实验六、抗菌药物的体外药效试验

实验六、抗菌药物的体外药效试验

（药敏试验）

各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。

［目的要求］

1、熟悉体外抗菌试验操作技术。

2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。

［实验原理］

常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。

1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。

2、培养基：选MH(Muelkr-Hintop)培养基。链球菌、流感杆菌需接种到巧克力琼脂平板或加5％羊血。淋球菌接种到哥伦比亚培养基上。

3、药物配制：试验样品与阳性对照药品均应用称重法求出效价并按盐基比例折算出实际效价。所试药物用磷酸缓冲液或灭菌注射用水溶解，配制成溶液。少数难溶药物可加少许相应助溶剂，再用缓冲液或灭菌注射用水稀释至所需浓度。

4、试验方法：

①最小抑菌浓度(MIC)测定法，采用平皿或试管二倍稀释法测无细菌生长

平皿或试管中所含药物的最小浓度即为最小抑菌浓度。

②最小杀菌浓度（MBC）测定法，先测出MIC，再依次存未见细苗生长

各管培养物分别吸取0.1ml，倾倒于平皿上，37再培养18小时，平皿

上菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。

③杀菌曲线（KCs）实验，将所试菌液约105菌落计数单位(CFU／ml)

与抗菌药物混合，定量取样于平皿培养基，孵育后计算其活菌数，并

绘制出时间杀菌曲线。实验应设空白对照管与已知药物对照试验。

5、培养条件对MIC的影响：

①pH值的影响，将培养基的pH调整，测定药物对所试细菌(临床常见致病

菌)1～2株MIC的影响。

②细菌接种量的影响, 在其它条件不变时改变细菌接种量，比较不同菌量

对MIC的影响。

③血清蛋白结合的影响：如采用25％、50％、75％等不同的血清浓度与不

含血清的培养基观察血清含量对MIC的影响。

［试验内容］

（一）滤纸片法（圆纸片扩散试验）

［材料］无菌平皿1只, 无菌1ml吸管1支,无菌小滤纸片, 待检药（1个平板可做1种或多种药物实验）, 琼脂培养基（瓶装或定量分装15～20ml于大试管，灭菌，备用）, 实验菌肉汤培养基，镊子，95％酒精等。

［方法］

①琼脂培养基置于水浴中加热融化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸

取菌液（制备每只平板约需0.1～0.2ml）加入琼脂培养基中，迅速混

匀，倾注于无菌平皿内，素转动平皿使细菌均匀分布其中，水平放置

待凝（也可预先在平皿中铺一层琼脂培养基作底层，冷却后再加一薄

层含菌琼脂培养基，如此，可使抑菌圈更加清晰）。

②镊子沾酒精后通过火焰，烧灼灭菌，反复3次，镊取无菌滤纸片，浸

沾药液，贴于平板表面，各纸片间的距离药大致相等。③37℃培养一

昼夜后，观察此滤纸片周围有无抑菌圈，并量取其直径。抑菌圈即无

菌生长区，药液在一定浓度范围内，抑菌圈的大小表示抑菌作用的强

弱。

［结果判定］根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度。依次可分为：高度敏感，中毒敏感，低度敏感，不敏感四种。细菌对磺胺类药物的敏感度的标准，按Hawking所定，若磺胺药物浓度在每毫升10μg即能抑制细菌生长者，则该细菌对磺胺药很敏感；如需每毫升50μg才能抑制生长，为敏感；每毫升1000μg才能抑制为中度敏感；每毫升超过1000μg 仍不能抑菌者，则为耐药菌株。

（二）试管稀释法

［材料］菌种：金黄色葡萄球菌肉汤培养物；培养基：普通肉汤；抗菌药物：含青霉素64IU/ ml；其他材料：麦氏比浊管，灭菌1 ml刻度吸管，橡皮胶头，无菌试管。

［方法］以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例。将1ml/管排成一列，编上19的管号，在第一个管内加入含64IU/ ml青霉素肉汤1 ml。混匀后吸取1 ml到第二管，混匀，再取1 ml至第3管，以此类推至第八管。第9管不含青霉素的肉汤做为对照管。然后每管加入0.1 ml含菌当量相当于麦氏比浊管第1管1/2的金黄色葡萄球菌（相当于1.5亿/ ml），操作术式见表

（三）平板稀释法

［材料］无菌平皿，5 ml 无菌吸管，1 ml 无菌吸管，10 ml 无菌吸管，无菌试

管，待检药液，灭菌蒸馏水，缓冲液（pH 依药物稳定性而定），实验菌肉汤培养物，琼脂培养基（大试管定量分装成9 ml/支）。

［方法］

1、细菌蒸馏水或缓冲液把待检药液配成一系列浓度梯度：1：1，1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，（方法同试管稀释法中的二倍稀释）。

2、将每种浓度的待检药液1 ML ，加入9ML50～55℃琼脂培养基中，迅速混匀倾注于无菌平板中，制成一系列药物浓度递减的平板。

3、对照不加药液，即将培养基直接倾入无菌平皿，待冷凝即成。

4、将不同试验菌经适当稀释后，点种再含药平板及对照平板上，接种量约为10CFU/点(colony-forming unit,CFU 菌落形成单位)。

5、37℃培养18～24小时后，观察药物对试验的最大稀释度，再乘以10，得出最大抑制稀释度（即MIC ）。

［注意事项］

1、实验中所用试管、吸管。棉签、镊子、纸片及各种药液配制均应无菌，并按照生物实验常规进行操作。

2、滤纸片法：①到平板时，平板中琼脂培养基的厚薄需均匀一致，以免影试管号

1 2 3 4 5 6 7 8 9 药物浓度（μ

g ）

32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 肉汤（ml ）

1 1 1

1 青霉（ml ） 1 1 1 1ml

细菌（ml ）

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

响抑菌圈大小。琼脂板的厚度可影响抑菌圈的大小，一般为2～3mm。②制备含菌平板时，应特别注意混入菌液时的温度，不能太高，以免烧死细菌。菌液和培养基混合后应迅速摇匀，使均匀分布。③培养温度和时间以37℃、18小时最佳，要求温度均匀。培养石匠过场可能影响抑菌圈的清晰度。④滤纸片沾取药液时不要太多，以免再平板中流淌，影响抑菌圈形状和大小。

3、试管稀释法：①稀释的准确性每稀释一种浓度换一支吸管，较一支吸管稀释到底准确些。②加入菌液的浓度菌液浓度大时，则最小抑菌浓度药高，反之亦然。③菌龄一般认为幼龄菌较敏感，所以多用细菌的6小时培养液。

［思考题］

1、怎样判断最后的结果时抑菌还是杀菌？抑菌浓度大还是杀菌浓度大？

2、用试管稀释法测定药物的最低抑菌浓度时，主要有哪些因素影响试验结果？

3、如药物是一种脂溶性或不太溶于水的物质，是否也可以测定其最定抑菌浓度？如可以，如何进行？

4、比较青霉素G钠、庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢呋新、诺氟沙星在体外抑菌的强弱。

5、体外筛选具有抗菌作用的药物能否直接应用于临床? 为什么?

实验七、抗菌药物的体内药效观察

在体外实验中呈现抗菌作用的药物还可能由于毒性大或体内过程、代谢动力学等原因，在体内发挥不出抗菌效果，需进一步了解其对感染动物是否有效。体内实验不仅测定敏感性，还包括影响新药治疗的其他的变化因素，如宿主反应，药物到达感染部位的能力，药物的灭活等。如果在体内也有效，且毒性不大，才有可能过渡到临床，另外，还应注意许多体外无抗菌作用的中草药用于治疗感染性疾病可能会有较好疗效。

［实验目的］

1、了解细菌感染实验治疗方法的基本过程；

2、观察青霉素的体内抗菌作用及ED50的测定。

［实验材料］

1、实验动物及选择原则：小白鼠30只（18～22g ）；选用有合格证动物提供的健康小鼠，体重18～22g ，雌雄各半，随机分组，每组动物至少10只。

2、实验器材及药品等：注射器(1ml)；小试管；试管架；MH 培养基；金黄色葡萄球菌液；5％胃膜素悬液；青霉案G 钠；2.5％碘酊；70％乙醇；5％石炭酸溶液。

3、感染菌种：根据所试药物的抗菌作用特点选择不同菌株进行试验。常用致病菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠杆菌、氏肺炎杆菌、杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌等。试验广谱抗生素时感染菌株应包括金葡菌与革兰氏阴性菌各l ～2种。创新与阴性菌均需作2种以上，每一种菌2株以上，并包括有临床分离的致病菌。

［方法］

1、菌液制备：将保存的金黄色葡萄球菌接种MH 培养基中，于37℃培养，16-18小时。用平皿表面计数法测定实验感染用的活菌数(如条件一致，则不必每次测定)。将上述菌液用生理盐水以10倍顺序稀释为10-1、10-

2、10-3…等不同浓度菌液；再取此不同浓度的菌液1ml 加5％胃膜素悬液9ml 。即做成浓度力10-2、10-

3、10-4...的菌悬液用。

2、预试验：将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射于3～5只小鼠，每只0.5ml ，观察其死亡情况。正式实验时选用最小致死量，即感染后引起小鼠80-100％死亡的菌液浓度进行感染。常用的病菌的参考用量见本实验附录。肺炎链球菌和链球菌的腹腔感染可不用胃膜素稀释，而是将在血清MH 培养基中培养16-18小时的菌液腹腔注射0.2～0.5m1，观察24-48动物死亡情况。

①感染菌量：感染前需先测出所试菌株的最小致死量(MLD)，即能引起80-00％动物死亡的菌液浓度)作为感染菌量。

②感染途径：菌源液用5％胃膜素(或干酵母)稀释至所需浓度，经腹腔或尾静脉注射相当于100％致死量的菌液感染小鼠。

3、实验治疗：取18～22g 的小鼠30只。雌雄均可，雌者须无孕。按性别体重随机分为6组，每组10只。用预试中选定并适当稀释的菌悬液，每鼠腹腔注射0.1ml ，以感染各组小鼠。第1-5组于感染的同时及感染后6小时肌内注射不同剂量青霉素，剂量分别为20万u 、药物名称

剂 量 （mg/Kg ） 对数剂量 X 动物数(只) 死亡动物数（只） ED 50和95％ 可信限 受试药物

对照药物

40万u、9．8万u、6.9万u、4.8万u／Kg体重(亦可实验前根据细菌敏感情况调整用量)。连续观察7天，记录各组小鼠死亡情况。计算半数有效量数(ED50)及95％可信限。实验必需设不给药组与已知同类药物阳性对照组。

［注意事项］

1、本实验须按照生物实驻中处理感染动物常规进行，严防菌液污染。

2、实验样结束后，应将全部接种过菌液的动物不沦死活进行焚化或丢入置有5％石炭酸溶液的缸内，用肥皂洗手后用碘酊及酒精擦手，以防传播疫病。

［报告要点］

实验结果按下表填写并计算该药的半数有效量(ED50)及95％可信限。并根据其半数致死量计算治疗指数。

治疗指数=LD50/ED50

［思考题］

1、抗菌药物的体内抗菌实验包括哪些基本步骤？应如何进行?

2、治疗指数有何意义？

附1：5％胃膜素悬液制备法

称取胃膜素5g放于研钵内，加少量生理盐水研磨，边研边加水，最后加至100ml，于10磅加压10分钟灭菌即可。临用时调整其pH至中性。

附2：活菌数测定法

将培养基的菌悬液依10倍顺序稀释使其浓度为10-1，10-2、10-3、.....10-（即以9ml无菌生理盐水加1ml菌悬液为10-1，依次累推）选求适当浓度的菌悬液0.1ml放在MH琼脂培养基平板上，轻轻推开菌液，注意不要碰到平板边缘，以免影响计数。共作作3个平皿，都放入37℃孵箱，培养18～20小时后计算菌落群数。平板玻璃盖可换为瓦盖(因瓦改能吸水，可免细菌在平板上繁殖成一片)。挑选平板上生长30-300个菌落的平板计数。一般取两个平板的平均数进行计算。根据细菌稀释浓度(一般为10-4、10-5、10-6、10-7)，算出每1ml菌的活菌数。例如10-6两个平板上生长菌落数为68～70个，平均为69/0.1ml，即每毫升有活菌数690×10 6/ml即6.9×10 8/ml。

附3：做小鼠体内实验时常用的细菌的接种量

菌株感染度胃膜素稀释后死亡时间

金黄色葡萄球菌10-210-324h内

大肠杆菌10-310-424h内

变形杆菌10-410-224-48h内绿脓杆菌10-310-448-72h内