需要穿过生物组织到达靶点,发射光再经过吸收、散射等大量光学行为从生物体内透射出来,被体外探测器接收,路径较长,因此CCD探测到的信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、生物组织的光学特性参数(如吸收系数、散射系数)等多方面因素,使得荧光强度很难精确定量.

3.2成像原理及成像系统

在体生物发光成像(BLI和BLT)不需要外部光源激发,自发荧光少;而在体荧光成像(FI和FMT)需要特定波长的外部激发光源激发,自发荧光较多,故前者比后者灵敏度更高,两者的成像原理图如图1所示.

University of Iowa的Bioluminescence To-mography Laboratory开发的在体生物发光断层成像原型系统,主要由CCD相机、固定小动物的支架、控制装置(使支架水平运动、垂直运动或旋转)、完全密闭的不透光的成像暗箱等组成.将小动物麻醉后固定在支架上,并置于成像暗箱中,由控制装置带动支架沿水平方向运动、垂直方向运动或旋转,利用CCD相机从多个不同角度和位置对活体小动物的生物发光现象进行投影成像.然后将采集到的数据信息传输到计算机中,并采用特定的图像重建算法定位小动物体内的发光光源,得到活体动物体内发光光源的精确位置信息

.

(a)在体荧光成像(b)在体生物光学成像

(a)In vivo?uorescence(b)In vivo bioluminescence

imaging imaging

图1在体生物光学成像的原理图

Fig.1Schematics of in vivo optical imaging

Xenogen公司生产的IVIS成像系统是典型的在体荧光成像系统,主要由CCD相机、成像暗箱、激光器、激发和发射滤光片、恒温台、气体麻醉系统、数据采集的计算机、数据处理软件(Living imaging)等组成.将小动物放置到成像暗箱中,利用高性能的制冷CCD对活体小动物某个特定位置的发光进行投影成像,探测从小动物体内器官发射出的低水平荧光信号,然后将得到的投影图像与小动物的普通图像进行叠加,从而实现对小动物某个特定位置的生物荧光进行量化,并且可以重复进行.

由于在体荧光成像具有较强的背景噪声,因此如何采用不同的技术来尽量降低背景信号、获取准确的荧光信息、提高信噪比,就成为提高成像质量的关键.目前,常用的方法主要有多谱段成像(Multi-spectral imaging)技术和时域光学分子成像(Time domain optical imaging,TDOI)技术.多谱段成像技术通常用于信号出现叠加时分离微弱的靶信号,也用于多探针荧光标记;时域光学分子成像技术主要利用生物组织的强散射、低吸收特性,通过观测发射光子从生物组织中通过的时间,将靶点信号与背景信号区分开,一般只用于动物的局部成像.

3.3近红外荧光在强散射性生物组织中的传播模型

与重建算法

实验证明大部分生物组织(如皮肤、脑组织等)

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相对于近红外荧光是高散射、低吸收的介质,生物组

织对光子的作用包括散射、吸收等,光子在生物组织

内主要是前向传播.因此,通常采用漫射方程(也称

扩散方程)作为描述光子在强散射性生物组织中传

输的数学模型,其时域的表达形式如下[30?31]:

?·[D(r)?Φ(r,t)]?μa(r)Φ(r,t)=

1 c ?Φ(r,t)

?t

?S(r,t)(1)

其中,Φ(r,t)是在点r处时刻t的平均漫射强度;μa(r)是介质的吸收系数;c是光子在介质中的传输速度;S(r,t)是光源函数;D(r)是与位置相关的光子扩散系数:

D(r)=

1

3[μa(r)+μ

s

(r)]

(2)

μ

s

(r)=(1?g)μs(r)是约化散射系数,g是散射角余弦的平均值,μa(r)是介质的散射系数.

求解漫射方程的方法有解析法和数值法.由于漫射方程是一个偏微分方程,因此只有当生物组织模型和光源模型比较简单时,才能获得漫射方程的解析解.例如,当组织模型为均匀分布的无限大媒介、光源模型为规则的几何形状(如球形面光源、球形体光源)时,Cong等[32]获得了漫射方程的解析解.但在一般情况下,尤其当介质形状不规则时,漫射方程的解析解通常很难获得,因此一般采用数值解法或随机统计解法求解漫射方程.漫射方程的数值解法主要有:有限差分法和有限元法;随机统计解法主要有:Monte Carlo方法、随机走动法等.这几种方法各有优缺点[33],其中,有限差分法是较早应用的方法,具有算法简单、易于实现等优点,但在处理不规则几何形状及各向异性媒介时比较困难.有限元方法可以有效处理复杂几何形状及各向异性分布的媒介,而且计算速度快,因此广泛应用于光学成像的前向问题[34?37]和逆向问题[38?41]的求解中;但是它最大的缺点是只能得到平均漫射强度(即漫射方程的解),无法得到其他中间物理量信息(如生物组织吸收光能量的分布图等).Monte Carlo方法是一种基于“随机数”的计算机随机模拟方法,通过对大量光子包进行统计计算,得到求解区域内任意位置处有意义的物理量信息[11?12],其最大的优点在于能够处理复杂几何形状和非均匀分布的介质,其最大的缺点是计算量大,运行所需时间较长.

根据重建目标的不同,在体生物光学成像的逆问题主要分为两大类:1)生物组织光学特性参数的重建,即已知光源参数、生物组织的几何参数和探测器上得到的投影数据,求解生物组织内部的光学特性参数(如吸收系数、散射系数等);2)生物体内荧光光源位置的反演;即已知生物组织的几何参数、光学特性参数和探测器上得到的投影数据,利用一定的先验知识,定位小动物体内荧光光源的精确位置.由于生物组织边界处或CCD探测器上测量到的荧光散射光强是各边界点的离散数值,数量有限,而待求解区域内部的点往往数量巨大,所以这两类逆问题均为非适定性问题,系统方程组是病态的,其解不唯一,对测量误差及噪声非常敏感.

目前通常采用的重建算法大致分为基于扰动的算法(Perturbation-based method)[42?46]、基于梯度的算法(Gradient-based method)[41,47?48]和有限元方法等[13?15].其中,扰动法主要包括Born近似法、Rytov近似法和Newton法,已被广泛应用于生物组织光学特性参数的重建[42?45]和生物体内荧光光源的定位.例如:Cong等[46]根据BLT原型系统的CCD探测器测量得到的荧光信号,采用Born近似法,重建出小鼠体内生物发光光源的位置信息.梯度法则将求解的逆问题转变为非线性优化问题,通过构造一个目标函数并使其最小化来获取最优解.Arridge等[41]利用时域信号的拉普拉斯变换数据和共轭梯度法对圆形区域内的吸收系数和散射系数进行重构,并比较了共轭梯度法(Method of conjugate gradients,CGD)、最速下降法(Method of steepest descent,SD)和代数重构法(Algebraic reconstruction technique,ART)的重构效果,指出CGD法的效果最好.在此基础上,UCL的BORG (Biomedical Optical Research Group)小组开发了时域光学重构软件TOAST(Time-resolved optical absorption and scattering tomography),对吸收系数和散射系数的空间分布进行重构.Hielscher等详细比较了扰动法和梯度法的不同,采用时域数据和梯度法,获得了散射系数和吸收系数的重建结果.在University of Iowa的Bioluminescent Tomogra-phy Laboratory设计开发的BLT原型系统的基础上,Cong等[15]不仅采用有限元方法获得了漫射方程的数值解,而且采用有限元法实现了荧光光源的反演,取得了比较好的重建结果.Lv等[13]利用仿体实验数据和仿真数据,实现了基于多层自适应有限元方法的荧光光源位置的重建,实验证明了此重建算法具有良好的鲁棒性和较高的效率.

虽然针对在体生物光学成像的两类逆问题都取得了一定的研究成果,但重建算法仍存在一定局限性:1)基于扰动的算法不仅对初始值的依赖性很大,而且需要不断对系统的雅可比矩阵求逆,但雅可比矩阵一般是病态的,因此很难得到理想结果;2)在实际仿真过程中,基于梯度的优化算法往往在最初几步下降速度较快,随后收敛速度变慢,而且对距离边界较近的位置变化敏感,因此对生物组织光学特性参数的重建精度不理想.如何减小初始值对重建结

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果的影响、提高算法的收敛速度和重建精度是需要进一步探讨的问题;3)基于有限元方法的重建算法,所采用的生物组织和荧光光源还仅限于由规则几何体组成的模型,应用于真实小动物体内生物发光的重建还未见报道,而且网格剖分的好坏直接影响反演结果的精度,导致生物体内荧光光源的定位误差较大,因此有待于更深入的探索和研究.

4在体生物光学成像的应用

作为一项新兴的分子、基因表达的分析检测技术,在体生物光学成像已成功应用于生命科学、生物医学、分子生物学和药物研发等领域,取得了大量研究成果,主要包括:在体监测肿瘤的生长和转移、基因治疗中的基因表达、机体的生理病理改变过程以及进行药物的筛选和评价等.

4.1在体监测肿瘤的生长和转移

利用在体生物光学成像技术,通过荧光素酶或绿色荧光蛋白标记肿瘤细胞,可以实时监测被标记肿瘤细胞在生物体内生长、转移、对药物的反应等生理和病理活动,揭示肿瘤发生发展的细胞和分子机制.Contag等[20]将荧光素酶和绿色荧光蛋白作为报告基因,对肿瘤细胞进行活体成像,探讨了使用报告基因在细胞分子水平研究肿瘤的前景,并指出在体生物光学成像技术具有较高的灵敏度,尤其在监测肿瘤细胞的生长方面具有较大优势.Yang 等[49?50]首先利用光学成像系统对表达绿色荧光蛋白的肿瘤实现了实时非侵入性成像,记录了肿瘤的转移过程,开辟了在整体水平上无创、在体、实时跟踪肿瘤发生、发展和转移等生物学行为的崭新领域. Jenkins等[51]将标记了荧光素酶基因的人类前列腺癌细胞注射到小鼠体内,利用在体生物光学成像系统,实时、在体监测了前列腺癌细胞化疗后的复发和转移情况.基于绿色荧光蛋白的在体生物光学成像也在肺癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、脑胶质瘤和乳腺癌等多种肿瘤的生长转移等研究中得到了越来越广泛的应用[49?50,52?53].

4.2在体监测基因治疗中的基因表达

随着后基因组时代的到来和人们对疾病发生发展机制的深入了解,在基因水平上治疗肿瘤、心血管疾病、AIDS和分子遗传病等恶性疾病已经得到国内外研究人员越来越广泛的关注.如何客观地检测基因治疗的临床疗效判断终点,有效监测转基因在生物体内的传送,并定量检测基因治疗的转基因表达,已经成为基因治疗应用的关键所在.通过荧光素酶或绿色荧光蛋白等报告基因,在体生物光学成像技术能够进行基因表达的准确定位和定量分析,在整体水平上无创、实时、定量地检测转基因的时空表达[54].McCa?rey等[55]将荧光素酶标记在靶基因上,应用siRNA及shRNA减弱了小鼠转染的荧光素酶的表达,在活体动物体内首次实时观察到siRNA对特异靶基因表达的阻断作用.以病毒[56?57](如腺病毒及腺相关病毒等)作载体,将荧光素酶基因或绿色荧光蛋白等作为报告基因加入载体,采用在体生物光学成像,能够实时观察病毒在动物体内的侵染活动,获取病毒侵染部位等相关信息.

4.3揭示机体的生理病理改变过程

目前,在体生物光学成像技术已成功应用于干细胞移植、肿瘤免疫、毒血症、风湿性关节炎、皮炎等发病机制的研究中,可以实时监测生物机体的生理病理改变过程,具有重要的临床意义.应用转基因鼠,Wang等[58]将荧光素酶基因转导于人类造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC)中,并将其植入脾及骨髓,利用在体生物光学成像技术,揭示了HSC在小鼠骨髓腔中植活、增殖等动态信息,实时监测HSC的后代在小鼠体内的生长等.Kim 等[59]将荧光素酶基因转染于神经前体细胞(Neural progenitor cell,NPC),并注射入小鼠脑梗模型中,在体生物光学成像系统显示神经前体细胞迅速游走聚集至梗塞病灶处.风湿性关节炎和类风湿性关节炎的动物模型研究表明:荧光报告基因在患关节炎的关节局部产生荧光信号,在健康组织周围未见荧光信号,能够动态观测关节炎的发生和发展,对关节炎疾病的治疗具有重要意义.另外,在体生物光学成像技术在生物大分子间相互作用及细胞凋亡的研究中也取得了一定进展.Paulmurugan等[60]将胰岛素样生长因子与胰岛素样生长因子结合蛋白分别用绿色荧光蛋白及Renilla荧光素酶基因融合,研究它们之间在活体小动物体内的相互作用.

4.4药物的筛选和评价

目前,转基因动物模型已大量应用于病理研究、药物研发、药物筛选和药物评价等领域.通过体外基因转染或直接注射等手段,将荧光素酶或绿色荧光蛋白等报告基因标记在生物体内的任何细胞(如肿瘤细胞、造血细胞等)上,采用在体生物光学成像技术对其示踪,了解细胞在生物体内的转移规律,不仅能够检测转基因动物体内的基因表达或内源性基因的活性和功能,而且能够对药物筛选及疗效进行评价.Zhang等[61]利用转基因鼠,研究可诱导的NO合成酶在急慢性免疫反应中的作用,并以此对多种化合物进行抗免疫反应的测试和筛选.肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的原位GFP肿瘤的整体荧光成像模型已经建立[7],利用转移鼠和血管鼠实现了抗

12期李慧等:在体生物光学成像技术的研究进展1455

肿瘤生长转移和血管生成的在体药物筛选和评价(https://www.360docs.net/doc/8f4714182.html,).基于绿色荧光蛋白的在体荧光成像揭示了肿瘤发生发展的细胞和分子机制,非侵入性在体评价抗肿瘤药物的疗效[20].

5展望

目前,在体生物光学成像还仅仅停留在仿体和小动物实验阶段,尚未进入临床应用.初步研究表明,在体生物光学成像可达约10cm的测量深度[7],近红外荧光能够穿透12cm的乳腺或肺组织、6cm 的肌肉组织和5cm的成人脑组织[62],因此在体生物光学成像具有巨大的临床应用潜力,但在许多方面仍需进一步改进和完善.

1)增强荧光团与背景间的对比度.由于生物组织(如皮肤、毛发等)会产生非特异性荧光,以及荧光向周围组织的泄漏等原因,导致在体生物光学成像具有较强的背景噪声,信噪比较低,荧光团与背景组织间的对比度不足.研究人员通过研制特异性分子探针和荧光示踪剂标记技术,使分子探针能够比较容易通过体内环境障碍,与靶分子进行特异性结合;研究建立对特异性分子探针信号的放大和高灵敏探测方法,发展新的重建算法,降低背景噪声,提高在体生物光学成像的精度.

2)重建算法的改进.生物组织具有强散射、低吸收特性,因此荧光在生物组织中传输时具有吸收、散射、反射、透射等多种光学行为,导致在体生物光学成像的逆问题是非适定性问题,其解不唯一,对测量误差及噪声非常敏感.在体生物光学成像重建算法的研究,尤其是生物体内发光光源的反演,即准确定位发光光源的位置,已经成为本领域亟待解决的研究难点和热点之一.现有重建算法在重建的精度、速度、灵敏度等方面均存在明显不足,极大地限制了在体生物光学成像的实际应用.

3)提高图像分辨率.在体生物光学成像系统的分辨率远远低于传统的X-ray断层成像,大大减弱了其实验效果.研究人员通过增加探测器的数目、改进现有成像系统、抑制噪声等多种手段,来进一步提高图像分辨率.

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李慧首都师范大学教育技术系讲师,

中国科学院自动化研究所博士后.主要

研究方向为图像处理、模式识别、复杂性

科学.本文通信作者.

E-mail:lihuisd@https://www.360docs.net/doc/8f4714182.html,

(LI Hui Lecturer in the Department

of Education Technology,Capital Nor-

mal University,postdoctor at the Insti-tute of Automation,Chinese Academy of Sciences.Her research interest covers image processing,pattern recogni-tion,and complexity science.Corresponding author of this paper.)

戴汝为中国科学院院士,中国科学院

自动化研究所研究员.主要研究方向为

模式识别、人工智能、复杂性科学.

E-mail:ruwei.dai@https://www.360docs.net/doc/8f4714182.html,

(DAI Ru-Wei Academician of Chi-

nese Academy of Sciences,professor at

the Institute of Automation,Chinese

Academy of Sciences.His research in-terest covers pattern recognition,arti?cial intelligence,and complexity science.)