植物细胞的悬浮培养技术

毕业论文(设计)

中国·武汉

二○一二年四月

目录

摘要 (3)

关键词 (3)

Abstract (3)

Key words (3)

前言 (4)

1.细胞悬浮培养的定义 (4)

2.单细胞制备的方法 (4)

2.1 机械法 (4)

2.2酶解法 (4)

2.3 愈伤组织诱导法 (4)

3.悬浮培养的条件 (5)

4.细胞初始培养 (5)

5.细胞悬浮培养的类型 (5)

5.1分批培养 (5)

5.2连续培养 (6)

6.悬浮培养细胞的同步化 (6)

6.1 物理方法 (6)

6.1.1 体积选择法 (6)

6.1.2低温处理法 (6)

6.2 化学方法 (6)

6.2.1 饥饿法 (6)

6.2.2抑制法 (6)

7.规模化培养 (7)

8.存在问题与前景展望 (7)

8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)

8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)

8.3前景展望 (7)

参考文献 (8)

致谢 (8)

植物细胞的悬浮培养技术

摘要

悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词

植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学

Plant cell suspension culture technology

Abstract

Because plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technology

Key words

.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology

前言

将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.

三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.

由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.

1 细胞悬浮培养的定义

定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

2 单细胞制备的方法

2.1 机械法

早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball,joshi和noggle曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续的进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜，大豆等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini指出，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触电很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

2.2 酶解法

酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞中间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18中其他草木之物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。

酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦，玉米等叶肉细胞。

2.3 愈伤组织诱导法

以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立

悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散剂，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。

由于一般愈伤组织的细胞并不是均匀一致的，直接由外植体诱导的愈伤组织，若不经过继代则很难获得均匀一致的疏松性。只有在继代培养中不断选择那些疏松性好，细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致，疏松易碎。适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。

由愈伤组织建立悬浮培养细胞系是目前细胞培养多中广泛采用的一种方法。

3 悬浮培养的条件

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；三是生长迅速。要建立良好悬浮细胞系需注意以下事项：

不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特征可使愈伤组织分散成为单细胞或很小的细胞团。诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。

一般用颗粒细小，疏松易碎，外观湿润，鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选，继代稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。

用于培养愈伤组织的培养基，可以继续用于悬浮培养，这种培养基就称为条件培养基，但遇到悬浮细胞变褐，生长很慢或停止等，就要用心得培养基。

悬浮细胞进行继代与选择的方法有：将培养基摇匀，静止片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物（此处细胞团小而均一，胞质浓厚），也可通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。

4 细胞初始培养

细胞初始悬浮培养的做法是，把适宜的愈伤组织转移到三角瓶或其他容器里的液体培养基中，将容器置于摇床上震荡培养。震荡培养作用是：1可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们分散成小细胞团和单细胞；2震荡可以使细胞和小细胞团早培养基中保持均匀的分布；3液体培养基的运动促进培养基和容器内空气之间的气体交换，避免细胞缺氧而抑制生长。

根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡培养方法：即①旋转培养：培养瓶呈360o的缓慢旋转移动，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应。②往返振荡培养：机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。③旋转振荡培养：机器带动培养瓶在平行面上作旋转振动。④搅动培养：利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。

5 细胞悬浮培养的类型

5.1 分批培养

分批培养是指细胞在一定容积的培养中进行培养，目的是建立单细胞培养物。培养初期悬浮细胞处于滞后期，细胞很少分裂；进入对数生长期后，细胞分裂活跃数目迅速增加；经过3~4个细胞世代之后，培养基中某些营养物质已经耗尽，或是有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，进入静止期后，增长完全停止。

5.2 连续培养

连续培养是通过控制加入定量的营养物质使细胞生长率和细胞密度保持不变的一种培养方式，主要用于研究和生产次生代谢物质。

连续培养主要用于大规模细胞培养，通过添加新鲜培养液和排放已利用的培养液来平衡营养水平，使培养细胞长期处于静止期状态。

6 悬浮培养细胞的同步化

细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期由于植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来说是十分困难的。但通过一些物理和化学处理，可以使细胞同步化状态获得一定程度的改善，实现部分同步化。

6.1 物理方法

6.1.1 体积选择法

通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这种方法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不会有其它处理所带来的对细胞活力的影响。

6.1.2 低温处理法

冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。收集细胞，在4摄氏度温度下处理数天，添加新鲜培养液。

6.2 化学方法

6.2.1 饥饿法

饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，而导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可以重新恢复。饥饿导致的细胞分裂受阻，常常使细胞不能合成DNA，即不能进入S期；或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。

6.2.2抑制法

通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期-----G1期的同步化细胞。

7规模化培养

植物细胞培养的工业化需要高投资, 而所得产品浓度和产率都非常低。鉴于这一点, 只有在比传统提取法和化学合成法更经济或无其他生产方法时, 利用植物细胞培养技术才是一种较好的选择。现在一致认为, 产率是限制植物细胞培养工业化的一个重要因素, 例如Drapean等证明只有在C.roseus生产的ajmalincine 的产率提高4倍时, 植物细胞培养法才经济可行。由于产品的产率受次级代谢物的分泌、有机体的生长和生物量的影响, 所以提高产率就要综合考虑生物学和工艺学两方面的原因, 选育稳定高产的优良细胞株和优化培养条件是解决植物培养经济可行性的有效途径川。近几十年, 植物细胞悬浮培养技术取得了飞速发展, 利用悬浮培养生产次级代谢产物也显示出巨大的潜力, 但大部分生产还是在小规模下进行, 真正应用商业化大规模生产的并不多。许多植物细胞培养技术已被申请专利, 但目前事实证明几乎没有几种是经济可行的。除了代谢产物产率低、成本高、操作技术难度大和反应器的设计不成熟等因素外,其最主要的原因还在于培养过程和反应器的难以放大。随着对植物细胞培养特征、培养过程和反应器放大的更深人的研究, 植物细胞悬浮培养的潜能将会更好的发挥出来。

8 存在问题与前景展望

8.1 植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势

植物细胞培养与动物细胞相比有以下优越性：动物细胞大都分为贴壁生长，需要黏附在支持物上，这样使大规模培养受到限制，而植物细胞大部分为悬浮培养。无需支持物，因此可以大规模培养。此外，植物细胞由于具有细胞壁，对剪切力的敏感性要小于动物细胞。动物细胞培养一般需要血清，培养成本较贵。

与微生物相比，植物细胞体积较大，聚集成团，比微生物生长慢，特别是其对剪切力的敏感性要大于微生物，只能在相对低得剪切力下操作，这样势必因为混合不充分而影响营养物质的传递；其次，植物细胞的生理和代谢活动较低，仅要求较低的氧传递速率，过高的通气速率反而抑制细胞生长和产物合成；此外，植物细胞生长缓慢，发酵时间长，维持无菌操作更为困难。

8.2 植物细胞培养过程中存在的困难

植物细胞的长度多为10~100微米，形状多为球形或圆柱形，因细胞分化后不易分离，而且在间歇培养的后期分泌胞外多糖，所以长易聚集成团。聚集体常包括上百个细胞，直径能达几个微米。用图像分析和筛选技术发现不同细胞系，不同细胞年龄，不能培养条件下细胞团的形式也不同。

在反应器中进行培养植物细胞的过程中，有两个限制条件需要考虑：一是在培养后期细胞大量生长，细胞聚集在有限的空间内，使碳和氮传递不均一从而造成细胞的死亡；另外一个限制条件是植物细胞对剪切力敏感是植物死亡的另一主要原因。

8.3 前景展望

对于药用植物来说，细胞悬浮培养的最终目的是利用高产株系进行大规模培养，通过生物和工程技术方法的结合以实现高效生产次生代谢产物。对于研究比较透彻的模式植物，则多在细胞学，生理生化上取得了突破的进展。为生理学和生理生化做出了突出的贡献。近年来，图像分析技术已被用于植物细胞培养过程中细胞颜色，生长速率，形态，聚集体尺寸以及结构的分析与研究，他的优点是操作简单，非侵入性和有针对性的对细胞进行监测。这样使维持高质量细胞生长态势的控制成为可能。这些技术为人们带来了希望，同时要注意的是

在实现大规模工业生产之前必须解决的问题是经济与技术的可行性。由于植物细胞培养可以实现人工调控，成为生产植物次生代谢产物的最有潜力和吸引力的研究领域。同时，为快速有效的诱导抗性植物，进行高产细胞株的筛选和稳定性研究（就是利用转基因和重组DNA技术创造生产快，代谢产物产量高的植物细胞株，并对这些高产细胞株的稳定性进行研究）实现大规模扩繁和人工种子的生产提供了更为有效的途径。

总之，植物细胞悬浮培养有着广阔的发展前景。在人类面临能源危机，资源短缺，环境污染日益严重的情况下，研究与利用植物细胞培养工程其意义尤为深远。

参考文献

[1]刘春朝, 王玉春, 郑重, 等?剪切力对植物细胞悬浮培养的影响。化工冶金，1998,19（4）:379-384.

[2]Scragg A H ,Allan E J,Lekie F E .Effect of shear on the viabillty of plant cell suspensions. Enzyme Microbiol Techmol ,1988,10:361-367.

[3]朱新贵, 郭勇?玫瑰茄悬浮细胞合成花青素的光效应研究:〔学位论文〕.广州: 华南理工大学,1998.

[4]吴兆亮, 胡滨, 元英进, 等?南方红豆杉细胞两液相培养过程动力学。化工学报，2000,51（5）：637-642.

[5]Mirjalili N,Linen J C.Gas phase composition offects on suspension cultures of Taxus cuspidate.Biontech Bioeng,1995,48:123-132.

[6]刘志伟, 郭勇,张晨?植物细胞培养生物反应器的研究进展?现代化工，1999,19（8）：14-16.

致谢

本论文是在我的指导老师王大红的悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到论文的最终完成，王老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持，在此谨向王老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！

感谢武汉职业技术学院生物工程系的全体老师在几年的大学生活和学习中给予的关心和帮助，同时衷心感谢应用化学实验室，生化分离实验室，微生物实验室的实验员老师在我大学期间给予的帮助，才使我的课业能顺利进行。感谢武职制药10303班所有的同学和代课老师，他们让我的大学生活丰富多彩。

最后，我要特别感谢我的家人，没有你们的支持，就没有今天的我。

愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意！