原生质体的培养

原生质体的培养

原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。

一、原生质体的应用

由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为

有利的试验材料。原生质体可以用于下面几种研究。

用作细胞杂交服务于作物改良

用作遗传转化的对象

研究细胞壁的发生过程

筛选突变体

膜的结构、运输、激素接受位点等的研究

用于分离细胞器和大分子

种质资源保存

二、原生质体分离、纯化

原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。

（一）分离方法

机械法分离

缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力

酶法分离

Cocking最早开展这方面研究，克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。

（二）影响原生质体分离的因素（酶法）

从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。原生质体分离时主要应考虑

取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。

1. 外植体来源:

生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspension

cultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质

体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。

2. 酶液组成和浓度：

纤维素,占壁干重的25-50%

植物细胞壁由三个主要成分构成半纤维素, 平均53%，果胶质,5%

用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶的作用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开。

常用的酶制剂及其生产厂家有：

纤维素酶有Cellulase Onozuka R-10 （Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本），Cellulase Onozuka RS （Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本），Cellulase （Sigma），Driselase （Kyowa Hakko Kogyo Co.，日本）。果胶酶有Pectolyase Y23 （Kikkoman Shoyu Co., Lte. Nishinomiya，日本），Macerozyme（Yakult Biochemicles Co.，日本），Pectinase （Serva）等。半纤维素酶有Rhozyme Hp-150 （Rohm and Haas Co. inde. 美国宾西法尼亚州）。大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有很多例外。

3. 渗透压：

原生质体操作需要在一定渗透压存在下进行，常用的配制分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为CPW液，CPW盐成分为：

KH2PO4 27.2mg/L

KNO3 101.0mg/L

CaCl2.2H2O 1480.0mg/L

MgSO4.7H2O 246.0mg/L

KI 0.16mg/L

CuSO4.5H2O 0.025mg/L

pH 5.8

根据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培养基:

CPW13M: CPW盐+13%甘露醇(mannitol)

CPW9M: CPW盐+9%甘露醇

CPW21S: CPW盐+21%sucrose

CPW0M: CPW盐溶液。

多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散入

原生质体的速度很慢的缘故，这样一来能保证一个稳定的渗透压。

4. 分离培养基:

钙、镁离子很重要（？）；有时需要激素；PVP有时能增加原生质体

产量。分离原生质体的培养基用量一般为10mg/g组织。

5. 培养条件:

最主要的是酶处理时的温度和pH。不同的酶需要的pH值不一样，但pH大于6时不利于原生质体生存。一般而言，分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是高温下短时间分离的原生质体不适于培养，他们易发褐和破裂。但酶处理时间一般不超过24小时。一般常用温度是23-320C。酶处理时一般在暗处培养。叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）

过程中间断低速震荡有利于酶渗透。

6. 组织前处理: 主要目的是便于原生质体分离和促进细胞分裂

高渗前处理

激素处理

低温处理

激素处理与低温处理结合使用

(三) 原生质体的收集、纯化与活力测定

经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，只有将杂质和酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培养。

1. 收集:原生质体混合液用滤网(40-100μm)去掉没有降解的细胞及组织,收集滤液.

2. 洗涤: 将网下物低速离心,去掉上清液,再加无酶液的CPW液悬起原生质体,再离心,弃上清,重复几次即可.

3.纯化:

采用上浮法和下沉法两种纯化方法。上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合，下沉法是先将原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在100′g下离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻地吸出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到104-105/ml，用于培养。

4. 活力测定:

原生质体培养前通常要进行活力检查，以便知道其状态是否正常。测定原生质体活力的方法主要有观察胞质环流（Cytoplasmic streaming）、测定呼吸强度和FDA染色，其中最常用的是FDA法。FDA是荧光素双醋酸酯（Fluorescein diacetate,FDA），常用丙酮配置成2mg/ml溶液，在冰箱（4°C）中保存。FDA 本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。在紫外光照射下，发出绿色荧光。相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光。

三、原生质体培养

1.原生质体计数

原生质体培养前必须调到一定密度,即确定每毫升培养基中含多少原生质体.用CPW13M悬浮原生质体,血球计数板计数,计算稀释倍数,离心,去除CPW13M

，用所算体积的培养基悬起原生质体,用于培养.

2.原生质体培养

主要有三种方法:

(1)液体浅层培养（Liquid thin layer culture）

原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中,取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口进行培养。

(2)固体培养（Solid culture）

也叫琼脂糖平板法（Agarose plate culture）或包埋培养法（Embedding culture）。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（主要是琼脂或低熔点琼脂糖，LMT agarose）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。

(3)固液双层培养法（Solid over liquid culture）

此法结合液体浅层培养和固体培养的优点，在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。

植板率（Plating efficiency，即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比）.

3.细胞再生

(1)细胞壁的形成

原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生细胞壁。不同植物原生质体培养再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。简单的鉴别壁的再生的方法是用荧光增白剂（Calcofouor White),专染纤维素,在荧光灯下发出荧光。一些因素影响壁的再生：①碳源；②培养条件——固体培养时细胞壁再生比液体培养时快；③渗透剂的种类。

(2)细胞分裂

第一次分裂通常发生在培养后2-5天,可在黑麦中需14天。

4.植株再生

具有再生能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织（Minicallus），要及时转移到分化培养基（Differentiation medium）中 ,培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。

四、影响原生质体细胞分裂的因素

物理条件

密度: 低于一定密度不能分裂,一般培养密度为:5×103—5×105/ml。

光：一般原生质体首先在暗处培养一周利于壁形成和细胞再生。照光如何、什么时候照光、光强如何等，直接影响着植板率。

温度：通常22-250C。

化学因素

(1)培养基:

即使来源于同一种基因型的原生质体，在不同培养基中的再生能力也不一样。许智宏等（1982，1984）发现在形成细胞团的数量上，KM5P和KM5都不如B5P培养基，但对细胞的持续分裂来说，KM5P和KM5又优于B5P培养基。培养基中的附加物质也会影响到原生质体培养效果，如培养基中的激素、无机盐组成、氨基酸、有机酸等。MS铁盐一般对原生质体培养是有害的，50μM较合适，因为高铁能降低培养基的pH。

常用的KM8P培养基含有丰富的有机成分，包括维生素、AA、有机酸、核苷酸、糖及糖醇等，已经证实有机酸（丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、延胡索酸）可以提高烟草原生质体的植板率。一些研究证明多胺类物质对原生质体发育有影响，培养基中添加腐胺、精胺、亚精胺及精氨酸可以促进巴旦杏原生质体发生分裂。生长素的使用量一定要小心确定，因为它很易使液泡长大或增加新液泡，从而使细胞破裂。

（2）渗透压调节剂

培养的原生质体随发育进程需要不断降低渗透压，以促进细胞分裂。物的原生质体培养基中，以蔗糖和果糖作碳源和渗透压稳定剂时，细胞不能持续分裂，而用葡萄糖时，原生质体能持续分裂并形成细胞团。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，很利于细胞分裂。

3.原生质体来源

分离原生质体所用外植体的生理状态与原生质体的质量和其后的分裂频率有着密切的关系。如在小麦原生质体培养中，3-6月龄的悬浮细胞系分离的原生质体分裂率比1月龄的原生质体高。

4.基因型

基因型与原生质体培养及形态分化有一定的关系，同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不一样，造成不同品种在相同条件下的再生能力也会不同。

5.微电流处理

已经发现微电流处理能够促进三叶草、白芷、石防风、梨属、李属、大豆属和茄属植物原生质体细胞壁再生，提高分裂频率，促进细胞团的形成