四色荧光末端终止法测序简介

四色荧光末端终止法测序简介

DNA测序技术主要依据Sanger的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板，在特定条

件下，用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将

4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延

伸是通过引物的3'-羟基和脱氧核糖核苷酸底物的5'-磷酸基团形成磷酸二酯键来完成

的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，这种2'3'ddNTP的5'-磷酸基

团是正常的，而3'位置缺少羟基，因此在DNA聚合酶作用下，仍然可以通过5'-磷酸

基团与引物链的3'-羟基反应掺入到引物链中，但是由于ddNTP没有3'-羟基，不能继

续与下一个5'-磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应

体系中，DNA引物链不断合成与偶然终止，产生一系列的长短不等的核苷酸链。然后

将这些测序反应产物进行电泳。ABI公司的测序试剂中使用了在4种ddNTP上标记了

4种不同颜色的荧光染料，而使得通过测序仪器可以分辨出每一条链被终止时的碱基种

类来逐一判读被测序的DNA模板序列。

对于双链DNA模板，在测序反应过程，我们只加入一条引物，这条引物只与双链

DNA模板任意一条链配对进行测序反应，与引物不配对的另一条DNA单链在反应中

不会干扰序列反应的测定。

DNA测序常见问题答复

1．为什么需要5ml菌液？

测序需要的DNA模板量较大，每次测序反应一般需要400ng(载体及插入片断大于10K则需要更多)，并且样品准备需要鉴定、遇到一次测序实验不理想还需要重做、有些样品还需要进行多次测序等等。

2．如何提供菌液？

您可以提供4-5ml新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；最好是将菌体沉淀下来(5000转/分钟)，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

3．如何制作穿刺菌？

用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4oC保存。

4．PCR产物直接测序有什么要求？

1)．扩增产物必须特异性扩增，如果扩增产物中有非特异性扩增产物，一般难以得到测序结果；2).必须进行胶纯化；3.长度200-500左右比较合适。小余200碱基对，大于500碱基对的样品进行直接测序不合算。

5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？

如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

6．如何进行PCR产物纯化？

PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。我们使用MOBIO的试剂盒回收(见目录号12100-300)，该试剂盒回收方法操作简便，100bp-50000bp 的产物均可回收。回收产物用ddH2O溶解。

7．PCR产物直接测序的好处？

A) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；

B) 省去克隆的实验费用和时间；

C) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；

D) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。

8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？

对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。

9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。

质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。

使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

10．为什么抽提的质粒需要溶解在ddH2O中？

全自动荧光测序由于反应体系小，所以对于模板DNA的质量要求比手工测序高许多。通常的提取质粒的试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，我们建议用户不要使用。因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败。

11．对测序引物的要求有哪些？

对测序引物的一般要求：1).特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；

2).不能含有混合碱基；3).长度17-25碱基；4).纯度高，最好PAGE纯化；5).用ddH2O溶解，不要用TE溶解。

12．为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？

测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的前提。如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增，从而得到链长相同而组成不相同的终止链，测序电泳时收集到重叠峰或乱峰，无法读取序列。

13．为什么测序引物3'端以后有30-50碱基无法读到？

全自动荧光测序方法由于使用标记了大荧光染料的ddNTP，一些未反应完的ddNTP底物会连同测序反应产物一并被沉淀，在测序电泳时会干扰测序信号，导致这部分碱基无法读清。一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。通常这也是载体的序列。所以选取测序引物时要使引物3'端离开要求测序的起始位置50碱基以上比较合适。而对于PCR产物测序就不可避免使得测序引物区域附近无法读到数据。

14．什么是Primer Walking 测序？

大于1kb的样品，双向测序如果不能完全拼接，我们还可以为用户按照上一个测序结果在400-450碱基左右设计引物继续测序，并将测序结果拼接，即Primer Walking 测序。我们按照实际测序的反应个数以及合成的引物碱基数收费。

15．超过6Kb的DNA片断如何进行测序？

超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间，Shot Gun方法如下：

1).用物理方法打碎DNA；

2).回收1-1.5K的片断；

3).用核酸酶切平端，连接入载体；

4).按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据；

5).编辑所有测序数据；

6).如果有缺少数据的区域，还需要补充测序。拼接成完整序列。

费用方面略高，请具体询价。

16．全自动荧光测序的准确性如何？

我们使用美国AB公司的ABI377测序仪以及配套的BIGDYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT，该测序方法以及安装仪器时用标准样品测试，准确性达到一个反应500碱基中只有1个以下的错误(即错误率小于0.05%)。如果用户得到一个测序结果的彩图是清晰的，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码是一致的，那么它的准确性应该是可信的。当然如果是新序列，最好用同方向或反方向再测序一次加以验证。因为两次不同的测序，同一个碱基上的错误概率应该小余0.0025%。同时出错的可能性极小。

当然由于每一份测序报告都需要人工判读分析结果，由于时间和经验等原因，不一定每一份测序报告都能够将仪器漏读、错读、多读的碱基100%的纠正过来，所以一旦您觉得有问题，请您及时与我们联系，说明您的情况，我们一定给您满意的回答。

DNA合成简介

我们使用的ABI39X系列合成仪选用的是一种称为固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。这种方法被使用以来，合成DNA 片段成为一件非常简单易行的工作。

固相亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。合成的第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团Dmt，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料(亚磷酰胺保护核苷酸单体)与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体(它的3'端被活化，5'-羟基仍然被Dmt保护)，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应，这个反应时间很快。第三步是带帽(capping)反应，缩合反应中可能有的极少数5'-羟基没有参加反应(合格的合成试剂缩合效率一定会大于98%，所以未参加反应的少于2%)，合成过程使用乙酸酐和1-甲基咪唑

使这些核苷5'-羟基反应形成酰，终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。这步反应同样是快速高效的；第四步，缩合后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团Dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

以上合成仪上合成的粗产物，使用浓氨水在55oC,8-10hours脱去碱基环上的保护基团，再使用各种纯化方式去除合成过程中形成的短片段，得到合乎要求的DNA片段。

DNA合成常见问题解答

1．DNA合成粗产物中含有什么杂质？

DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。

2．如何进行合成产物的纯化？

目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：

A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。

B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。

C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段(对于长于40碱基的片段，无法纯化)。

D) PAGE纯化，几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。它是依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移得慢，经过一定时间的电泳，大小片段会分开，然后停止电泳，剥离凝胶，置于荧光TLC板上在紫外灯下切割目的条带，浸泡碎胶，并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的质控环节。通常认为的缺点是实验室水平的PAGE纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。但这些缺点完全可以克服。我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18柱回收产物，使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置，增加凝胶厚度和长度来增加负载量和分离效果等等。所以我们一直使用PAGE纯化方式保证合成产物的纯度。

为了保障您的后续实验，请您选用PAGE纯化的产品，特别是现在DNA合成不同纯化方式的价格相差不多的情况下。

3．如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

4．如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)

5．怎样按照使用浓度溶解引物？

记住几个参数：

1OD引物干粉约为33微克；

碱基的平均分子量为324.5；

引物的分子量=碱基数x 碱基的平均分子量；

引物的摩尔数=质量数/ 引物分子量

举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，

分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg

摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol

若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。

同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。

6．如何保存引物？

我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来，无菌，无核酸酶。可以室温或-20oC密闭长期保存；

溶解以后的DNA最好保存在-20oC,溶解引物的水的PH要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存

7．已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。我们发现不少实验室用的双蒸水PH<6，请您也查查。

使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。

8．为什么英骏公司可以提供较多产物？

与所有化学制备反应一样，最终产物的多少取决于起始反应物的量以及合成效率。

我们使用的仪器和生产规程使我们可以调整合成的起始量，而且合成的高效率使我们可以得到较多粗产物。

我们的改良的PAGE纯化与C18柱回收结合的方法使得我们得到的最终产物能够满足您的要求。

9．为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双

链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

10． PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好，怎么办？

PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉英骏公司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。也可以将引物和模板寄给我们帮助您进行PCR。

11．引物不纯会造成什么后果？

引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。

12．普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗？

普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基，可直接用于PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费(参见价目表)。

13．PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？

我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您：

1) 可以要求我们重新免费合成引物。

2) 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能；

3) 要求我们免费为您做点突变予以改正。

14．英骏公司可以合成多长的序列？

由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要，我们愿意接受110碱基以下的订单。

15．我订购了两条可以退火的引物，您可以帮助退火吗？

可以。您也可以自己退火。用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95oC 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30oC)即可。退火的产物可以放在4oC待用。

16．英骏公司帮助设计引物吗？

我们可以帮助您设计引物，需要您按照要求提供具体资料。但是由于您提供资料的准确信以及我们水平的限制，我们不能保证每一个设计的引物一定工作。我们不承担设计引物失败的责任。您如果信任我们，我们愿意帮助设计。

17．各种标记的荧光染料的名称、吸收波长和发射波长、可见光中颜色是怎样的？