分子植物病理学实验.

分子植物病理学实验报告

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专业: 植物病理

学号:

实验一水稻总DNA的提取

一.实验目的

通过水稻叶片DNA的提取,掌握提取植物DNA的原理和方法

二.实验原理

十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB), 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA释放出来。再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三.实验材料及仪器

材料:水稻叶片（一般把种子放到培养皿中，让它长到三叶一心时即可，当然也可以从田间采集嫩的水稻叶片来提取DNA）

实验方法: CTAB法

试剂: 液氮，CTAB提取液, 氯仿/异戊醇（24：1）,冰乙醇, 70%乙醇, 超纯水

仪器:台式离心机,水浴锅,移液枪,枪头, 1.5mL或2mL离心管

四.实验步骤

本实验用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：

①将洗净的培养皿内垫上一层滤纸，将水稻种子置于滤纸上，用脱脂棉固定种子，加水保

湿，将其移至光照培养箱（28℃，湿度90%，光照12小时）。一周后即可发芽，发芽后移栽到土里，待幼苗长至三叶一心期时，即可作为提取DNA的材料。

②取三叶一心的水稻幼苗一株，将其剪碎后置于研钵中加液氮研磨成粉末状，移至已灭菌

的2.0mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。

③在离心管中加入已在65℃预热的600μL2%CTAB提取液（0.1M Tris-HCl（pH8.0），20mM

EDTA（pH8.0），8%NaCl，2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）），也可根据样品量适当增加提取液的量，上下颠倒混匀，置于65℃水浴锅保温30min-1h。

④将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积600μL的氯仿/异戊醇（24：1），上下颠

倒离心管使之充分混匀，12,000rpm离心15min。

⑤吸取上清液500μL置于已灭菌的1.5mL离心管，再加入等体积500μL的氯仿/异戊醇（24：

1），上下颠倒离心管使之充分混匀，12,000rpm离心15min。

⑥吸取上清液450μL置于已灭菌的1.5mL离心管，加入同体积450μL在-20℃预冷的冰乙

醇，轻轻颠倒离心管使之混匀，置于-20℃冰箱，放置2h以上，沉淀DNA。

⑦10,000rpm离心10min，倒去上清液，保留沉淀。质量好的DNA应为无色透明胶状物体。

⑧加入400μL70%乙醇漂洗两次除去杂质，10,000rpm离心5min，收集沉淀。置于无菌工

作台风干，直到管底无水珠，此时DNA应为肉眼不可见。

⑨加入100μLTE缓冲液（10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0））或灭菌超纯水

溶解DNA。

最后将提好的水稻DNA放-20℃冰箱保存备用

五.注意事项

1.提取DNA时材料应选择幼嫩叶片,因为嫩叶中DNA含量高老叶片含很多色素，糖

等成分，会对DNA的质量有影响。

2.叶片磨得尽可能细，一般磨成粉状即可。根据本人经验叶片的粗细对DNA质量没

有多大影响;关键是磨好的叶片粉状加到离心管里，不能加得太多，其次是CTAB

的量要够（依据水稻叶片粉末的量而定）。

3.为了得到质量较好的DNA或减少蛋白质的的量，应该用氯仿/异戊醇多抽提几次，

对于老叶片一般至少要抽提3次。当然，有条件的话，最好再用酚抽提一次，以除

去蛋白质，甚至可以加入RNase去除RNA，这样电泳出来的DNA才会没有蛋白质

和RNA。

实验二水稻基因组DNA浓度检测

一.实验目的

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法

二.实验原理

溴化乙锭或花青素可以插入到DNA配对的两碱基之间，当在紫外灯照射下会激发荧光，从而可以看到DNA条带.（由于溴化乙锭有毒，所以本实验用花青素）；由于DNA 含有磷酸基故带负电，在电泳过程中会向正极迁移。迁移率与它的电荷数和分子量有关，分子量越大，迁移率越小。

三.实验材料及仪器

实验方法: 采用花青素或溴化乙锭荧光染色法检测基因组DNA浓度

试剂: 上样缓冲液Loading buffer/花青素(39/1),0.5TBE, 1%琼脂糖

仪器: 电泳仪

四.实验步骤本

取2μLDNA样品与2μL上样缓冲液loading buffer（98%甲酰胺、10mM EDTA、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青）（添加花青素，比例为39：1）混合，将样品加入到0.8%琼脂糖凝胶胶孔中，同时配置已知量的标准DNA（λDNA）溶液（分别为：25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL 200ng/μL）作为对照。200V电泳15min，根据DNA条带的亮度与标准DNA对比，判断样品DNA浓度。

五.实验结果

结果分析：部分泳道没有DNA。从总体上看，很显然DNA里的蛋白质没有抽提干净，最好的解决方法是在把DNA用酚或氯仿抽提几次，甚至可以加入RNase去除RNA，如果要加RNase去除RNA，之后还要在抽提一次，因为RNase也属于蛋白质。

六.注意事项

1.DNA样品与上样缓冲液要混匀

2.胶的浓度一般为0.8%～1.0%。如果缓冲液是TAE一般用一两次就应该换，对于

TBE可以用的时间相对较长。

3.虽然电泳15min作用即可看到有无DNA条带，但有时可以相对延长一点，因为

RNA分子量较小，电泳时间延长会是它跑出去，这样电泳图就相对干净一些。

实验三PCR扩增

一.实验目的

了解PCR的基本原理；掌握PCR实验的操作方法；

二.实验原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

三.实验材料及仪器

PCR扩增仪

四.实验步骤本

SSR引物的选取选择多态性丰富的引物。

按下列反应体系和方法进行PCR扩增：

①根据下表配置反应混和液（一个反应体系）

试剂储液浓度体积（μL）终浓度

ddH2O 12.36

PCR buffer 10× 2.0 1×

dNTP 2.0 mM 2.0 0.2 mM

MgCl225 mM 1.34 1.675 mM

Primer-f 20μM 0.5 0.5μM

Primer-r 20μM 0.5 0.5μM

Taqase 5 units 0.3 1 unit

合计19.0

②取19μL配好的反应混和液加入0.5mLPCR管中，再取1μL（约25ng）模板DNA置于

该PCR管中，振荡、离心混匀，其上滴一滴（约10μL）石蜡油。

③将混匀的反应体系置于PTC10096vPCR扩增仪上进行反应，反应程序如下：

1）预变性，94℃，5min；进入36个循环

2）变性，94℃，40sec；

3）退火，55℃，30sec；

4）延伸，72℃，40sec；

5）最后在72℃延伸10min，产物在4℃保存。

五. 注意事项

1.配置体系时Taqase要最后加,加完后马上放回-20℃保存,以免酶变性;如果是电泳量是很多，最好是先配好反应体系，分成若干管，最后在加入DNA从而可以提高效率。

2.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，这个时间是由DNA决定的，如果是基因组DNA变性时间可以在5min以上，如果是一个DNA片段，则时间可以是3-5min就足够。

3.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G

C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

4.延伸之后，最后在72℃延伸10min，已获得更多的PCR产物。

实验四PCR产物的检测

一.实验目的

掌握PCR产物的检测方法

二.实验原理

溴化乙锭或花青素可以插入到DNA配对的两碱基之间，当在紫外灯照射下会激发荧光，从而可以看到DNA条带.（由于溴化乙锭有毒，所以本实验用花青素）；DNA于带有磷酸基故带负电，当在电泳过程中会向正极迁移。迁移率与它的电荷数和分子量有关，分子量越大，迁移率越小。

三.实验材料及仪器

电泳仪，1.2%琼脂糖胶，6%聚丙烯酰胺凝胶

四.实验步骤

1.PCR产物的检测

① PCR产物用1.2%琼脂糖胶检测，Marker为DL2000(6个条带：100、250、500、750、1000、

2000bp) ，根据DNA条带的位置与DL2000对比，判断样品DNA大小。

②PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶分离，再经染色和显影，即可见清晰的DNA条带。电泳

在DYCZ-28B（D）型电泳槽（北京六一仪器设备厂）上进行。

2.PCR产物的变性

加与PCR扩增产物等量的上样缓冲液（Loading Buffer）至装有PCR扩增产物的离心管中，用旋涡混合器混匀后，4,000 rpm/min离心片刻（几十秒），95℃5min变性，然后立即置于冰上或4℃冰箱。

3.琼脂糖凝胶电泳

结果分析：PCR扩增产物在1500bp到2000bp之间，与预期条带大小吻合。

4.垂直板电泳

1）6%聚丙烯酰胺凝胶的制备

①用洗涤剂清洗玻璃，直到水不聚集成滴也不成股下流，然后将玻璃晾干。

②取晾干的长短玻璃各一块，装好封条，用夹子夹紧，用1.0%琼脂糖凝胶（用前加热熔化）

封住底边。

③在烧杯中配置60mL6%聚丙烯酰胺凝胶（配制方法见附录），最后加变性剂过硫酸胺和

TEMED。

④用烧杯将溶液缓缓倒入两块玻璃板间，防止产生气泡。倒满后插上梳子。

⑤灌胶1小时后即可使用，也可将胶放置过夜。待胶凝固后在两块玻璃的缺口处加少许

1×TBE以防止干燥。

2)上样和电泳

①凝胶制好后拔掉梳子。

②在槽中加入1×TBE，液面不能低于短玻璃的上边。

③接通电源，300V预电泳半小时。

④预电泳结束后关闭电源。取变性后的样品1.2μL加入点样孔，300V恒定电压电泳约1

小时20分钟，直至二甲苯青带（蓝色带）跑至胶的三分之二处，电泳结束。

3)染色及显影

①电泳完成后，从胶板上剥离的胶置于200-400mL 0.075%AgNO3溶液中染色15-20min；

②用去离子水漂洗1-2次，将胶置于200-400mL 1.5%NaOH溶液（其中还含0.4%甲醛）中

显影，10-15min后可见清晰的DNA条带；；

③用数码相机拍照，存入电脑已备统计。

4)实验结果

右边数除了marker 第一条条带为本人实验结果。

六．注意事项

1.制垂直板时,两侧的夹子不能太紧,否则制出的胶厚薄不均，而且还可能会导致电泳过程中局部温度过高，造成玻璃板破裂。此外，所加DNA和buffer的量不能过多，若过多则电泳出来的结果反而不清晰。

2.底部和两侧一定要用琼脂糖胶封严实,保证不能漏胶；否则会造成所制的聚丙烯酰胺胶不够。

3. 在染色过程中最好左右或前后晃动盘子，从而使染色液均匀地染色，以使DNA条带更清楚；NaOH显色不易过长,否则胶容易变黑。

实验五：实验结果分析软件－population genetic analysis、NTSYSpc简介及其

应用

一、实验内容

population genetic analysis、NTSYSpc资源和相关问题；

population genetic analysis、NTSYSpc的应用（单机版）；

深入了解population genetic analysis、NTSYSpc。

二、实验材料：

计算机、网络、、