海洋细菌活性物质

海洋细菌活性物质的研究概况

刘拥微生物与生化药学2111007135

海洋是生命之源，人类物质资源的天然宝库。海洋生物量约占地球生物总量的80％，生物种类20万种以上，蕴藏着丰富的药用资源。但是，目前人们对海洋生物的认识仍相当有限，利用率仅l％左右。海洋生态环境十分独特，海洋的特殊环境如高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部的高温和高盐等，造成了海洋微生物的多样性和特殊性。使海洋微生物产生了与陆地微生物不同的代谢系统和防御体系，特别是从海洋微生物中提取的生物活性物质，常常具有新颖的化学结构和特异的生理功能，在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保健等方面具有独特效应，已成为开发新药、特药的主要研究方向之一。海洋细菌是海洋微生物中的优势类群，同时具有产生生物活性物质的巨大潜力，由于海洋细菌具有独特的代谢途径和遗传背景，故可产生出不同结构和功能的天然活性物质，所以为寻找能解决目前疑难杂症的药物提供了丰富的资源，也为微生物工业化生产新药开辟了一条崭新道路。海洋细菌活性物质的研究，是目前国际研究的热点。

1 海洋细菌资源

海洋中常见的细菌主要属于以下几个系统类群：变形细菌(Proteobacteria)类群、革兰氏阳性细菌类群(包括高G+c和低G+c)、噬纤维菌属一黄杆菌(Cytophaga-Flavobacterium)类群、浮霉状菌(Planctomycetales)／衣原体类群、疣微菌(Verrucomicrobiales)类群及一些人工尚未培养成功的系统类群等。其他一些细菌类群也存在于海洋生态环境中，但研究报道较少?。早期人们从海水中分离得到的海洋细菌有9o％以上是革兰氏阴性细菌，对这些细菌的研究较多也较集中。随着研究的深入，发现海洋中同样存在许多革兰氏阳性细菌，但大多分布于海洋沉积物和海洋生物共生系统中，并常在系统学上形成独特的分支。海洋中的革兰氏阳性细菌包括产芽孢和不产芽孢的属群，主要有：芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌(Paenibavillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、微球菌(Micrococcus)、梭菌属(Clostridium)、八叠球菌属(Sarcina)、动性球菌属(Planococcus)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、放线菌属(Actinomycetes) 。

2 海洋细菌药物研究

2．1 抗菌活性物质

抗菌活性物质主要包括抗细菌、抗真菌、抗病毒物质三类，其中主要以抗细菌活性物质为主。许多海洋细菌可产生抗生素，包括链霉菌属(Streptomyces)、交替单胞菌属(Alteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobavterium)、微球菌属、着色菌属(Chromatium)、钦氏菌属(Chainia)、Madurmacetes等菌及许多未定菌。已报道海洋细菌产生的抗生素有溴化吡咯、a—n— pentylquinolind、magnesidins，istamycins，aplasmomycins，ahermicidin，macmlactins，diketoplperazines、3-氨基一3一脱氧一D一葡萄糖、oncorhynco|ide、maduralide、salinamides、靛红、对羟苯基乙醇、醌、thiomarinds BC、trisindoline、pyrolnitrim等，其中有些种类在陆生菌中从未见过。Jaruchoktaweechai等从海泥里分离出一株芽孢杆菌(Bacillus sp．)Sc026，并从其培养液中分离出3个大环内酯化合物对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制活性。Fudou等从海藻中分离出一种新属黏细菌Halisngium luteum，其培养液的丙酮浸膏中分离出一个新的抗真菌抗生素—Haliangicin。

一些海洋细菌产生的活性物质对海洋微生物具有专一性抑制作用。Yoshikawa等从绿藻中分离到的一株交替假单孢菌，在75％人工海水培养基中可产生一种抗菌物质，该物质能抑制海洋细菌的生长而对陆地微生物不起作用。虽然海洋放线菌不是主要的海洋微生物区系，但近年来研究表明海洋放线菌代谢产物却是寻找新抗生素的重要来源。头孢菌素、硫酸小诺霉素就是由海洋放线菌分泌产生并已得到临床应用的抗生素。黄维真等从福建沿海海泥中分离到一株海洋放线菌--- 鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种(S．rutgersensis subsp．gulangyunensis)，能够产生广谱、低毒性的抗菌物质Minobiosamine和肌醇胺霉素等，对绿脓杆菌和一些耐药性革兰氏阴性菌具有较强的活性；另外一株嗜碱性放线菌则能够产生一种典型的氨基苷类抗生素。Kala从红树林底泥分离出的放线菌中获得抗生素，对鱼类病原菌等有一定的拮抗作用。

2．2 抗肿瘤活性物质

海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源，主要集中在假单胞菌属、弧菌属(Vibrio)、微球菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属(Enterubacrerium )、交替单孢菌属(Alteromonas)、链霉菌属、钦氏菌属、黄杆菌属和小单孢菌属(Micromonospora) 。

Sesbanimide是CHIKA TAKAHASHI等f3l1从两株海洋土壤杆菌(分别分离自加勒比海海鞘Ecteinascidia turbinata及Turkish海岸Polycit0hide属海鞘)的脂溶性代谢产物中分离到两个有显著抗肿瘤活性的化合物SesbanimideA(1)和C(2)。1999年，Canedo L M等1321又从该属中分离到的抗肿瘤噻唑生物碱化合物Agrochelin(3)，体外对小鼠白血病P388细胞、人(A549、HT29、MEL28)肿瘤细胞有显著细胞毒性(O.05—0.2mg／L)，但其乙酰化衍生物（4）的细胞毒性却大大减少(3～7 mg／L)。

Macrolactins是从深海(一1 000 m)细菌中分离到的系列大环内酯类化合物．其中macrolactin A组分是一种配糖体母体，即有抗菌活性又能抑制B16— F10黑色素癌细胞，还能保护T一淋巴细胞防止人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等功能。 Halobacillin是从一株海洋芽孢杆菌(分离自墨西哥Guaymas海湾一124 m深海污泥中)发酵物中分离到的Iturin族酰基化多肽，结构特征是具有极性的环状七肽和亲脂的B一酰氧基或B一氨基脂肪酸，对人结肠癌细胞有中等细胞毒性(IC50=O.98 mg／L)。

Homocereulide和cereulide是从分离自潮间带蜗牛体表的B.cereus 的脂溶性提取物中分离到的2个具有极强细胞毒性的环肽，对P388和结肠26细胞的IC50为1— 35pg／mL。

PM一94128是从来自海洋污泥的芽孢杆菌(PhM—PhD一090)发酵液中分离到新的isocoumarin化合物，能抑制DNA及蛋白质合成(对DNA的IC50=2.5μmol／L，对蛋白质的IC50=0.1μmol／L)，对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒性(P388、HT29、MEL28的IC50均为0．05μmol／L)。

Alteramide A是从海洋互生单胞菌属Aheromonas sp．(分离自日本北海道海绵Halichondria okadai )中分离到的的四环内酰胺生物碱，在体外对小鼠白血病P388细胞、人淋巴瘤L1210及人表皮癌KB细胞有细胞毒性(IC50分别为0.1，1.7,5.0 mg／L)。Macrolactins是从深海(一1 000 m)细菌分离到的一组抗菌抗肿瘤抗病毒化合物，是罕见的24元大环内酯，含有3对两两共轭的烯键。其中Macrolactin A不但有抗菌活性，而且在体外有显著抑制B16一F10黑色素瘤细胞活性(IC5o=3.5 mg／L)。

Pelagiomicins是从海洋新属革兰氏阴性海洋嗜盐菌Pelagiobacter ariabilis(分离自帕劳群岛的巨藻Pocockiella variegata)分离到的一组吩嗪类化合物其中Pelagiomicins A在体内对宫颈癌Hela细胞,BALB3T3及BALB3T3／H—ras细胞有显著的细胞毒性(Ic50分别为0．04，0.2，0.07 mg／L)，但在体内对P388细胞仅有微弱的抗肿瘤活性。

2.3抗癌变活性物质研究

国内外学者已经从海洋细菌、放线菌和真菌的培养物中分离到大量的活性物质，有些结构罕见，有些活性独特，有些兼而有之。

美国加州大学(San Diego分校)W．Fenical教授领导的研究小组从约1 m深的红树林淤泥中分离得到1株新海洋细菌Salinospora CNB-392，并从其培养液中发现骨架全新、活性很强的抗癌物。此后2 a即有学者报道该化合物的全合成和比较深入的构效关系研究”，同时还吸引了多位药理学家对其作用特点进行了比较深入的研究。

2.4 抗HIV微生物研究

在过去的20多年里，人们对HIV发病机制进行了深入研究，为艾滋病药物的开发提供了契机。由于至今尚无理想的艾滋病动物模型，抗药物的筛选和研究仍然主要依赖于各种体外(in vitro)的活性研究。

K Gustafson等从1株未经分类鉴定的深海细菌纯化出几个次级代谢产物MacrolactinesA-F，MacrolactinesA．F共同结构是1个24 C的大环内脂。其中MacrolactinesA 表现较强的抗HIV活性，保护淋巴细胞的最高浓度为10μg／mL。目前，已在海藻中发现了不少具有抗HIV活性的天然产物。代表性的如蓝藻门(Cyanophyta)的鞘丝藻(Lyngbya sp．)、纤细席藻(Phormidiumtenue menegh)和钝顶螺旋藻(Spirulina plaltensis)，经藻门植物，褐藻门(Phaeophta)的海带(Iaminariajaponica)等，其活性成分为硫酸多糖。

2.5 酶

在海洋生态环境下，极端微生物的发现和研究，促进了新酶源的开发应用。海洋细菌产生的酶常常具有特殊的理化性质，特别是在极端环境下的高活性和稳定性。

各国在海洋蛋白酶领域都有较多的研究，其中以低温蛋白酶的研究最多。这些产蛋白酶海洋细菌通常具有嗜低温的特性，有些海洋细菌适宜在偏碱性的条件下生长并产酶。笔者在这方面也进行了相关的研究，取得了可喜的进展。某些高温蛋白酶的酶活性和热稳定性可随压力升高而提高，而且升压可以提高深海细菌某些酶的产量。另外，Sunog等从海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonassp．)A28分离出一种蛋白酶，还具有杀灭S．cos um NIES-324的活性。

王鹏等筛选到一株产岩藻多糖酶的海洋芽孢杆菌，可用于催化生产低分子质量的岩藻多糖。医药上用于治疗消化不良、食欲不振的纤维素酶、脂肪酶I2 也逐渐在海洋细菌中寻求发现。日本科学家Sugano等较为系统地研究了海洋弧菌(Vibrio sp．)JTO107的琼脂糖酶。杨承勇等从南海海水中分离到产几丁质酶的弧菌(Vibrio sp．)。此外，新型碱性金属内肽酶、碱性磷酸酶、海藻解壁酶、葡萄糖降解酶、甘露聚糖酶、过氧化物酶、褐藻胶裂解酶等各种酶类在海洋细菌中均有发现。

2.6 酶抑制剂

在酶抑制剂研究这方面有突出贡献的是日本梅泽宾夫的工作，他们筛选了50多种酶抑制剂，已应用于临床的有tation。Cathestatins是海洋细菌产生的一种热稳定性的组织蛋

白酶抑制剂，在治疗骨病等方面具有一定的应用前景 33-。Dioetatin是一种分离自放线菌的新型物质，对二肤酰氨基肤酶有抑制作用，可望用于治疗关节炎等疾病。在海洋假单胞菌中，一种新型的几丁质酶抑制剂也被发现。分离自日本油壶湾海水水样的一种交替单孢菌B-1-31，能产生蛋白酶抑制剂marinostatins，这是多组分的活性物质，研究结果表明marinostatin C活性位点的氨基酸序列明显地不同于陆栖微生物产生的蛋白酶抑制剂。

Kobayashi等从一种黄杆菌(Flavobacterium sp．)中分离出flavoefistamidesA和B，其

对真核DNA复制酶一DNA聚合酶a显示出抑制活性。Kono等从海洋细菌SANK 71896的培养液中分离出了一系列新的活性代谢物B一5354a、b和c，均能抑制鞘氨醇激活酶，其，IC50分别为21、58、38μmol／L 。此外半胱氨酸蛋白酶抑制剂B1371A和B1371B、新的内皮肽转化酶抑制剂B90063 等诸多酶抑制剂都从海洋细菌培养液中分离得到。因此海洋细菌成为新型酶抑制剂筛选的一个重要来源。

2.7 多不饱和脂肪酸(PUFA)

海洋多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)的代表是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。海洋细菌中的EPA是磷脂型的，优于鱼类的中性脂质EPA，没有特殊的鱼腥味，因此从海洋细菌中获取EPA和DHA具有广阔的应用前景。1973年，Oliver等在海洋细菌中发现有多不饱和脂肪酸存在。1977年，Johns等从海洋的多形屈挠杆菌(Flexibacter polymorphus)分离得到EPA，证明了原核生物也具有合成PUFA的能力。目前发现的PUFA产生菌全部是深海细菌和极地细菌。Rossello—Mora等通过5s和16S rDNA序列分析，确认这些海洋细菌为革兰氏阴性菌，分别属于：Colwellia、希瓦氏菌(Shewanella)、交替单胞菌、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)和Ferrimonas。其中Co2wellia和希瓦氏菌被认为是生产PUFA的主要海洋细菌种属。Yazawa1分离到的一株海洋细菌中，EPA含量占总脂的24％—40％，占细胞干重的2％。

2.8 脂肽类生物表面活性剂

生物表面活性剂是一类集疏水基团和亲水基团于一身的两亲化合物，一般是由微生物(尤其是一些细菌和真菌)在一定培养条件下产生的代谢产物，通常为糖脂、磷脂、多糖脂复合物、脂蛋白一脂多肽、羟基化合物和交联脂肪酸等脂肽类生物表面活性剂细菌的信号传导和遗传控制是在复杂的调控网络中进行的，脂肽类生物表面活性剂合成酶基因与细菌多种代谢途径均有相关性。

脂肽类生物表面活性剂的亲水基团由短肽或氨基酸组成，疏水基团由脂肪酸组成，一种脂肽往往是多种异构单体组成的混合体。由于脂肽中的脂肪酸链长和支链数量以及氨基酸的组成具有多变性，致使脂肽表面活性剂的种类繁多。具有代表性的脂肽有surfactin，lichenysin，fengycin，iturin，mycosubtilin,Z及bacillomycin等。其中，B．subtilis 产生的surfactin在sigma公司已经商品化。

大多的脂肽具有抗菌活性，例如surfactin具有明显的抗细菌活性；fengycin有抗丝状真菌和抑制磷脂酶A2芳化酶活性的能力。迄今为止，关于脂肽抗菌活性及生理作用已有很多报道。现在发现的脂肽主要来Bacillus属，如B．subitilis、B．circulans，B．cereus，B．polymyxa，B．mesentericus等，这些Bacillus产生的脂肽类生物表面活性剂结构、功能及生理作用列于表1口u。除-j"Bacillus产生脂肽外，其他一些种类的微生物也产脂肽。例jIHMycobacteriumfortuirum，Streptomyces canus、Pseudomonasfluorescens、Serratia marcescens等。

脂肽类生物表面活性剂主要是细菌的代谢产物，它具有四种显著的生理功能：①降低表面张力，使微生物吸收和代谢水不溶性物质(如烷烃、多环芳烃)，利于微生物在水不溶性物质中生存；②具有抗微生物和昆虫活性，Bernheimer和其他微生物和外援DNA，因此进一步研究感受态形成与脂肽的产生的关系将有助于分析B.subtilis的遗传学特性。另外，由于脂肽的高表活性，科学家们预测这以特性将被应用在油田开发中。地衣芽孢杆菌BAS50产生的JF一2脂肽类表面活性剂的室内实验表明其具有明显的增产原油作用。

2.9 毒素

海洋生物毒素一直是海洋活性物质研究的焦点之一.目前发现，许多海洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋生物上的海洋微生物所产生!其中研究较多的是河豚毒素!河豚毒素（terrodotoxin TTX）是一种毒性很强的海洋生物活性物质，为典型的神经Na+通道阻断剂，毒性为NaCN的1250倍，对人的致死量为0.3mg，临床药用价值很高，可用作镇痛剂、镇痉剂、搔痒镇静剂、呼吸镇静剂等，并具有充血功能、尿意镇静作用及抗心律失常作用等，另据报道，河豚毒素还有抗癌作用，对肝癌抑制率在37%以上，对肉瘤180的抑制率在30%以上.近年来，人们从含有河豚毒素的叉珊藻、毒蟹、河豚、毛颚动物等的体内或体表

分离出的一些细菌中，检测出河豚毒素及其类似物，推测河豚毒素的产生与含毒生物体内共生存的微生物及其食物链有关，目前这一观点已为大多数学者所接受!目前已报道的能够产生河豚毒素的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、发光杆菌属（Photobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、别单胞菌属（Alteromonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）等.Juntongjin 在海洋生物、海水和底质中发现多株能够产生钠离子通道阻断性毒素的细菌.这些毒素主要是TTX及其衍生物..根据毒素的微生物起源学说，如果从自然界或通过基因工程技术筛选一些TTX高产菌株，直接从微生物发酵液中提取TTX，则可大大提高产量，简化提取工艺。日本海洋生物工程研究公司已利用海洋细菌进行TTX生产。

3.0 其他活性物质

从海洋细菌中分离筛选的天然活性产物还有多糖、维生素、氨基酸等，如：Miki W 等(1996)从一种屈挠杆菌(Flexibacter sp．)分离出类胡萝卜素。

4 存在问题和展望

海洋细菌有产生多种新颖独特的生物活性物质的巨大潜力，在药物开发研究中具有良好的应用前景，吸引了国内外研究机构进行了大量的研究和开发，但仍存在着一些问题：(1)活性物质筛选等基础性工作薄弱，有必要建立系统化、规模化、高通量的活性物质筛选方法。

(2)利用现代生物技术手段进行海洋生物活性物质开发刚刚起步，大部分项目还是处于研究的初期。(3)产业化水平低。今后，海洋细菌活性物质的研究重点在于：(1)继续寻找能产生新颖或高活性的生物活性物质的海洋细菌。(2)海洋细菌发酵条件的研究。对于海洋细菌蛋白类活性物质，比如酶等等，可采用基因工程手段实现海洋细菌酶的大量生产．克服海洋细菌培养需要高盐环境、培养液中浓度稀等不足，加速产业化进程；(3)海洋细菌中特定功能基因的研究。比如将海洋细菌酶与陆地酶进行结构和功能上的比较和研究．然后通过蛋白质工程进行酶的分子修饰和改造。(4)海洋细菌活性物质的人工合成研究。随着现代生物技术、生化技术、医学等多学科的介入和联合重点攻关，海洋细菌天然活性物质的研究、开发和应用将取得更快的发展。

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