西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选
抗体技术研究进展_人源抗体技术
第33卷第5期暨南大学学报（自然科学版） Vol．33No．52012年10月 Journal of Jinan University （Natural Science ） Oct．2012 ［收稿日期］2012－03－26 ［基金项目］国家自然科学基金项目（81202449）；广东省科技计划项目（201213010300016）［作者简介］向军俭（1952－），男，教授，研究方向：抗体技术与应用 抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术 向军俭，童吉宇，王 宏 （广东省分子免疫与抗体工程重点实验室；暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632） ［摘 要］100年来，抗体的发现为人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测发挥了巨大的作用．特别是1975年 发明了单克隆抗体技术以及1986年发明基因工程抗体技术，为研制特异性高、大量均一并大量生产抗体成为了现实，也使嵌合抗体、全人源抗体造福人类并产生巨大的经济效益．为了克服鼠源性单抗可诱发人抗鼠抗体（HA-MA ），通过嵌合抗体、改构抗体、小分子抗体等技术和改良抗体与抗原结合的特异性，已成为抗体技术研究的主要发展方向，本文主要就抗体人源化及抗体分子小型化，抗体功能复合化两个部分的进展进行综述．［关键词］抗体； 人源化抗体； 基因工程抗体； 抗体库技术； 小分子抗体 ［中图分类号］R392．11 ［文献标志码］A ［文章编号］1000－9965（2012）05－0524－07 Recent advances in antibody technique （1）：Humanized antibody technique XIANG Jun-jian ，TONG Ji-yu ，WANG Hong （Guangdong province Key laboratory of Molecule Immunology and Antibody Engineering ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ） ［Abstract ］In the past 100years ，antibody has played a significant role in human disease diagnosis and treatment and the analysis of detrimental substances．Especially ，the inventions of both monoclonal antibody technique in 1975and genetic engineering technique in 1986，on one hand ，have made it possi-ble for producing abundant antibodies of high specificity and homogeneity ，on the other hand ，help chim-eric antibody and fully human antibody bring benefit to human beings．To overcome the problem that mu-rine monoclonal antibody may induce HAMA ，technologies such as chimeric antibody ，reshaping antibod-y ，small-molecule antibody and improvements of the specificity between antibody and antigen have be-come the main trend when developing antibody technique．This review gives an overview on antibody hu-manization ，small-molecule antibody and composite function of antibody．［Key words ］antibody ；humanization antibody ；genetic engineering antibody ； antibody library technique ；small-molecule antibody 19世纪末抗体首次被发现，其后很长一段时间内人们都以抗原免疫动物获得抗血清（多克隆抗 体）．1975年， K hler 和Milstein 建立了B 淋巴细胞杂交瘤技术，为大量生产均一、特异性强的单克隆抗体提供了技术支持并使免疫学发生一场革命，有力 地促进诊断与治疗性抗体的发展．然而由于单克隆 抗体大部分为鼠源性抗体，在临床治疗中可在人体 内可诱发人抗鼠抗体（HAMA ）［1］ ，限制了单克隆抗体在临床治疗中的应用．随着基因工程技术的发展和对各类抗体结构和氨基酸序列、及其变异种属和
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
抗体库富集实验步骤
纳米抗体库富集步骤： 1）抗原包被、宿主菌接种：取30μg抗原，溶解到1ml包被缓冲液（pH=9.6）中，加入到Maxisorp免疫试管（Thermo Nunc）中，4℃静置12h； 从平板上挑取一个TG1单菌落至10ml 2×TY培养基中，37℃摇床摇过夜，次日重新1：100接种用于筛库； 2）封闭：免疫试管PBST、PBS分别清洗5次，3% BSA 3ml加入到免疫试管中，于混合器上缓慢滚动封闭2h； 3）准备宿主菌：过夜菌以1:100的比例提前2.5h（相对于第六步侵染）重新接种于新鲜的2×TY中，于37℃摇床扩增培养，保证在第6步侵染时OD600达到0.4~0.6（大肠杆菌OD600=1.0，大肠杆菌浓度为109/ml左右）； 4）加抗体库：免疫试管PBST、PBS分别清洗10次（每次洗液需静置几秒钟），加入500μl原抗体库+500μl3% BSA，微量振荡器上室温剧烈滚动1h，然后室温静置1h； 4）酸洗脱：免疫试管PBST、PBS分别清洗10次（每次洗液需静置几秒钟），尽量倒干管内液体，以免残留液影响到下一步洗脱液的pH值，而影响洗脱效果； 洗脱液10mM的HCl（pH=2.0）800ul（应少于抗原包被量）加入到免疫试管中，室温剧烈震荡30min后，将洗脱液转移到到无菌的50ml离心管中，用260μl Tris-HCl（pH=8.0）中和至pH值7.0左右），大约可以洗脱106~8个纳米抗体噬菌体； 5）侵染TG1：向上所得洗脱液中加入5ml新鲜的TG1（OD600=0.4~0.6），混匀后，37℃静置40分钟，然后将侵染液稀释1000倍（取侵染液1μl加入到1ml的2×TY液体培养基中），然后分别取10μl、50μl稀释液分别涂布于Amp平板上（同时进行阳性和阴性对照），平板倒置于37℃孵箱内孵育过夜，根据平板上的细菌数目计算从免疫试管上洗脱下来的噬菌体的数目； 6）M13K07侵染：剩下的侵染液加入5ml新鲜的2×TY于37℃摇30分钟，然后加入5μl 的M13K07（约1011个噬菌体），37℃放置1h，4500rpm室温离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2×TY培养基中，加Amp至100ug/ml，Kan至50ug/ml，葡萄糖加至1%，30℃，200rpm摇16-20h； 7）纯化富集抗体库：将过夜菌转移到无菌50ml离心管内，4800rpm，4℃离心20分钟，上清液转移到新管中，按照1/5的体积比例加入40%PEG 4000＆2.5 M NaCl 液，强烈震动后冰浴30分钟。4800rpm，4℃离心20分钟，弃上清，沉淀重悬于1ml无菌PBS缓冲液中，然后再于12000rpm，室温离心5分钟，取上清，即为筛选第一轮的抗体库； 8）滴度测定：OD268进行滴度测定，当OD268=1.0时，噬菌体的浓度为5×1012个/ml； 9）第2、3、4、5轮次，可以按照以上步骤重复。 Nunc孔筛选与免疫试管筛选操作上的不同： （1）包被：先于37℃包被1h，然后于4℃包被过夜（250ul/孔）； （2）封闭：分两步封闭，先是乙醇胺活性位点封闭，然后再BSA等非活性位点封闭； （3）清洗：在BSA封闭之前都只能用PBS清洗孔，BSA封闭完后再用PBST，
噬菌体抗体库技术及其应用研究进展
综述doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．04．031 噬菌体抗体库技术及其应用研究进展 潘博1，2，童贻刚1 1．军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京100071； 2．东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030 ［摘要］噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术，它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。它以其独特的构建和筛选系统，彻底改变了抗体制备的传统途径，使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段，并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。我们简要综述此项技术的研究应用进展。 ［关键词］噬菌体抗体库；抗体人源化；抗体工程技术 ［中图分类号］R392．1［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)04－0581－05 Phage Antibody Library Technology and its Application PAN Bo1,2,TONG Yi－Gang1 1．State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071;2．College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Haerbin150030;China ［Abstract］Phage－displayed antibody library is a new thchnique which has been developed very rapidly and leads to revolution in the area of antibody engineering in recent years．This technology employes an unique system of antibody construction and screening,and changes the classical method of antibody preparation completely．It pro-motes antibody engineering,into a new developing stage and improves many other technologies in biological fields．So far phage antibody library is the most developed and widely applied technique in the field of antibody prepara-tion．In this review,we focused on the progress of this technique． ［Key words］phage antibody library;antibody humanization;antibody engineers and technicians 抗体是机体防御系统的重要分子，用于识别和清除外来入侵物。自19世纪末发现抗血清能中和细菌毒素以来，制备抗体技术的研究经历了3个发展阶段。第一阶段为抗血清多克隆抗体，即第一代抗体。第二阶段始自1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein应用杂交瘤技术制备了鼠单克隆抗体[1]，即第二代抗体。这类抗体具有纯度高、特异性好、能无限传代等优点。然而，当把第二代单克隆抗体应用于人类疾病治疗时，由于单抗的异源性特点，常会引起人抗鼠抗体（human anti－mouse anti-body，HAMA）反应，导致治疗不能持续有效地进行。虽然人们一直希望用这种技术制备出人单克隆抗体，但却因人的染色体易丢失、杂交瘤不稳定、产量低及亲和力差等因素，用人杂交瘤技术[2－3]制备人源单抗进展缓慢。因此，围绕着如何生产人源化单克隆抗体，对现有鼠源性单克隆抗体进行人源化改造等问题，第三代抗体—— —基因工程抗体应运而生，它包括嵌合抗体、改形抗体和用抗体库技术制备的抗体。目前，抗体工程领域中最突出的研究进展就是噬菌体抗体库技术。该技术的出现开创了一条简便、快捷的基因工程抗体生产路线[4]，并在许多领域得到了广泛应用，已显示出强大的生命力。 1噬菌体抗体库技术的基本原理 噬菌体抗体库技术的产生主要依赖于3项技术的进展：一是PCR技术的出现，使人们可以用一套引物，通过RT－PCR，直接从总RNA中克隆出全套免疫球蛋白可变区基因[5]；二是大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段获得成功[6]；三是建立了噬菌体表面展示技术[7]。在此3项技术的基础上，噬菌体抗体库技术的操作路线变得十分便捷。其 ［收稿日期］2010－01－13 ［作者简介］潘博（1984－），男，硕士研究生， （E－mail）panbo198401＠yahoo．com．cn
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2
0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。 b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。 c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。 d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。 e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。 f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。 h、加底物
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直
噬菌体抗体库技术(1)
噬菌体抗体库技术 张爱华 余模松 【摘要】 噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来。这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述。 【关键词】 噬菌体展示技术;噬菌体抗体库技术;免疫抗体库 【中图分类号】R 392.11 【文献标识码】A 【文章编号】1673-4211(2006)01-0013-04 作者单位:430060武汉生物制品研究所免疫学研究室 20世纪80年代,随着DNA 重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[1]。 1 噬菌体展示技术 1985年Smith [2]首次阐述了噬菌体展示技术,该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因,通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。 蛋白质可以展示在更小的丝状噬菌体颗粒的表面,这就是噬粒展示系统[3] 。噬粒的基因组中包含丝状噬菌体的基因间隔区,包括病毒颗粒和互补链合成的复制起始点以及发夹包装信号,同时也含 有质粒的复制起始点和抗性基因。噬粒也可以像质粒一样操作,假如需要,可以直接在细菌中表达目的蛋白。采用丝状辅助噬菌体感染细菌可以激活噬菌体的复制起始点,从而导致单链噬粒DNA 被包装进由辅助噬菌体蛋白形成的丝状噬菌体样的颗粒中,由于辅助噬菌体缺乏包装信号,所以产生的大多数噬菌体为含有噬粒单链DNA 的颗粒[4],将这种噬粒和噬菌体混合物感染细菌,筛选具有抗性的克隆,这种带抗性的克隆只含有噬粒DNA,可再次通过辅助噬菌体的感染进行扩增。由于噬粒颗粒可以传播抗性基因,所以有时又把这种颗粒称为“转导颗粒”。 p Ⅲ蛋白是一种最常用于展示外源片段的噬菌体外壳蛋白。其缺点是每个噬菌体颗粒表面仅有5个p Ⅲ分子,但是它的优点是带大的插入片段的p Ⅲ分子可以被很好地包装进噬菌体颗粒中。在绝大多数情况下,外源蛋白插入在信号序列和p Ⅲ蛋白第一结构域(N 1)的起始位点之间,一方面外源蛋白不影响噬菌体的包装,另一方面,外源蛋白位于包装颗粒的最末端,所以当通过p Ⅳ蛋白孔时,其空间位阻较小。但问题是大片段的插入降低了噬菌体的感染能力,甚至使噬菌体无感染性,因此限制了某些特殊蛋白的选择。这一问题可以通过杂交噬菌体得到解决,即仅有一个p Ⅲ分子用于展示蛋白,具体方案是将外源蛋白构建到噬粒载体中,转化细菌后,再用辅助噬菌体超感染,这样细菌中的大多数p Ⅲ蛋白为来源于辅助噬菌体的野生型分子[5] 。噬菌体展示活性蛋白的能力主要依赖于以下几个方面的因素,比如融合蛋白能否被正确地转移到细菌内膜,能否正确地折叠,能否在外周质中逃避降解以及能否被包装进噬菌体颗粒中。外源蛋白也可以插入到p Ⅲ蛋白的N1和N2以及N 2和CT 结 ? 13?国际生物制品学杂志2006年2月第29卷第1期 Int J Biolog icals,February 2006,Vol 29,No.1
应用噬菌体抗体库技术制备抗体
湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级：08C生工 姓名：李栋学号：200842145118 课程论文题目：应用噬菌体抗体库技术制备抗体 课程名称： 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
应用噬菌体抗体库技术制备抗体 李栋 生物科学技术学院08C生工200842145118 摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。 关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体 噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线. 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型
人抗体Fab段天然抗体库的建立
人抗体Fab段天然抗体库的建立作者：韦晓明, 苏明权杨安钢, 温伟红, 郝晓柯 【摘要】目的: 提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA, 利用反转录PCR方法, 建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。方法: 收集健康者外周血, 提取淋巴细胞, 以淋巴细胞mRNA为模板, 扩增人抗体Fab段, 连入载体pComb3内, 利用电转化的方法, 构建噬菌体抗体库。结果: 最终建立了重链库为1.73×107, 轻链库为8.52×104的天然抗体库, 并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库 1.21×107, 轻链库4.26×104, 所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。结论: 成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。 【关键词】天然抗体库; Fab; 反转录PCR 自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］, mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、防治及基础理论研究等领域, 取得了令人鼓舞的结果。但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（human anti mouse antibody, HAMA）, 它不仅使治疗用mAb迅速失去效用, 而且会引起过敏反应。为此这些年来, 人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。噬菌体抗体库是近十几年来发展的一种新的技术［2, 3］, 它
使mAb的应用得到了进一步的推广, 而且被广泛应用于mAb人源化, 抗体亲和力提高等技术中。本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库, 从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。 1 材料和方法 1.1 材料淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心; TRIzol reagent、反转录试剂盒购自Promega公司; DEPC购自Sigma公司; 引物合成由大连宝生物公司合成; mRNA纯化试剂盒、 Taq DNA聚合酶购自Invitrogen; DNA凝胶纯化试剂盒购自上海华舜公司; 蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司; E.coli XL1Blue菌株为本室保存; 载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。LB（蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl: 10 g/L, pH7.0）、 GYT（丙三醇100 mL/L、酵母提取物1.25 g/L、蛋白胨 2.5 g/L, pH7.0）、 SOC（蛋白胨20 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 0.5 g/L、 2.5 mmol/L KCl、 10 mmol/L MgCl2、 20 mmol/L 葡萄糖, pH7.0）等培养基为本室配置。PCR仪购自PE公司; 电泳仪购自BIO RAD公司; 台式高速离心机购自上海安亭科学仪器厂; 高速冷冻离心机购自湖南仪表仪器总厂离心机厂; 紫外分光光度仪购自Beckman公司; BIO RAD gene pulser II 电脉冲基因转移仪购自BIO RAD公司。
单克隆抗体制备过程中的两次筛选
单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HA T培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。
抗体展示
噬菌体抗体库技术的诞生和迅速发展，则为犬瘟热的防治研究提供了新的思路和方法。噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。噬菌体展示技术目前以噬菌体展示抗体的应用最为成熟，噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例。它可以模拟体内B淋巴细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。建库时一般先从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA，设计核酸引物，用PCR技术扩增出所需要的整套的抗体基因片段，通过抗体轻链和重链基因的随机重组，构成单链抗体基因，如Fab或scFv，将其插入噬菌体或噬菌粒表达载体中，与噬菌体外壳蛋白基因连接，感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面，形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库。利用抗原－抗体的特异性结合进行淘选，获得能与抗原特异性结合的阳性克隆。 噬菌体抗体库技术是基于噬菌体表面展示技术发展起来的一项基因抗体工程新技术。它将含亿万种基因的抗体可变区基因库转化成展示在噬菌体表面的蛋白库，不仅使对于具备所需属性的单克隆抗体筛选能更方便、快速、高效地在体外进行，还开辟了单克隆抗体的新途径，揭开了单克隆抗体生产的历史新篇章。噬菌体展示技术不需经过杂交瘤，甚至不需经过免疫，直接从B细胞mRNA反转录的cDNA扩增出抗体基因，避免了从取脾细胞融合到获得稳定克隆株的繁琐过程。用杂交瘤技术制备单克隆抗体是抗体工程中最经典的方法，噬菌体展示技术与之相比，具有很多优点：它的筛选范围从几千扩大到几百万甚至几亿，可筛选不同亲和力的抗体，而且简单、快速、高效。 利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体，随着此项技术的发展，噬菌体抗体库技术将为未来十年的药物研制和靶分子确定提供研究工具和发展平台。噬菌体抗体库技术发展至今，已可在两周内根据各种分子筛选出相应的具有高亲和力的抗体。它在考虑到抗体分子的大小、价数、亲和力及效应区功能的同时简化了抗体生产程序。McCafferty按照设计的实验步骤将Fabs，单链Fv展示于丝状噬菌体表面，噬菌体抗体库产生的抗体有中度的亲和力，分离常数在10-5 mol/L～10-8mol/L时，展示的抗体可被靶分子结合而被筛选出来。除此之外，抗体片断还可通过某些方法如形成二聚或多聚体分子来增加结合部位，以达到增加抗体的亲和力或价数的目的。