20个常用肿瘤实验

1.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

标签：大肠杆菌感受态细胞转化

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/453/454/25118.htm 2.微生物鉴定中常用的生化反应

标签：微生物生化反应鉴定

有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为pH6.8（红）～8.0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/531/532/31647.htm

3.PCR扩增和扩增产物克隆

标签：PCR 扩增克隆

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA 的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/457/458/15663.htm 4.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

标签：大肠杆菌感受态细胞转化

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/453/454/25118.htm 5.人胃癌裸鼠原位种植转移模型建立

标签：裸鼠胃肿瘤肿瘤移植

1969年Rygaard等首次成功将人类结肠癌移植于裸鼠后，多种人类肿瘤已经在裸鼠体内移植成功，从而开辟了利用动物研究人类肿瘤的广阔前景。以往的研究大多将癌组织直接移植于裸鼠皮下，但是这种模型由于周围结缔组织包裹，往往形成局部肿瘤而很少发生远处转移。20世纪九十年代以后国内外学者相继建立了人类肿瘤裸鼠原位移植（orthotopictranplantation）模型

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/539/564/566/18862.htm 6.免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

标签：免疫共沉淀蛋白质

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X

的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下

具体步骤；https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/502/527/529/31631_1.htm 7.PCR技术原理、实验步骤和应用

标签：PCR 原理步骤应用

PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/457/458/31619.htm 8.基因芯片实验原理与方法

标签：基因芯片原理方法

基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/586/587/19158.htm 9.质粒DNA提取与纯化

标签：质粒DNA DNA提取DNA纯化

质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/590/597/19364.htm

10.免疫组化实验方法

标签：免疫组化组织芯片实验方法

免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/502/527/529/22954.htm 11.Western Blot免疫印迹实验操作规程

标签：western-blot 免疫印迹蛋白质

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/465/473/31498.htm

12.体外细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏

标签：传代培养原代培养冻存复苏

细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即

将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/488/490/493/31633.htm 13.荧光原位杂交

标签：荧光原位杂交

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/590/596/19355.htm 14.细胞凋亡实验

标签：细胞细胞凋亡

细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/488/498/25759.htm 15.染色质免疫共沉淀技术（ChIP）

标签：染色质免疫共沉淀

甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白

-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/590/598/31641.htm 16.变性梯度凝胶电泳

标签：变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/465/477/31629.htm 17小鼠组织切片免疫组化实验步骤

标签：组织切片免疫组化

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/502/509/510/25808.htm 18.蛋白质的表达、分离、纯化

标签：蛋白质表达分离纯化

克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系

统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/465/467/31623.htm

19.DNA重组实验方法

标签：质粒DNA 重组

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA 连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/431/441/26630.htm

20.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

标签：逆转录RT-PCR 操作步骤

逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品

具体步骤：https://www.360docs.net/doc/901860158.html,/experiment/430/457/459/31434.htm

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

(整理)《药理学》实验讲义.

《药理学》实验讲义

实验一药理学实验的基本知识和基本技术一、目的 1. 掌握基本操作，锻炼动手、动脑能力； 2. 更好地掌握药理学基本理论知识； 3. 培养科学思维二、基本要求 1. 实验前：预习实验内容并复习相关理论知识； 2. 实验时 ⑴实验器材要妥善保管； ⑵实验操作按步骤进行，仔细观察实验中出现的现象，实事求是地做好记录； ⑶注意节约实验药品； ⑷维持良好的课堂纪律。 3. 实验后 ⑴各组同学将实验动物处死，实验台擦干净，将实验方盘送回准备室； ⑵值日生搞好实验室卫生，将死亡动物送至指定场所； ⑶书写实验报告。三、实验报告的书写 1. 题目 2. 目的 3. 原理 4. 材料：实验动物，器材，药品 5. 方法：用自己的语言简单扼要描述出来； 6. 结果：要求真实、清楚； 7. 讨论：将实验结果进行比较、分析；实验中有哪些不足之处；结果异常或失败的原因； 8. 结论：将实验结果进行归纳总结，应带有提示性质。四、药理学实验实验设计原则 1.随机原则按照机遇均等的原则进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差减少，而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。 2.对照原则空白对照（指在不加任何处理的条件下进行观察对照）；阴性对照也称假处理对照（给予生理盐水或不含药物的溶媒）；阳性对照也称标准对照（指以已知经典药物在标准条件下与实验药进行对照）。 3.重复原则能在类似的条件下，把实验结果重复出来，才能算是可靠的实验，重复实验除增加可靠性外，也可以了解实验变异情况。五、实验动物

1. 动物的选择（1）小白鼠：适用于需大量动物的实验，如某些药物的筛选，半数致死量的测定。也较适用于避孕药实验、抗炎镇痛药实验、中枢神经系统药实验、抗肿瘤药及抗衰老药实验等。（2）大白鼠：比较适用于抗炎药物实验，血压测定、利胆、利尿药实验，也可用于进行亚急性和慢性毒性实验。（3）豚鼠：因其对组胺敏感，并易于致敏，故常被选用于抗过敏药、平喘药和抗组胺药的实验。也常用于离体心脏、心房、肠管实验。又因它对结核敏感，常用于抗结核病药的实验。（4）家兔：常用于观察研究脑电生理作用，药物对小肠的作用。由于家兔体温变化敏感，也常用于体温实验，用于热原检查。（5）狗：狗是记录血压，呼吸最常用的大动物。还可利用狗做成胃瘘、肠瘘，以观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。在进行慢性毒性实验时，也常采用狗。2. 实验动物的编号狗、兔等较大的动物可用特制的铝质号码牌固定在颈部或耳上。大鼠、小鼠如为白色可用黄色苦味酸在不同的体表标志上标记。 3. 动物固定及给药（1）小鼠捉拿小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定，如尾静脉注射架或专用小鼠固定筒。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作，如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。（2）小鼠灌胃用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml,大鼠1～4ml,豚鼠1～5ml。（3）小鼠腹腔注射先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5 厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。（4）皮下注射注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入,固定后

药理学实验方案

元胡止痛片对小鼠镇痛抗炎镇痛活性研究 ——药理实验设计设计人：级药学一班张礼杰 515010 信盼 515024 陈茂琴 515026 何朵朵 515028 药学四班杨森 515101 冯禹 515110 王同月 515102

元胡止痛片中抗炎和镇痛作用研究 1.实验目的：探讨元胡止痛片的镇痛和抗炎作用 2.实验原理：（1）元胡止痛片收载于《元胡止痛片收载于《中国药典》是由元胡、白芷两味药组成的中药复方制剂为行气活血止痛剂临床用于治疗气滞血瘀胃痛、胁痛、头痛及月经痛等症疗效确切。本实验是为验证元胡止痛片的镇痛和抗炎作用进行验证。实验对四川禾邦阳光制药厂家生产元胡止痛片不同剂量进行了药效学研究采用小鼠醋酸扭体法、小鼠热板法和耳肿胀法实验分别测定小鼠扭体反应抑制率、小鼠痛阂值提高率和肿胀率从而确定不同剂量的镇痛和抗炎作用效果。在基础医学研究中筛选镇痛药的常见致痛方法概括有物理法（热、电、机械）和化学法。动物的疼痛反应常表现出嘶叫、舔足、翘尾、蹦跳及皮肤、肌肉抽搐。化学法，即将某些化学物质，如强酸、强碱、钾离子、缓激肽等，涂布于动物的的某些敏感部位或腹腔注射。腹腔注射损伤物质引起受试动物腹痛，动物表现出“扭体反应”（即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起）。 3.实验方法 :使用小鼠热板法、醋酸扭体法、耳肿胀法 ,并分别建立小鼠疼痛和炎症模型 ,灌胃给予不同剂量元胡止痛片配成的溶液，观察对动物的镇痛和抗炎作用。 4.实验过程： 1.内容

4.1 药品与试剂元胡止痛片：四川禾邦阳光制药股份有限公司，国药准字z51021658，规格：片芯重0.25g,12片阿司匹林: 浙江金华市第三制药厂, 国药准字: H13023716, 临用前用蒸馏水配制为适当浓度的混悬液。 4.2动物：健康昆明种小白鼠，雌性，32只 4.3 器材：数控超级恒温槽，烧杯、1ml 注射器、电子秤 4.4分组：空白对照组 (灌胃0.9%生理盐水 10 mL/kg) 元胡止痛片高、低剂量组 (0.2，0.4mg ／10g) 阳性药阿司匹林对照组 (灌胃阿司匹林 0. 4 g/kg) 4.5人和动物剂量换算公式小白鼠=20 0026 .0?人/g 2 方法（1）热板法 1.动物筛选：致痛潜伏期 (痛阈值)为 5~30s 之间的合格雌性小鼠。32只，热板法镇痛试验筛选痛阈值合格的小鼠，取♀小鼠于给药前先用热板仪于55 ± 0． 5 ℃分别测定每只小鼠的正常痛阈值［将小鼠放于智能热板仪上至出现舔后足的所需时间作为痛阈值( s) ，连续 2 次，间隔30 s ，测定平均值即为正常痛阈值］。将舔后足时间＜ 5 s 或＞30 s ，或跳跃者不用于此实验

抗肿瘤药效学指导原则

抗肿瘤药物药效学指导原则 (讨论稿) 1 基本原则抗肿瘤药物可分为：(1)细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；(2)生物反应调节剂(biological response modifier)；(3)肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)；(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)；(5)肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；(6)分化诱导剂(differentiation inducing agent)；(7)生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；(8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)等。抗肿瘤药物的药效学包括体内外抗肿瘤试验，评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。 2 体外抗肿瘤活性试验 2.1 试验目的(1)对候选化合物进行初步筛选；(2)了解候选化合物的抗瘤谱； (3)为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。 2.2 试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的和所选用的方法选择相应的细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT]还原法、XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphonyl)-5-[carboxanilide]-2H-tetrazolium hydroxide}还原法、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养的时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。 2.3 评价标准以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。 3 体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验结果是评价候选抗肿瘤化合物有效性的最重要指标。体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植瘤模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。鼓励使用人癌裸小鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型，以较正确和全面地评价候选化合物的抗瘤活性和抗瘤谱。鼓

药理实验方法学

第一章现代药理学实验方法与技术简介第一节分子生物学试验方法与技术分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。㈠探针种类 1．基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。 2．cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。 3．RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。 4．寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。㈡标记物常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P?3P?35S，有时也用14C,125I或131I。二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ）是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA 酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度

实验药理学样卷-理论考核_[1]

福建医科大学20XX级药学、药剂、药分、临床药学本科《实验药理学》考试卷（理论部分） 20XX年XX月专业：年级：组别：学号：姓名：题号一是非题二选择题三名词解释四问答题总分分数11 12 9 18 得分阅卷人复核人负责人日期一、是非判断题（是打上“+”，非打上“－”） 1. 悉生动物需在隔离系统饲育。（） 2. 某药临床日用量为80mg，家兔的等效剂量应为 3.73mg/kg（1.5kg家兔和70kg 人的体表面积比为0.07）。（） 3. 长期毒性实验的给药途径应尽可能与临床用药的途径相同。（） 4. 配制生理盐液，氯化钙需要先稀释后加入。（） 5. 主动脉条剪成螺形条片，对药物作用敏感，稳定性好。（） 6. 所有的新药临床前毒理都要求做药物依赖性实验。（） 7. 长期毒性实验的动物要求至少用两种，包括啮齿类和非啮齿类。（） 8. 测定LD50应观察14日。（） 9. 在乙酰胆碱对蛙腹直肌收缩效应实验中，标本通氧只为了混匀即时加入的药液。（） 10. 阿托品为Ｎ胆碱受体阻断药。（） 11. 豚鼠回肠含有μ受体及δ受体。（）二、选择题（选择一个最适答案，填于括号内） 1. 为了得到可靠的实验结论，应选择足够的样本数，下列有关描述错误的是（） A. 药效强者样本数应大 B. 两组样本数相同时，实验效率最高 C. 同体实验比分组实验效率高 D. 小动物的例数应多于大动物 E. 变异系数大则样本数应大

2. 异丙肾上腺素对血管作用的正确叙述是（） A. 对冠状血管无舒张作用 B. 扩张肾血管，明显增加肾血流 C. 具有较强扩张肠系膜血管的作用 D. 主要舒张骨骼肌血管 E. 显著扩张脑血管和肺血管 3. 药物与受体亲和力最小的是（） A. pD2 ＝1 B. pD2＝2 C. pD2＝3 D. pD2 ＝5 E. pD2＝8 4. 量效曲线可为用药提供何种参考（） A. 药物的毒性性质 B. 药物的疗效大小 C. 药物的安全范围 D. 药物的给药方案 E. 药物的体内过程 5. 作用于阿片受体的药物进行生物检定，应选用以下何种标本？（） A. 蛙腹直肌 B. 小鼠输精管 C.血管平滑肌 D.支气管平滑肌 E. 大鼠膈肌标本 6. 采用小鼠腹腔注射给药法进行某项实验，给药剂量为20mg/kg，药物配制浓度和给药容量宜为（） A. 2g/L；0.1ml/10g B. 2g/L；0.2ml/10g C. 100mg/L；0.2ml/10g D. 200mg/L；0.1ml/10g E. 500mg/L；0.4ml/10g 7. 急性毒性实验常用动物为（） A. 兔 B. 猫 C. 狗 D. 猴 E.小鼠 8. 用过量去甲肾上腺素，应用下列哪一种药物才能反转其血管收缩作用？（） A. 普萘洛尔 B. 异丙肾上腺素 C. 酚妥拉明 D. 阿托品 E. 新斯的明 9. 下列药物中，无抗惊厥作用的药物是（） A.苯巴比妥 B. 苯妥英钠 C. 硫酸镁 D. 地西泮 E. 哌替啶 10. 异丙肾上腺素的降压作用在应用普萘洛尔后（） A. 翻转 B. 减弱 C. 加强 D. 不变 E. 为双相变化 11. 药物的血浆半衰期是（） A. 50％药物与血浆蛋白结合所需要的时间 B. 50％药物生物转化所需要的时间 C. 药物从血浆中消失所需时间的一半 D. 血药浓度下降一半所需要的时间 E. 50％药物从体内排出所需要的时间 12. 乙酰胆碱作用的消失主要是通过（） A. 突触前膜摄取 B. 效应器细胞摄取 C. 突触部位的胆碱酯酶水解 D. 神经末梢的胆碱乙酰化酶催化代谢 E. 扩散到血液中被肝肾破坏三、名词解释 1. 3Rs 原则 2. 场刺激 3. 肾上腺素升压的翻转效应

Transwell侵袭实验全面总结

Transwell侵袭实验全面总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要

可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

药理学实验考核方法

不同考核方法对药理学实验成绩的影响任亮1，张志国1，付宜静 2 （1.河南省漯河医学高等专科学校河南漯河 462002； 2.河南省漯河医学高等专科学校第一附属医院河南漯河 462001）[摘要]目的：通过分析和比较在不同实验考核方法影响下，三年制临床医学专科学生药理学实验成绩的差异，希望能够找到对实验全过程监控的，行之有效的药理学实验考核办法。方法：将原始记录和操作评估分别引入药理学实验考核中，建立原始记录考核法实验组及操作评估考核法实验组，并以传统考核方法为对照组，观察不同考核方法影响下学生实验考核成绩的不同，比较优秀率和及格率的差异，分析产生差异的原因。结果：原始记录考核法实验组的实验成绩与对照组比较，有非常显著性差异（P<0.01），优秀率和及格率均明显高于对照组。操作评估考核法实验组的实验成绩与对照组比较，有显著性差异（P<0.05），优秀率和及格率均高于对照组。结论：原始记录考核法和操作评估考核法均能够对实验过程进行有效监测，较全面地反映学生实验完成情况，显著提高实验考核成绩和学生各方面素质。相比较而言，原始记录考核法能够更好提高药理学实验教学的质量，符合药理学实验教学的特点，便于执行和操作，是一种行之有效的考核方法。 [关键词] 药理学；实验考核；原始记录；操作评估随着高校在实验教学方面投入的不断加大，药理学实验在硬件方面有了很大的改善。但在药理学实验教学长期中存在的，如学生预习的自觉性不强，主动性和参与性不强，教师对过程监控性不足等问题，却没有很好地解决，甚至有不断恶化的趋势。笔者认为，造成这种现状的主要原因，与药理学实验缺乏较为科学的考核方法有着密切的关系。传统的药理学实验考核主要以实验报告完成情况作为依据，忽视了对学生实验过程的监督与评价，不能全面反映学生的动手能力、观察能力和科研协作能力等诸多能力。因此，建立一种合理的、可行的，能在实验过程中动态监测学生实验情况，全面反映学生综合素质的考核方法，是当前药理学实验教学中急需解决的重要问题。

肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响欧阳学文（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。图1 肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细

胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。

药理学设计性实验

药理学设计性实验实验一、石菖蒲的镇静作用【目的】 1应用小动物自主活动学习镇静药物的实验方法。 2、应用小动物自主活动仪，研究地西泮、石菖蒲对小鼠自发活动的影响。【原理】小动物自主活动仪的原理：在活动箱内，将一束或几束光线照射到对侧光电感应器上，动物在箱内每活动一次，感应电流发生改变，经过放大装置，使电脉冲驱使继电器启动, 通过记录器记录动物活动次数。地西泮是镇静催眠的代表药。石菖蒲具有宁心安神作用，其挥发油对中枢有广泛的抑制作用。本实验以小鼠自发活动次数为指标，观察药物的镇静作用。【动物】小鼠6只，实验前禁食12h o 【药品】0.05%地西泮溶液，石菖蒲水煎液，生理盐水【主要器材】动物自主活动仪1台，电子称1台，1ml注射器2支，烧杯2杯。【方法】将6只动物随机分为甲乙丙组，甲组灌胃生理盐水，乙组灌胃石菖蒲水煎液(连续两天)，丙组灌胃地西泮1次，0.2ml/10。给药后1小时各组动物放入小动物自主仪，先适应2分钟，再记录5分钟内小鼠自主活动次数。【结果】地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响。(结果见表1) 表1地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响参考文献： [1] 胡锦官，顾健，王志旺?石菖蒲及其有效成分对神经系统作用的药理研究[J].中药药药理与临床.1999.15 (30: 19 [2] 刘新民.石菖蒲的研究现状J].中医药研究.1992. (4): 57 [3] 吴启端，吴清和，石菖蒲的药理学研究进展[J].2006,17 (6) :477-480 实验二、石菖蒲对记忆障碍小鼠模型的改善作用【目的】 1、学习小鼠跳台原理和操作，正确运用跳台实验仪器对小鼠进行学习记忆能力行为学测试。 2、观察石菖蒲对小鼠记忆获得障碍的疗效作用。【原理】鼠跳台实验装置由DT-200小鼠跳台测试箱和DT-200小鼠跳台测试仪组成。测试箱由6个小房间构成，一次可同时试验6只动物，每个小房间有一橡皮台，箱底是可通电的铜栅，在训练期通电小鼠跳下平台在箱底不断被电击，这个过程中小鼠获得记忆，24 h后测试时观察小鼠第一次跳下平台的时间和 5 min内跳下平台的次数，比较各组老鼠记忆保持的能力。戊巴比妥钠能造成小鼠学习记忆障碍。石菖蒲具有开窍醒神，宁心安神的作用，能够促进学习记忆。本实验以小鼠跳下潜伏期及5min内错误次数作为指标，观察药物对小鼠学习

抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则

抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则一、基本原则 1. 抗肿瘤药物分类 (1) 细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等； (2) 生物反应调节剂(biological response modifier)； (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)； (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)； (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；（6）分化诱导剂(differentiation inducing agent)； (7) 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；（8）反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 。 2. 抗肿瘤药物药效学需研究内容 2.1 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。 2.2 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 2.3 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。二、体外抗肿瘤活性试验 1. 试验目的 1.1 对候选化合物进行初步筛选； 1.2 了解候选化合物的抗瘤谱； 1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。 2. 试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。

药理实验考试

1. 实验设计中要有那几组（除了实验组外，还要有阳性,阴性,空白） 2 .离体溶液的选择和使用：离体肠肌-台氏液；离体心脏-任氏液 3 .LP定义：latent period 潜伏期：从给药开始至出现疗效时间 4 .全身麻醉注意事项：先快后慢，缓慢增加麻醉药药量并不时检查麻醉效果，过量会使动物死亡；保持环境安静 5. 离体肠肌保存：台氏液，使其保持湿润，恒温38±0.5℃，通气，前负荷 6 .全身麻醉药：乙醚，乌拉坦，氯胺酮 7 .pA2:拮抗参数，表示竞争性拮抗剂作用强度,pD2:激动剂相对激动效应的参数 8. 翻正反射消失：将小鼠轻轻置于仰卧位，松手后仍能保持仰卧状态，即为翻正反射消失 9. 灌胃体积范围：小鼠-最多不超过1.0ml，大鼠-一次给药量不超过2.0ml，兔子5~10ml 10 .腹腔注射：小鼠-常用量为0.5ml 不宜超过1ml，兔子-5ml 11. 静脉注射注意事项：注意不能有气泡注入，否则兔会立即死亡；注射剂量10ml以下；如果插在血管外，有丘状突起，应拔出针头，在近心端重新注射；拔出针头时须用棉球压住注射部位。 12. pA2的计算方法及优缺点比较：累积剂量法给药，采用三点法计算pA2。优点：只需两条剂量-反应曲线，计算简单，省时省力。缺点：响应比较粗，精确度较差。 13 .去甲肾上腺素：α受体-显著升压 --阻断：酚妥拉明。异丙肾上腺素：β受体-降压阻断：普萘洛尔肾上腺素：α，β：先升后微降毛果芸香碱--M受体激动阻断：阿托品 14 .筛选镇痛药的方法及使用于何种镇痛药：中枢性镇痛药（镇痛药分为中枢性和外周性镇痛药，某些外周性镇痛药如水杨酸类的镇痛作用不易测定） 15. 热板法：温度（55±0.5℃）评价部分激动剂时温度低于49.5℃ 痛阈提高百分率=100%×（用药后痛反应时间-用药前痛反应时间）/用药前痛反应时间不能使用雄性小鼠（因雄性小鼠受热后阴囊下坠，阴囊皮肤对痛敏感） 16 .动物分组法 17 .急性毒性实验中为什么用LD50不用LD90等其他指标因为剂量反应关系的“S”型曲线在中段趋于直线，直线中点为50%，处斜率最大，变化最明显，亦即计量反应最敏感处，此时剂量也最准确，误差最小。故LD50值最具有代表性。 18 .急性毒性实验:是指机体一次或短时间内（24小时）多刺接受大剂量某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应，包括死亡效应，是药物安全性评价的第一道关卡。写出两种计算LD50的方法名称——孙氏改进寇氏法、Bliss法 19 .八木氏蛙心灌流法（记名字） 20 .列举2种中枢兴奋药名称：士的宁，尼可刹米，回苏宁 21. 体重范围：小鼠18-22g.兔2-3㎏犬5~10㎏ 22.小鼠给药方法： Oral administration 灌胃＜0.1ml Subcutaneous administration 皮注 Intramuscular administration 肌注＜0.2ml Intraperitoneal administration 腹注 0.5ml 不超过1ml Intravenous administration 尾注 0.2~1.0 ml 23 .家兔给药方法:灌胃 5~10ml ；静注 intravenous 小于10ml ；皮下 2ml ；肌内 2ml ；腹注 5ml 离体 in vitro 在体 invivo 24.剂量计算 eg:0.04%--o.o4g/100ml 25.动物惊厥的五个时期：潜伏期，僵直屈曲期，后肢伸直期，阵挛期，恢复期。 26.如何找回肠？--回盲瓣

药理学实验教程资料

药理学实验教程（中、英文版）主编叶春玲钟玲暨暨南南大大学学药药学学院院药药理理教教研研室室 22000077年年55月月

药理学实验教程目目录录第一篇药理学实验基本知识第一章药理学实验须知一、药理学实验课的目的和要求二、实验结果的整理和实验报告的撰写第二章药理学实验设计的基本知识一、实验设计的基本原则二、药理实验设计中的剂量问题三、药理实验设计中的预试问题第三章药理学实验的统计处理原则一、计量资料的统计分析二、计数资料的统计分析三、药效和剂量依赖关系（相关性）的统计分析四、两药药效的等效性分析第四章常用实验动物的基本操作一、实验动物的选择及捉拿固定二、实验动物的编号三、实验动物的给药方法四、实验动物的麻醉和取血第五章药理学实验常用仪器操作技术 BL-410生物机能实验系统第六章药物剂型与处方学一、药物剂型二、处方学第二篇药理学总论实验第一章药动学实验实验一磺胺类药物静脉给药后的药时曲线实验二磺胺类药物非血管内给药后的药时曲线实验三 3P87 计算药物动力学参数

实验四磺胺类药物在体内的分布实验五磺胺嘧啶的血浆蛋白结合率测定实验六磺胺类药物在麻醉大鼠体内经胆汁和尿排泄的实验第二章药效学总论实验实验一不同给药途径对药物作用的影响实验二肝功能状态对药物作用的影响实验三量效关系曲线和有关药效学参数测定第三章安全性试验实验一药物急性半数致死量（LD50）的测定实验二最大耐受量（MTD）测定第三篇药理学各论实验第一章传出神经系统药物实验实验一药物对麻醉动物血压的影响实验二药物对麻醉动物血流动力学的影响实验三药物对离体兔主动脉环的作用第二章中枢神经系统药物实验实验一药物对小鼠自发活动的影响实验二药物对益智作用的影响实验三抗癫痫药和抗惊厥实验实验四镇痛药实验第三章心血管系统药物实验实验一利多卡因对哇巴因诱发心律失常的拮抗作用实验二强心苷对家兔在体衰竭心脏的作用实验三药物对垂体后叶素所致的急性心肌缺血心电图变化的影响第四章内脏系统药物实验实验一呋塞米对小鼠尿量及电解质的影响实验二药物对组胺诱发豚鼠哮喘的作用实验三药物对大鼠的利胆作用第五章激素类及抗炎药物实验实验一糖皮质激素对毛细血管通透性的影响

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤： 1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。实验材料

肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)

肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ）肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。实验方法 Matrigel 基质膜模型实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制

药理实验方法学重点

一．1.首过效应：口服给药后，药物在到达体循环之前，经肠道、肠壁和肝脏的代谢分解使进入生物体内的相对药量降低。2，判断方法：尾静脉给药AUC和门静脉给药AUC—比较判断肝首过—是—尾静脉》门静脉;门静脉给药和十二指肠给药AUC—比较判断肠首过—是—门静脉》十二指肠十二指肠和灌胃给药AUC—比较判断胃首过—是—十二指肠AUC》灌胃AUC 二．简述肾外包扎性高血压模型制备的基本原理和注意事项?答：原理：肾外异物包扎，可致肾周围炎，肾外形成一层纤维性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，使肾素形成增加，进而使血管紧张素含量增加，血压上升。属肾性高血压模型。注意事项：1)肾外包扎材料除自制双层孔胶薄膜和玻璃纸外，还可用绸布、乳胶、火棉胶等材料。肾外包扎应足够紧，但不能勒破组织。2) 如果要制造2肾1扎型，则一侧肾包扎后无需切除另一侧肾，术后3~6个月10%~20%动物形成高血压；如果要制造2肾2扎型，则一侧肾包扎后同法包扎另一侧肾，术后3~4周70%以上动物形成高血压。三、（一）佐剂性关节炎1.大鼠AA的制备：选用雄性Lewis、Wistar或SD大鼠，体重200g左右，将每鼠右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂（CFA）0.1ml致炎。CFA是将卡介苗或死结合分枝杆菌加入已经高压灭菌的液体石蜡中，浓度为10mg/ml。原发病变主要表现为早起致炎局部的炎症反应，致炎后18h右后足的肿胀达峰值，持续3d后逐渐减轻，8d后再度肿胀；继发病变一般出现于致炎后10d左右，表现为对侧和前肢的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等等。2.小鼠AA 的制备：选用雄性C57BL/6小鼠，8周龄，4%氟烷吸入麻醉，左侧胫-跗关节皮下两点皮下注射100ulCFA，CFA浓度为5ug/ul，对照组同方法注射液状石蜡。造模后22d处死。造模24h 内原发侧关节出现急性肿胀，第9天肿胀较严重。模型组穿格子数和活动度明显降低。造模后小鼠对于机械异常性疼痛和热痛出现明显退缩反应。（二）II型胶原诱导的关节炎 1.小鼠CIA的制备：将鸡或牛II型胶原（CII）溶解于0.01mol/L的醋酸后与同等容积的含有低浓度卡介苗的液体石蜡油（ALCB）充分乳化，CII和ALCB的计量均为4mg/mL.,乳化在冰浴中进行。在小鼠（18g左右）根部多点皮内注射乳化剂0.1ml，第21d在尾根部加强注射。加强注射后，由第三者检查关节炎的发生情况。2.大鼠CIA的制备：CII溶解于0.01mol/L 的醋酸中（CII终浓度为4mg/ml），充分研磨，4度过夜，讲CII溶液滴加至冷的不完全弗氏佐剂（IFA）中，等体积混合，充分乳化。大鼠（体重150g左右）尾根部和背部分多点皮内注射0.1mLCII乳化剂。7d后同法再坚强注射一次。对照组注射0.01mol/L醋酸和IFA的乳化液。从第20d后开始，用组织测量仪测定后足趾的容积。评价指标：足趾肿胀度、全身表现评分、关节肿胀数、关节炎指数、X线评分、关节炎病理评分。四、祛痰药的药理试验方法 1).呼吸道分泌液量测定法小鼠酚红实验法,基本原理：利用酚红小鼠腹腔注射后部分从气道排泄的特点，测定小鼠气道酚红排泄量，以判断受试药对气道通透性和分泌液量的影响.操作步骤：小鼠饥饿16-18h--注射酚红前30min受试药物灌胃--腹腔注射酚红药物，30min 后处死--血凝后，分离气管、气管插管并与注射器相连--用5% NaHco3 0.8ml 洗气管，反复三次--合并洗液，放置，得透明红色上清液，用分光光度计波长545nm比色，根据酚红标准曲线计算出酚红量。注意事项：1.待小鼠体内血液凝固后，再切开颈部，以免血液中酚红影响。2.气道内注入NaHco3溶液后吸出时要轻轻进行，一旦用力过度，肺泡会破裂液体流入胸腔。2)呼吸道纤毛运动实验法---鸽纤毛运动实验法原理：利用气管纤毛运动带动颗粒物从气管内固定的向口腔方向的速度，测定药物祛痰药物，一般测运动2cm所需的时间.操作步骤：鸽气管分离，做2cm的标记---切开气管，将软木屑放在2cm向心端--记录2cm所需时间，观察给药前后0.5h的速度，正常是3-4min。注意事项：鸽气管暴露实验注意温度，等待时颈部用生理盐水湿润纱布防治干燥.3)豚鼠气道黏液黏蛋白的测定.原理：气道黏液主要由杯细胞和黏液性腺细胞产生和分泌，内含黏蛋白，为黏多糖和蛋白质。无机酸存在下，己糖醛酸从黏多糖中释放与咔唑起缩合反应，形成有色物，在530nm比色测定.操作：豚鼠麻醉处死，取气管称重----剪开气管用棉棒取黏液--水洗，离心，取上清液