dd细胞内钙离子释放通道IP3受体
医学生
细胞内钙离子释放通道IP3受体
文字表述：关键词： 钙释放通道 信号转导 三磷酸肌醇 受体 第二信使
近年来细胞内游离钙在信号转导中的作用日益受到重视。细胞钙离子的平衡，不仅通过质膜上电压和受体门控的通道入胞，还通过胞内钙释放通道介导的钙释放，形成了释放＆ｓｈｙ；—摄取—结合的完整过程，是影响或决定许多细胞反应的独立的第二信使［１］。此外，细胞内游离钙还与胞浆和胞外钙有着及为复杂的时空动力学关系和多样的作用方式［２］。作为钙释放通道之一的三磷酸肌醇受体（ｉＰ３Ｒ）除了在兴奋收缩耦联中起关键作用外，还参与了神经释放与突触效能改善、细胞周期调控与细胞间通讯、激素分泌、基因表达等活动。钙信号失常也会导致一系列病理过程。
１分子特征与表达
在克隆小鼠 ｉＰ３Ｒ ｃＤＮＡ的过程中，人们已了解其大致结构［３］。该受体有一个跨膜的信点靠近 ｃ末端，在胞浆部分有一长的氨基末端和短的 ｃ末端。比较小鼠、大鼠和人类的 ｉＰ３Ｒ结构， ｉＰ３Ｒ胞浆部分大约有４１８～６５０个 ｎ末端的氨基酸残基是高度保守的，该区域缺失任何一个片断都能取消 ｉＰ３结合活性，提示该区域是 ｉＰ３结合的关键序列。克隆的 ｃＤＮＡ所编码的蛋白实际上同时具备了 ｉＰ３结合和钙通道特性，因此又可称之为 ｉＰ３门控的 ｃａ２＋通道。
ｉＰ３Ｒ的主要序列与细胞质膜上的钙通道无同源性，但与心肌和骨骼肌肌浆网上的另一种胞内钙释放通道 ｒｙａｎｏｄｉｎｅ受体部分同源。 ｉＰ３Ｒ为同型四聚体，每个亚单位结合一个 ｉＰ３分子。大鼠 ｉＰ３Ｒ结构存在含有或缺失４５核苷序列的两种 ｃＤＮＡ克隆，提示有不同的剪接方式，每个亚基有２７３４个或２７４９个氨基酸，分子量２６０ｋＤ［４］。受体结构含３个 ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶作用的序列。因含 ｉＰ３结合、配基门控钙通道和数个调控部位， ｉＰ３Ｒ是目前发现的最大受体之一。
ＩＰ３Ｒ在脑 ｐｕｒｋｉｎｊｅ细胞、海马、脑干呈高表达，亦表达于动脉平滑肌、子宫、膀胱和卵细胞。ｉＰ３Ｒ分布于粗面内质网和外层核膜。在无脊椎动物中， ｉＰ３Ｒ分布很不同，主要集中于脑、感觉和肌肉系统，还有报道 ｉＰ３Ｒ存在于嗅觉神经元质膜、人 ｔ淋巴细胞、内皮、平滑肌和角膜细胞的质膜
上［５］。在大鼠的肾脏， ｉＰ３Ｒ的Ⅱ型分布也不相同，Ⅰ型分布很广，几乎沿整个肾单位分布，而Ⅱ型局限于集合管［６］。
２受体功能调控
在非洲蟾蜍属 ｘｅｎｏｐｕｓ母细胞核外膜上，用膜片钳技术研究了 ｉＰ３Ｒ单通道的特性，发现离子通透性呈现三种电导离状态，通道开放的可能性随时间而变［７］。在脂质双层中研究了单通道水平 ａＴＰ对 ｉＰ３Ｒ的作用［８］，在 ｉＰ３存在时，加入 ａＴＰ可使 ｉＰ３Ｒ开放频率增加４．８倍，通道开放平均时间增加２．５倍，而电导不变。高浓度的 ａＴＰ则通过竞争 ｉＰ３结合位点抑制 ｉＰ＝３Ｒ。 ａＴＰ也增加主动脉微体组分和重构膜中 ｉＰ３依赖的钙释放。
蛋白激酶（ ｐＫＡ）可磷酸化 ｉＰ３Ｒ［９］，磷酸化对配基结合无影响，但能阻止配基引起的钙通道开放。钙离子可能通过与不同的钙结合蛋白相互作用而抑制 ｉＰ３与受体的结合。抗 ｉＰ３Ｒ－Ｃ末端的单克隆抗体可以阻断 ｉＰ３Ｒ的钙通道特性。
对重组脂质体中免疫亲合纯化 ｉＰ３Ｒ钙离子释放动力学研究表明［１０］， ｉＰ３Ｒ介导的钙释放有正协同性， ｈｉｌｌ系数为１．８±０．１，钙离子释放的半数最大初速率出现在 ｉＰ３浓度为１００ｎＭ时，而且一种类型的 ｉＰ３Ｒ就能产生顺序性钙释放，有快慢两种速率常数，提示 ｉＰ３Ｒ有两种钙离子释放状态。
肝素是 ｉＰ３Ｒ的竞争性抑制剂，但同时也抑制 ｉＰ３产生，所以作为工具药价值受限。咖啡因可增强 ｉＰ３介导的钙释放，乙醇是 ｉＰ３Ｒ很强的抑制剂。最近发现 ｎＯ可引发由胞内钙释放引起的容量性钙内流， ｌ－型钙通道阻断剂地尔硫不能阻断这一效应［１１］。 ｇｉ可直接调控 ｉＰ３Ｒ介导的钙释放［１２］。
３受体异质性与亚型
ｉＰ３Ｒ含有２个不同的片断称为 ｓⅠ和 ｓⅡ。前者由 ｉＰ３结合位点的４５个核苷酸组成， ｓⅡ位于两个磷酸化部位之间调控位点内，由１２０个核苷酸组成，又进一步分成３个亚剪接片数 ａ、 ｂ和 ｃ。由此构成了 ｓⅡ＋， ｓⅡ ｂ－， ｓⅡ（ ｂＣ）－， ｓⅡ（ ａＢＣ）－。
来源于不同基因的新型 ｉＰ３Ｒ已有报道，故原先发现的 ｉＰ３Ｒ称为脑型或Ⅰ型受体，而新发现的Ⅱ型 ｉＰ３Ｒ在 ｉＰ３结合和跨膜区与Ⅰ型同源性很高，对 ｉＰ３的亲合力也比Ⅰ型高。最近报道了大鼠 ｉＰ３Ｒ家族中的第Ⅲ型（ ｉＰ３Ｒ－３）的完整序列［１３］。一种组织可能含有来自不同基因或同一基因但剪接方式不同的几种不同亚型受体。提示细胞内存在不同的钙信号传递途径，不同的 ｉＰ３Ｒ转导途径具有不同的调控机制。
大鼠心肌细胞 ｉＰ３Ｒ主要分布于心室肌细胞的闰盘处，相反 ｒｙＲ主要分布于整个心肌的横带中，恰好在三联体（Ⅰ带）的位置。在纵向肌浆网、结合肌浆网、纤维肌膜、线粒体及其囊泡中几乎未见ｉＰ３结合［１４、１５］。放射配基测定显示 ｉＰ３结合在富含闰盘的亚组份中，而 ｒｙＲ结合主要在连接区 ｓＲ中最高，提示 ｉＰ３Ｒ在 ｃａ２＋通过闰盘及心肌细胞间的信号转递中起重要作用，尽管原位杂效显示心肌细胞内 ｉＰ３Ｒ的 ｍＲＮＡ表达水平比 ｒｙＲ低约５０倍。
最近克隆了编码健康人膀胱癌和白血病细胞系（ ｈＬ－６０） ｉＰ３Ｒ－１的 ｃＤＮＡ［１６］，
ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ显示约１０Ｋｂ的 ｉＰ３－１ｍＲＮＡ表达，预测的氨基酸顺序有２６９５个氨基酸，与小鼠 ｓⅠ－／ＳⅡ－剪接和 ｉＰ３Ｐ有９９％的同源性。人 ｉＰ３Ｒ基因定位于人染色体３号３Ｐ２５－２６区，分子量低于小鼠的脑ｉＰ３Ｒ分子量（２５０ｋＤ），而其理论计算的分子量应为３０７ｋＤ。小鼠和大鼠 ｉＰ３Ｒ－１与大鼠 ｉＰ３Ｒ－２和
ｉＰ３－３分别有７０％和６２％的同源性。
４ ＩＰ３Ｒ病理生理意义
在缺血再灌注时，心肌收缩功能障碍与心肌 ｓＲ摄取胞浆钙泵活性障碍，同时钙释放通道释放的钙离子增加［１７］，与临床上心肌再灌注后心肌冬眠有关。在心室肌中绝大多数浦肯野氏细胞中表达的ｉＰ３Ｒ活性明显高于心房和心室肌细胞，心脏传导系统的原位杂交显示 ｉＰ３Ｒ的 ｍＲＮＡ表达水平增加，浦肯野氏细胞中存在 ｉＰ３敏感的钙库和肌浆网。钙结合蛋白、α１肾上腺素能受体兴奋、内皮素 ｉＰ３敏感的钙库释放引起，揭示了神经体液因素调制心肌变时性及心律失常发生中的可能分子机制［１８］。自发性高血压大鼠肌浆网钙释放明显高于 ｗＫＹ的肌浆网，在分离的肌浆网中也有类似现象，但在心肌肥厚中的作用尚不清楚［１９］。
心衰时 ｉＰ３Ｒ在介导心肌细胞调凋亡的过程中起重要作用［２０］。在人心衰终末期时， ｉＰ３Ｒ和 ｒｙＲ呈不同的改变［２１］。左心室 ｒｙＲｍＲＮＡ减少３１％而 ｉＰ３ＲｍＲＮＡ却增加１２５％。原位杂交显示 ｉＰ３Ｒ的结合位点较 ｒｙＲ相对增加４０％， ｒｙＲ的下调可能导致心肌收缩力受损，而 ｉＰ３Ｒ上调可能是一种增加钙离子的代偿反应，最终使心肌舒张功能受限，并参与心肌肥厚和重构。
已发现 ｉＰ３Ｒ在 ｔ细胞激活的信号转导过程中起关键作用［２２］。人血小板存在单一的 ｉＰ３Ｒ，免疫印迹发现血小板含有２６０ｋＤ的多肽，与脑 ｉＰ３Ｒ有交叉免疫反应，免疫荧光显示 ｉＰ３Ｒ主要位于血小板质膜外周［２３］。
５时空性的钙信号传递
由 ｉＰ３Ｒ和 ｒｙＲ介导的时空性钙信号传递在很多方面都与质膜上的电兴奋很相似，胞浆钙变化类
似于膜除极，而胞内钙释放类似于动作电位。再生性的钙释放由 ｉＰ３诱导的局部钙释放所介导，其产生取决于 ｃａ２＋与 ｉＰ３引起的钙释放或 ｃａ２＋和 ｉＰ３作用辅因子操纵 ｉＰ３Ｒ／Ｃａ２＋通道激活或失活之间的平衡。钙释放以再生的方式向周围扩散分布，并将信号传递至核内和线粒体，可能是一种频率编码而非幅度调制的电兴奋信号。
一旦钙信号传递到核，可通过激活和抑制各种转录因子来调控基因表达［２４，２５］。现已发现三种途径：（１）致分裂原激活蛋白激酶，激活或转位胞浆激酶到核内，改变转录因子 ｄＮＡ结合及转录激活的功能。（２）通过信号传递和转录激活蛋白，直接磷酸化胞浆潜在的转录因子。（３）通过核因子（ ｎＦ－κ ｂ）将转录因子从胞浆或抑制蛋白中释放出来，转位到核内，结合至靶序列，激活基因表达。特异性的钙通道可激活各种不同的信号传递途径，调控转录复合体和基因表达。因此，不同钙通道、不同的信号传递途径可作用于基因表达，造成广泛的生理效应。
参考文献
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２１ ｊａｙａｒａｍａｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９５；９２（１３）：６００７～６０１１ ２２ ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ ＬＹ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ，１９９３；１７（８）：７５１～７５８
２３ ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ．Ｊｐｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３；４３（４）：４０９～４３４
２４ ｇｈｏｓｈ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｙｅｎｃｅ，１９９５；２６８：２３９～２４２
２５ ｅｄｗａｒｄｓ ＤＲ．Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ Ｐｒａｘ Ｓｕｐｐｌ，１９９４；１５：２３９～２４５
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钙离子测定
用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth． Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+ 浓度的动态变化。结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。 水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有
胞内游离Ca的测定方法
Pluronic F-127 (F127)美国Molecular Probes Inc.产品。 Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国MERIDIAN Instruments Inc 产品。 1. 光源：Ultima型50Mw UV,200Mw Visible 2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm 3. 扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 100ug Fluo-3/AM 溶于100ul DMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L 方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原液,-20oC避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的Pluronic F-127备用。2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L 染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。 3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。 4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），开始扫描。 5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。 一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定 按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
钙拮抗剂横向比较
钙拮抗剂横向比较 分类：与动脉血管及心脏的亲和力和作用： 1.二氢吡啶类(DHPs), 如氨氯地平、硝苯地平主要作用于血管平滑肌上的L型钙通道, 起到舒张血管和降低血压的作用; 2.非DHPs, 如维拉帕米、地尔硫卓, 对心肌和血管上的L型钙通道作用程度与DHPs相同, 但是对窦房结和房室结处的钙通道有选择性。维拉帕米和地尔硫卓在扩张血管方面较DHPs差, 但是其对心脏的负性变时、负性传导和负性变力作用是DHPs所不具备的。 根据受体结合特性、组织选择性和药代动力学特点： (1)第一代为短效钙离子拮抗剂, 包括硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓等,由于生物利用度低且波动大，药物血浆浓度波动大，用药后快速导致血管扩张和交感神经系统激活，引起反射性心动过速、心悸和头痛；由于此类药物半衰期短、清除率高、作用持续时间短，使其对血压控制时间短，很难实现24小时的有效覆盖，容易引起反射性交感神经激活, 增加心率, 基本不用于高血压的治疗; (2)第二代钙离子拮抗剂的药物，通过改革剂型为缓释或控释剂型使药代动力学特性有了明显改善，也有部分具有新的化学结构，代谢动力学特性有所改善,血管选择性有所提高, 性质稳定、疗效确切, 如硝苯地平缓释片、尼莫地平、尼群地平等, 但其生物利用度仍很低, 峰谷血浆浓度波动较大; (3)第三代为长效钙离子拮抗剂, 以氨氯地平、拉西地平、乐卡地平等为代表, 半衰期长, 可1次/d服用, 因其起效缓慢，作用平稳，持续时间久，抗高血压的谷峰比值高，血压波动小、不良反应小、服用方便且能24h覆盖等特点, 已成为用于高血压治疗的重要钙离子拮抗剂类药物。 拉西地平： (1)肝功能不全者需减量或慎用, 因其生物利用度可能增加, 而加强降血压作用。 (2)本品不经肾脏排泄, 肾病患者无需调整剂量。 (3)虽然本品不影响传导系统和心肌收缩, 但理论上钙离子拮抗剂影响窦房结活动及心肌储备, 应予以注意。窦房结活动不正常者尤应关注, 有心脏储备较弱者亦应谨慎。
钙和镁离子的测定
制盐工业通用试验方法钙和镁离子的测定 1.适用范围 本方法适用于制盐工业中工业盐、食用盐（海盐、湖盐、矿盐、精制盐）、氯化钾、工业氯化镁试样中钙、镁离子含量的测定。 2.容量法 2.1.镁离子含量的测定 2.1.1.原理概要 样品溶液调至碱性（pH≈10），用EDTA标准溶液滴定，测定钙离子和镁离子的总量，然后从总量中减去钙离子量即为镁离子量。 2.1.2.主要试剂和仪器 2.1.2.1.试剂 氨-氯化铵缓冲溶液（pH≈10） 称取20g氯化铵，以无二氧化碳水溶解，加入100mL25％氨水，用水稀释至1L。 铬黑T：0.2％溶液 称取0.2g铬黑T和2g盐酸羟胺，溶于无水乙醇中，用无水乙醇稀释至100mL，贮于棕色瓶内； 三乙醇胺：10％溶液； 氧化锌：标准溶液 称取0.8139g于800±2℃灼烧恒重的氧化锌，置于150mL烧杯中，用少量水润湿，滴加盐酸（1∶2）至全部溶解，移入500mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀； 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：0.02mol／L标准溶液 配制：称取40g二水合乙二胺四乙酸二钠，溶于不含二氧化碳水中，稀释至5L，混匀，贮于棕色瓶中备用； 标定：吸取20.00mL氧化锌标准溶液，置于150mL烧杯中，加入5mL氨性缓冲溶液，4滴铬黑T指示剂，然后用0.02mol／L EDTA标准溶液滴定至溶液由酒红色变为亮蓝色为止。 计算：EDTA标准溶液对镁离子的滴定度按式（1）计算。 T EDTA／Mg2＋＝ W×20／500 ×0.2987 (1) V 式中：T EDTA／Mg2＋——EDTA标准溶液对镁离子的滴定度，g／mL； V——EDTA标准溶液的用量，mL； W——称取氧化锌的质量，g； 0.2987——氧化锌换算为镁离子的系数。 2.1.2.2.仪器 一般实验室仪器。 2.1. 3.过程简述 吸取一定量样品溶液〔见附录A（补充件）〕，置于150mL烧杯中，试验程序同2.1.2.1.标定，EDTA标准溶液用量为测定钙离子及镁离子的总用量。 2.1.4.结果计算 镁离子含量按式（2）计算。
细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书中文版
细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Rhod-2，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下观察相对荧光峰值的变化，来测定细胞线粒体中总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体等）内线粒体钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中线粒体钙离子在调节线粒体代谢、保持线粒体的A TP产量达到细胞需求，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。线粒体钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要线粒体纯化。Rhod-2，罗丹明123（rhodamine 123）的衍生产物，一种与钙离子结合产生荧光，同时其正电荷特性，特异性地聚集在线粒体里，由此用于测定线粒体内钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长550nm，散发波长590nm，来定量测定线粒体的钙浓度。 产品内容 清理液（Reagent A）40毫升 染色液（Reagent B）30微升 介导液（Reagent C）600微升 饱和液（Reagent D）2毫升 阴性液（Reagent E）2毫升 产品说明书1份 保存方式 保存染色液（Reagent B）和介导液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器 细胞培养箱：用于染色孵育 黑色96孔板：用于样品操作的容器
钙离子成像
钙离子成像 一、实验目的 钙是人体的重要组成成份，它广泛分布于全身各组织器官中，正常人体的钙占体重的1.5%-2.0%。在人体中的含量居第五位。钙离子与神经递质的释放、肌肉收缩以及凝血过程等生理过程都有重要关系，因此钙离子的检测对人体了解相关的生理活动非常的重要。 二、实验仪器 硬件设备： ? 1.Olympus 倒置显微镜 IX71 ? 2. TILL单光仪 ? 3.EM-CCD（HAMAMATSU C9100） ? https://www.360docs.net/doc/9617241758.html,puter 软件模块：SimplePCI 6.5 三、实验原理 测量钙离子的合成指示剂分为单波长激发指示剂、双波长激发指示剂和双波长发射指示剂3种。 ①波长激发指示剂：Quin-2 是第1代荧光指示剂，在340 nm处激发，505nm处可观察到结合Ca2+的发射峰强度的增加。用于测定静息状态或接近静息状态下的细胞内Ca2+的浓度，无法检测 1μM以上的Ca2+浓度 ②双波长激发指示剂：Fura-2 Fura-2是第2代荧光指示剂，当介质中无钙时，Fura-2的激发峰为380nm；当与钙结合后，激发峰向短波方向移至340nm，所以采用激发比例荧光测量。进入细胞的Fura-2随时间推移将泄漏到细胞外，所以应尽量缩短测定时间。 ③双波长发射指示剂：Indo-1 Indo-1为单波长激发(340nm)和双波长发射(405和506nm)指示剂，其优点与
Fura-2相同。Indo-1已经在流式细胞研究中广泛使用。测量340nm和380nm激发下的发射荧光强度： F 340和F 380 →R= F 340 / F 380 校准 [Ca2+] i =K d (R-R min )/(R max -R)(nmol/L) R max 是加入0.1%的TritonX-100破坏细胞膜后所得到的最大荧光强度比值； R min 为加入5μM的螯合剂EGTA后测得的最小荧光强度比值。K d 为Fura-2与钙离 子反应的解离常数，大小为224nmol/L. 四、实验结果
钙离子拮抗剂 信心小总结
1 钙离子拮抗剂的应用类型及作用机制 低血游离钙可能引起高血压，其机理与钙对膜的稳定效应有关。当血游离钙降低时，膜的稳定效应减弱，膜上相应的电压依赖性钙通道开启，细胞外游离钙流入细胞。并触发“钙流入激活钙释放机制”，使胞浆游离钙进一步增高，最终引起血管收缩，血压升高，称I型缺陷。此型特点为低肾素、低血清游离钙及高细胞游离钙水平。此时，钙离子阻滞剂或补充钙治疗有效；而高肾素一高血清游离钙型高血压，钙离子阻滞剂或补钙治疗效果不佳。 在高血压治疗中的作用及地位。CCB明确适应证为：(1)老年性高血压患者；(2)单纯收缩期高血压患者;(3)高血压有心绞痛患者；(4)外周血管病患者；(5)颈动脉粥样硬化；(6)高血压伴妊娠患者。 钙离子拮抗剂阻滞心肌钙依赖性的兴奋一收缩耦联并在离子通道水平选择性地阻断细胞膜上的钙离子通道 (慢钙通道)，使胞内肌浆网释放钙离子下降，同时减少钙离子与钙调蛋白相结合，使肌球蛋白氢键激酶 (MLCR) 活化, 肌球蛋白与肌动蛋白相互作用引起的收缩作用减弱, 使全身血管扩张，血压下降。除此之外, 钙离子拮抗剂还具有抑制心肌收缩力、降低心肌耗氧量、松弛血管平滑肌、引起血液动力学变化等心血管系统方面的作用, 而且还具有抑制血小板聚集、抑制神经及内分泌系统的兴奋分泌偶联以及减少交感神经末梢递质的释放等作用。． 2+Ca 2+通道Ca -2+Ca内流-2+Ca通道钙调蛋白阻滞剂2+Ca钙调蛋白复合物-
平滑肌收缩血压 钙离子拮抗剂的分2 : 根据其化学结构和药理作用可分为两大类型钙通道，起到舒张血 (DHP 二氢吡啶类s)，主要作用于血管平滑肌上的L(1) 管和降低血压的作用;型钙通道作用程度, 对心肌和血管上的 L(2) 非DHPs, 如维拉帕米、地尔硫卓但是对窦房结和房室结处的钙通道有选择性。维拉帕米和地相同, 与 DHPs差，但是其负性变时、降低交感神经活性的尔硫卓在扩张血管方面较DHP s所不具备的。作用是 DHPs组织选择性和药代动力学特点将钙离子拮抗剂划分为根据药物的受体结合特性、: 三代容易, 包括硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓等，(1) 第一代为短效钙离子拮抗剂;基本不用于高血压的治疗引起反射性交感神经激活, 增加心率 , , 血管选择性有所提高(2) 第二代钙离子拮抗剂的药物代谢动力学特性有所改善，但其生, 尼莫地平、 , 性质稳定、疗效确切如硝苯地平缓释片、尼群地平等; 物利用度仍很低，峰谷血浆浓度波动较大． (3) 第三代为长效钙离子拮抗剂, 以氨氯地平、拉西地平、乐卡地平等为代表, 半衰期长 , 可 1次 / d服用, 因其长效、不良反应小、服用方便且能 24h覆 盖等特点, 已成为用于高血压治疗的重要钙离子拮抗剂类药物。 根据此分类 第一代钙拮抗剂均为短效。特点是： ①量效关系难以预测。这是因为生物利用度低、波动大，造成个体内和个体间的药物血浆浓度波动大。 ②由于快速的血管扩张和交感神经系统激活引起反射性心动过速、心悸和头痛，尤其以硝苯地平最为明显，这是因为此药的达峰时间较短( 1h ) 。 ③作用持续时间短。半衰期短、清除率高，使高血压患者的血压和心绞痛患者的心肌缺血的控制很难实现2 4 h的有效覆盖，在清晨的血压和缺血高峰期患者不能得到保护。 ④血管选择性差，如维拉帕米和地尔硫卓具有明显心脏作用，包括负性变时、负性传导和负性变力作用。第一代钙拮抗剂对充血性心力衰竭都有不利影响，使预后恶化。 第二代钙拮抗剂的药代动力学特性有所改善或血管选择性有所提高。 Ⅱa类与第一代钙拮抗剂相比，血管扩张所致的副作用减少减轻，因为它们的血浓度达峰时间延长，起效较慢。它们的半衰期延长，作用持续的时间延长。 Ⅱb类的血管选择性提高，对心脏的负性变力性、负性变时性和负性传导作用减弱，药代动力学也有所改善，但生物利用度仍很低，峰谷血浆浓度波动较大。
激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用
?５３０? ?实验研究? 激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用 武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺 【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。结果培养神经元状态良好。用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。 【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元 ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆ ｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｎｅｕｒｏｎｓｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｔｉｅａｌｎｅｕｒｏｎｓ Ｃａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。它对于神经递质释放、神经元之间信息传递和神经元存活等都具有重要意义。神经元细胞内游离Ｃａｚ＋浓度（［Ｃａ：＋３ｉ）异常升高是导致胞内钙稳态失调和细胞死亡的重要因素…，因而观察神经元［Ｃａ２＋］ｉ的变化是神经生理学研究中的一个重要内容。然而。目前采用的一些测定细胞内钙离子浓度的方法．如Ｃａ“活化的发光蛋白法、偶氮染料法、ｃａ：＋选择性微电极测定法、发射示踪法、核磁共振法、荧光标记法等各有优势，但同时也有不足之处【引。 激光共聚焦扫描显微镜（１ａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＬＣＳＭ）是２０世纪８０年代诞生的一种先进的细胞生物学分析仪器。利用紫外光或可见光激 基金项目：国家自然科学基金科学部主任基金资助项目（３０７４００９５）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（２００６０１１４００４）；山西省自然科学基金资助项目（２００６０１１０５）；山西省重点实验室开放基金资助项目（２００６０３０１２） 作者单位：０３０００１太原，山西医科大学生理教研室（武美娜、郭芬、祁金顺）；山西医科大学第一医院神经内科（李新毅）；山西省肿瘤医院病理科（白玮） 通讯作者：祁金顺：发荧光探针，计算机进行图像处理。可以对活细胞生理信号、离子含量如Ｃａ嗽度进行实时动态分析检测。ＬＣＳＭ具有高灵敏度、高分辨率、高放大倍数的特点。可进行定性、定量、定时、定位的分析测量，是近代生物医学技术最重要的发展之一。因此，它已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域新一代强有力的研究工具［，，４｜。ＬＣＳＭ的一个显著优点是可以对同一样品平面随时间进行连续扫描。进而分析细胞结构或细胞内离子含量的动态变化。对细胞内Ｃ矿的动态测定，要求仪器具有实时、连续测定的能力。本文介绍使用ＬＣＳＭ在原代培养大鼠皮层神经元细胞内Ｃａ２＋浓度动态测定中的具体应用及其优势。 １材料和方法 １．１大鼠皮层神经元的原代培养：取新生１～３ｄＷｉｓｔａｒ大鼠，无菌条件下分离大脑皮层，剪碎（＜ｌｉｎｌｎ，）。以终浓度为０．０３２５％的胰蛋白酶消化（３７℃，５—１０ｍｉｎ），用含胎牛血清的培养基终止消化，火抛光的Ｐａｓｔｅｕｒ吸管轻轻吹打１０～２０次，静置沉淀３～５ｍｉｎ．取上液２００目筛网过滤后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５
原子吸收法对钙的测定
原子吸收法对钙的测定 摘要：探讨原子吸收分光光度法测定食品中钙的方法。钙单元素检测范围在0～5μg/ml浓度内，标准曲线线性关系良好，（r= 0.99942）；相对标准偏差为1.59%～2.19%，加标回收率95.13%～96.28%。结论：该检测结果与国标方法比较无显著性差。该方法抗干扰能力强，检出限低，重现性好，精密度高，回收率高，操作快速简洁等优点。适合开展大批量检测工作，可为食品中钙的含量测定提供技术支持。 abstract： this paper is to investigate the method to determine calcium in food by the atomic absorption spectrometry. the range of calcium single-element detection is in 0～5μg/ml concentration， and the standard curve linear relationship is good，（r=0.99942）； the relative standard derivations for ca is 1.59%～2.19% respectively. the recoveries of samples for ca is 95.13%～96.28% respectively. conclusion： results of the testing methods has no significant difference with the national standard. this method has strong anti-interference ability， low detection limit， good reproducibility， high-precision， high-rate， simple and fast operation and other advantages. to carry out testing for high-volume work can provide the technical support for the calcium determination.
钙离子测定
第一章钻井液原材料及处理剂 第一节钻井液原材料及处理剂简介 第二节钻井液原材料及处理剂质量检验相关参数 四、钙离子测试 （一）测定意义 钻井液原材料及处理剂中钙盐主要作为无机絮凝剂及页岩抑制剂。首先利用钙盐可以制备抑制型钻井液，在水敏地层，抑制泥页岩的水化膨胀。其次可以配制化学处理剂，同聚合物配合使用，提高其抗盐、抗钙能力。此外在钻井液中大量引入钙离子时，可以堵塞岩石细小裂缝，减少漏失。[王平全, 周世良编著. 北京: 石油工业出版社.2003. 9. 第39页] 但是当钙离子过多时，钻井液则会遭受到钙侵，导致分散钻井液立即失去良好的流动性，滤失量剧增，泥饼厚度增加，且结构松散。[鄢捷年主编.钻井液工艺学.东营:中国石油大学.2001.5.第160页]当污染严重时，会严重影响钻井液的流变和滤失性能，还会加剧对钻具的损坏和腐蚀。[鄢捷年主编. 钻井液工艺学. 东营: 中国石油大学. 2001.5. 第153页]因此钻井液及钻井液原材料中钙离子的含量的测定具有重要的意义。 （二）测试方法 首先钙离子易与钠蒙脱石中钠离子发生离子交换，使其转化为钙蒙脱石，而钙离子的水化能力比钠离子要弱的多，因此钙离子的引入会使蒙脱石絮凝程度增加，致使钻井液的黏度、切力和滤失量增大。其次钙离子本身是一种无机絮凝剂，会压缩粘土颗粒表面的扩散双电层，使水化膜变薄，电位下降，从而引起粘土晶片面-面和端-面聚结，造成粘土颗粒分散度下降。[鄢捷年主编. 钻井液工艺学. 东营: 中国石油大学. 2001.5. 第159页] 钙离子可通过以下途径进入钻井液即钻遇石膏层，钻遇盐水层，因地层盐水
中一般含有钙离子，钻水泥塞，因水泥凝固后产生氢氧化钙，使用的配浆水是硬 水，石灰用做钻井液添加剂。[鄢捷年主编. 钻井液工艺学. 东营:中国石油大学. 2001. 5. 第153页] 在钻井液及其材料中对钙离子检测时通常采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)配位滴定法，即在强碱性溶液中用EDTA滴定Ca2+，反应方程式为 -2 -4 + 2CaY Y + Ca 。乙二胺四乙酸简称EDTA，或EDTA酸，常用H 4 Y表示。其配位原子分别为N原子和-COOH中的羧基O原子。在水溶液中，乙二胺四乙酸 两个羧基上的质子转移到氮原子上，形成双偶极离子。H 4 Y在水中的溶解度太低（295K时每100mL水溶解0.02g），难以满足常量分析要求。所以滴定剂常采用 二钠盐Na 2H 2 Y.2H 2 O，也称EDTA。它在水溶液中的溶解度较大，295K时每100mL 水可溶解11.2g，此时溶液的浓度约为0.3mol/L，pH约为4.4。 其发生配位反应时，水溶性好，反应速率较快并且其产物稳定。[赵国虎.许辉主编.分析化学.北京:中国农业出版社.2008.1.第98-101页] 1.试剂和仪器 本文主要涉及的试剂仪器有EDTA标准溶液，氧化锌基准物质，氢氧化钠溶液，硬度指示剂溶液，冰醋酸，掩蔽剂即按一定体积比混合的三乙醇胺、四乙烯基戊胺和蒸馏水，铬黑T，氨-氯化铵缓冲溶液，四乙烯基戊胺和蒸馏水的混合液，pH试纸，次氯酸钠溶液，移液管（按计量检定规程要求定期检定），电炉。 2.主要试验步骤 (1).乙二胺四乙酸二钠（EDTA）标准滴定溶液的配制与标定 1).配制 根据下表1-1，按下述规定量称取乙二胺四乙酸二钠，溶于1000mL水中，摇匀。 表1-1 配制成拟定浓度的乙二胺四乙酸二钠与其质量对照表
薄层液基细胞检测技术
薄层液基细胞检测技术(TCT)及临床意义 一，薄层液基细胞学检测技术（TCT技术）研究发展背景 薄层液基细胞学检测技术（Thin-Cytologic Test TCT），液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年美国等国家，率先应用于妇科细胞学检查，国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究，使该项技术得到迅速发展，被称之为一场细胞学制片技术的革命。 TCT从根本上解决了常规脱落细胞制片假阴性率高、丢失细胞率高（80%）和涂片质量差等技术难题，使宫颈癌的阳性检出率达95%以上，为脱落细胞学诊断作出了重大贡献。但是过去该技术需要国外的制片机、细胞保存液等，它的价格昂贵，在国内也只能是一些大医院才能开展该项目，在基层医院的推广则比较缓慢。后来国内的一些厂家研发了半自动的离心法制片机，并自主研发了细胞保存液，大大地降低了薄层液基细胞的制片成本，从而使该项技术易于被广大基层医院所接受并且进行推广使用。目前，它已成为筛查宫颈癌最好的推荐方法之一，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据，是一项非常值得推广应用的临床检验技术。 二，产品作用原理： 通过采集阴道或宫颈分泌物，获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理，试剂中的裂解成分能对红细胞进行裂解，去除红细胞对检验结果造成的干扰；同时试剂中的固定成分能保存固定白细胞、脱落上皮细胞等有价值的细胞；并使包裹在黏液中的有效细胞充分分离出来，防止有价值细胞的丢失。将有效细胞制备成细胞悬液，最后通过过滤离心方法清除黏液对制片的干扰，制成脱落细胞薄片。可用HE染色、巴氏染色或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色，再通过人工观察分析来检查阴道或宫颈的细胞形态，诊断子宫颈癌及其癌的前期变化、人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒感染。 三，主要开展的检查项目： 宫颈脱落细胞检查、胸腹水脱落细胞检查、尿沉渣检查、痰液脱落细胞检查、支气管刷片细胞检查。特别适用于所有的女性的宫颈癌的早期诊断。 四，TCT优点： 1、保存液试剂盒有裂解红细胞功能，能快速裂解采集样品中的红细胞，裂解能力强，裂解更完全，能去除血液对检验结果造成的干扰。 2、试剂盒含有细胞固定剂成分，能快速对样品中的白细胞、脱落上皮细胞等有检验价值的细胞进行固定保存，防止有效细胞发生自溶。经试剂盒固定保存的细胞，细胞形态完好，能保持样品采集时细胞的原始形态，不会发生膨胀、固缩等形态变化，保证检验对有效细胞的数量和质量要求。 3、试剂盒对粘液具有稀释作用，能分离出大量包埋在粘液中的有效细胞。使更多有检验价值的细胞被保存下来，提供充足的细胞数量，为检验结果的准确提供保证；同时，处理后的样品经低速离心过滤后能彻底清除样本中的粘液，有效防止粘液对样品检验结果的干扰。 4、处理过的样本经过低速离心后可制成均匀单层的细胞薄片，达到检验要求。 5、、经试剂盒处理的脱落细胞对生物染色剂具有亲和性，有利于生物染色剂着色，为诊断工作提供了方便。 6、、试剂盒使用简单，操作方便，大大节省了制备样品标本的时间，同时克服了传统检查方法的不足。 五，宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率位于女性恶性肿瘤的第二位，据相关组织公布全世界每年大约有20万名妇女死于这种疾病。近年筛查发现，发达国家发病率明显下降，而发展中国家的发病率是发达国家的6倍，我国妇女宫颈癌的发病率和死亡率占世界的1/3，可见改善卫生状况，及时就诊，早发现、早治疗极为重要。
钙片中钙含量的测定
原子吸收光谱分析钙片中钙含量的测定 高伟 环境工程0801 200829090119
钙离子在人体中的作用 钙离子是维持机体细胞正常功能的非常重要的离子，它对于维持细胞膜两侧的生物电位，维持正常的神经传导功能。维持正常的肌肉伸缩与舒张功能以及神经－肌肉传导功能，还有一些激素的作用机制均通过钙离子表现出来。 1、维持正常的肌细胞功能，保证肌肉的收缩与舒张功能正常。 2、对于心血管系统，钙离子通过细胞膜上的钙离子通道，进入胞内，通过一系列生化反应，主要是有加强心肌收缩力，加快心率，加快传导的作用。因而，细胞外钙离子浓度高则会升高血压，使心收缩力加强，每博输出量增大，因而血压也会相应增高。重要的抗高血压药物有一种便是钙离子拮抗剂，它使得钙离子通过细胞膜上的钙通道的数量减少，使得心肌收缩力减弱，心率降低，血压下降。其他心血管系统疾病还有充血性心力衰竭、心律失常等，病因均与钙离子关系密切。 4、钙离子对与骨骼的生长发育有着重要的作用，在年轻时，这主要受激素（降钙素、甲状旁腺素等）的调节。老年人骨骼钙易流失，因此骨骼变脆，变得容易骨折。 科学补钙： 据全国营养调查，我国31个省、市、自治区平均每人每天摄入钙为406mg。儿童、幼儿钙摄入量为平均每天322mg，低于全国人平均钙摄入量，仅为国家推荐量的40%。（我国钙日标准推荐量：6个月以下的婴儿为400mg，6个月～3岁为600mg，3～11岁为800mg，11～
13岁为1000mg，13～16岁为1200mg） 新生儿 新生儿的体重和身高增长速度较快，需要补钙。3.0-2岁的宝宝户外活动时间少，饮食还不够丰富，对钙的吸收就会缺乏，此阶段因缺钙而发生佝偻病或佝偻病症状的可能性特别高，因此也需要服用补钙产品。 女性 女性缺钙从30岁开始，到了40岁以后，每年丧失骨质约1%，在更年期后，骨质丧失进一步加重，导致骨质疏松。目前我国孕妇和哺乳妇女平均每日钙摄入量仅为国家钙日推荐量的50%（我国钙日推荐量孕妇早期为1000mg、晚期及乳母为1500mg）。女性在妊娠期，摄取的钙除满足自身代谢所需还要通过胎盘供给胎儿生长发育。哺乳期则满足自身需要外还要通过母乳供给婴儿。 中老年人 缺钙是造成老年人变矮、或者掉牙的直接原因之一。缺钙则引起骨质疏松、老年人椎骨及椎间盘组织逐步退化，椎骨出现骨质疏松，而椎间盘则失去弹性、受压而变薄，体重的压力使椎骨上下受压而变扁，身高变矮，出现驼背。同时，牙龈萎缩，牙根暴露，牙骨质减少，小颌骨及下颌骨骨质疏松，使牙槽窝变浅变大，导致牙齿松动，以至脱落。老年人由于骨中的钙质疏松，因此很容易骨折。 补钙须知 1.补钙必须要加维生素D
新型均相Fura-2 钙流检测实验(Molecular Devices)
FLIPR TETRA高通量实时荧光成像分析系统应用系列（3） Fura-2QBT?钙流试剂盒: 新型均相Fura-2钙流检测实验 Fura-2染料一直以来被认为是在细胞成像、GPCR介导的细胞内钙流、以及离子通道激活等实验中检测钙动员的重要工具。这种比值法检测染料通过计算结合和未结合两种状态之间的荧光强度比值，有助于纠正由于染料添加或细胞铺板造成的误差。然而，传统的Fura-2染料必须要进行缓冲液清洗，从而对于每一个实验来说都提高孔间差异性并需要耗费更多时间且增加操作复杂性。Molecular Devices?推出的Fura-2 QB T?钙流试剂盒是基于专利的信号湮灭技术，含有比值法检测的Fura-2钙离子指示剂，提供均相实验体系并减小细胞基础的差异性, 从而通过在检测前去除细胞清洗步骤间接增加通量。另外, Fura-2 QB T?钙流试剂盒是在紫外光谱处激发，最大程度使得研究者可以减少488nm 激发的化合物荧光信号的干扰。 实验原理 Fura-2 AM是一种钙离子敏感染料，在340 nm和380 nm被激发，发射波长是510 nm。染料结合了钙离子后其吸收波长从380nm转移到340nm。图1显示了钙离子结合Fura-2后340/510nm发射的信号（绿）的增加，而380/510 nm发射的信号（橙）下降。计算两种发射的信号比值（插图）来检测用于拟合量效曲线的最大值减去最小值后的信号效应。Fura-2 QBT?钙流实验准备 本次实验中使用的是小规格的Fura-2 QB T?钙 流试剂盒（PN #R8197）。染料重悬在含有20 mM HEPES的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）。丙磺 舒（PBX）在需要时加入，用以抑制染料被转移 出细胞内。贴别的CHO M1细胞或HeLa细胞实 验前过夜种在黑壁底透的384孔板中，在试验时 从培养箱中取出。含有Fura-2 QBT染料或者其 它染料的25μL缓冲液加入到每个孔中，同时孔 中需含有25μL缓冲液或培养基。加载了Fura-2 QB T?钙流试剂（PN #R8197）或BD比值法钙 流试剂（#644243）的细胞记录板在37°C、5% CO2孵育一小时。为便于对比，采用了传统的 Fura-2清洗方法。 特点 基于信号湮灭技 术，获得更大信号 窗口 免洗和比值法信号 检测使得实验差异 性降至最低 免洗步骤节省了时 间和实验成本 FURA-2 QBT钙流实验的比值法分析(图 1)
钙离子拮抗剂
钙离子拮抗剂 钙离子拮抗剂 钙拮抗剂在1962年即已被证实能有效地治疗急性高血压，70年代后期才被广泛地研究和应用于治疗高血压病。钙拮抗剂是80年代发展起来的一类心血管新药。它带来了心血管治疗的一场革命现以广泛应用于高血压、冠心病、心率失常、脑血管病的治疗。目前，钙拮抗剂在高血压病及其他心脑肾血管病变防治中仍具有中要地位。近年在美国，钙拮抗剂在老年人降压治疗中的应用有增无减，已成为常用药物（单用占23.9%，与利尿剂合用占5.4%）；在中国和日本，接受治疗的高血压和心绞痛病人中，分别有1/2和3/4使用钙拮抗剂。 但是，钙拮抗剂也是争论最大的一类药物。关于钙拮抗剂是否增加心血管事件的危险尤其是chd的死亡率，以及是否增加肿瘤出血的危险，分歧很大。美国fda也警告使用短效硝苯地平有危险。为此，who/ish专门成立了特别问题专家小组——（ad hoc sub-committ ee）对钙拮抗剂的安全性进行评估。评估得出的结论是：现有资料不能确定有关钙拮抗剂对chd、肿瘤及出血的危险性影响是有益或有害。硝苯地平是近20年来我国治疗高血压应用最广泛的降压药，多年来并未见发生严重不良反应的报道。而且据中国老年收缩期高血压临床试验，在我国高血压的主要并发症是卒中，而不是心肌梗死，故仍推荐钙拮抗剂为治疗老年高血压第一线药，尤其适用于患者，对合并chd者，则宜选用长效制剂。 5.1 分类 钙拮抗剂包括一大族化学结构、功能、对组织选择性及不同钙通道与结合位点选择性都各异的药物。降压治疗最好使用长效钙拮抗剂如：氨氯地平、拉西地平、非洛地平缓释片、硝苯地平控释片、维拉帕米缓释片等。而应避免使用短效钙拮抗剂。 根据国际药理学联合会的分类，选择性的作用于型钙通道的钙拮抗剂，多数结合部位在分子结构的α1亚单位。因此可根据α1单位上不同的结合位点分为三个亚类：iα类，二氢吡啶类，包括硝苯地平、尼群地平、尼莫地平、尼卡地平、尼伐地平、氨氯地平、拉西地平、非洛地平、依拉地平等地平类药物。二氢吡啶类用以治疗心血管病，主要是高血压、冠心病、心绞痛等。 ib类，硫苯罩类，ib类类以硫罩类为代表，其药理作用介于二氢吡啶类及维拉帕米之间，主要用于治疗心绞痛。
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，
Fluo-3 AM_钙离子荧光探针_
Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 产品简介： Fluo-3 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。 Fluo-3和Fura-2相比，其优点是：一方面可以被氩离子激光(argon-ion laser)的488nm激发光激发，便于检测；另一方面，Fluo-3和钙离子结合后荧光变化更强，即对钙离子浓度变化的检测更加灵敏；同时，Fluo-3和钙离子的结合能力较弱，这样可以比Fura-2检测到细胞内更高浓度的钙离子水平；此外，对于细胞内的钙离子的即时变化反应得更加准确，减小了因为和钙离子解离速度慢而导致的荧光变化滞后。 本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM。 Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。 Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。Fluo-3的激发光谱和发射光谱参考下图。 用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育15-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。 保存条件： -20℃避光保存，6个月有效。 注意事项： 本Fluo-3 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用本产品的文献： 1. Li H, Wang L, Ye L, Mao Y, Xie X, Xia C, Chen J, Lu Z, Song J. Influence of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing signal molecule N-(3-oxododecanoyl) homoserine lactone on mast cells.