麻疹病毒分离株N基因序列分析

麻疹病毒分离株N基因序列分析

探讨四川省目前流行的麻疹病毒的基因型别和特征。方法采用Vero/SLAM细胞分离培养麻疹病毒，通过逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法扩增麻疹病毒N基因羧基末端456 bp片段，并对PCR产物进行序列测定和同源性分析。结果2011年四川省分离到10株麻疹病毒均为H1a基因亚型，与H1基因型代表毒株的同源性为97.1%～98.9%。结论H1a基因亚型仍为四川省本土流行病毒株的优势亚型，近年来四川省流行的麻疹病毒无较大变异，优势病毒的持续传播与麻疹的发病有密切联系。

麻疹病毒（Measles virus）属于副粘病毒科，麻疹病毒属，是引起以发热、呼吸道卡他症状和出疹为主要临床表现的急性病毒性传染病。其基因为不分节段的单股负链RNA，有6个结构基因分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素（H）、RNA聚合酶（L）6个结构蛋白。麻疹病毒一直被认为是遗传稳定的病毒，只有一个血清型，但近年国内外通过对麻疹病毒的基因分析，已发现有8个基因组（A-H），共24个基因型在人类中流行或曾经流行[1～3]。从2009年以来四川省的麻疹疫情有所上升，进入2011年麻疹疫情继续攀升，局部地区发生麻疹暴发流行。随着2012年消除麻疹的临近，今年为控制麻疹的关键年，为掌握四川省流行的麻疹病毒的基因型别及特征，为制定麻疹防控策略措施提供科学依据，对2011年上半年分离的麻疹病毒的核蛋白N基因片段进行了序列测定和比较分析。结果报告如下。

1材料与方法

1.1 标本标本的采集和处理方法参照全国麻疹监测方案[4]。

各市（区、县）CDC采集疑似麻疹患者（出疹5d内）咽拭子，标本保存在病毒标本运输液中。-20℃或以下温度保存，冷冻运输。标本用终浓度各为1000 U/ml的青霉素和1000μg/ ml的链霉素处理后，置4℃保存备用。

1.2病毒分离培养将处理后的咽拭子标本接种于在培养管中生长良好的Vero/SLAM单层细胞上，置5% CO2培养箱，37℃连续培养7d，逐日观察细胞病变（CPE）。当75% 以上的细胞呈现明显麻疹病毒特异性的巨细胞融合病变时，收获和冻存细胞培养液。若未见病变需连续盲传3代，仍无病变出现则为阴性。

1.3麻疹病毒RNA提取采用Promega公司的Maxwell? 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit，用Maxwell? 16 Instrument（Magnetic Particle Processor AS2000）按试剂盒说明书提取病毒RNA，-20℃保存备用。

1.4 逆转录反应（RT-PCR）采用QIAGEN公司OneStep RT-PCR Kit进行逆转录反应。引物NP3seq（TTG CTG GTG AGT TAT CCA CAC TTG）和MVN8（TTA TAA CAA TGA TGG AGG）[5]为上海生工公司合成。体系为：10 μl 5 x缓冲液，2 μl dNTP（10 mM），引物NP3seq、MVN8各2 μl（10μM），2 μl酶，4 μl模板RNA，加无核酸酶的水至终体积为50μl。使用ABI 2720 PCR仪进行反应，反应条件为50℃30 min，95℃15 min；94℃30 s，50℃30 s，68℃1.5 min，35个循环；68℃10 min。扩增产物经1 % 琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

1.5核苷酸序列测定和分析取RT-PCR阳性扩增产物，用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）按说明书进行纯化。纯化产物分别用NP3seq和MVN8引物进行标记，标记试剂为Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI），反应条件为：96℃ 1 min；96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min，共25个循环。标记产物用Big Dye XTerminator

purification kit（ABI）再次纯化后，在ABI 3500xl DNA 测序仪上自动完成序列测定。

核苷酸序列经Sequencher 4.10.1校对后，与各基因型参考株苷酸进行多序列比对（编码核蛋白羧基末端的456个核苷酸），用MEGA 4.0 软件作进化树分析（邻位-连接法，bootstrap 检验，抽样次数500，Kimura 2参数模型），根据分支聚集确定病毒基因型[6]。

2 结果

2.1 麻疹病毒分离咽拭子标本接种Vero/SLAM 细胞后，分别于第二、三代出现了典型的麻疹病毒巨细胞融合病变。2011-01/06四川省共分离到10株麻疹病毒，其中6株来自巴中市，4株来自成都市。

2.2 RT-PCR 结果病毒分离物经RT-PCR鉴定，扩增出特异性条带，片段大小为768bp8，见图1。

图1 麻疹病毒阳性分离物RT-PCR扩增电泳图

注：1-11为2011年的麻疹病毒阳性分离物，12为2010年的麻疹病毒阳性分离物作为对照，M为100bp ladder marker。11号标本的扩增条带较弱，在后续的测序反应中未能得到相应的核苷酸序列。

2.3 序列测定和基因分型结果通过对编码N基因羧基末端456个核苷酸序列测定和分析，用mega 4.0 软件分析分离株与目前麻疹其它基因型代表株基因序列，根据各病毒间差异程度，进行同源性分析（表1）并按百分比做出进化关系树（图2）。10株病毒株之间有少许差别，但基因型均为H1a亚型，属于目前我国流行的优势基因型H1型。通过与H1基因型、H1a亚型流行株的核苷酸同源性对比分析，分离株的N基因片段的同源性在97.1%～98.9%之间。

3讨论

要实现消除麻疹的目标，除了提高麻疹减毒活疫苗的免疫覆盖率之外，实验室的血清学和病原学监测是消除麻疹的重要保障，而高敏感的麻疹病毒分子流行病学监测是其重要组成部分。对于麻疹病毒的病原学监测而言，尽管采用了不同细胞株提高了病毒分离的成功率，但从细胞培养中分离麻疹病毒仍比较困难[7]。其可能与麻疹病毒对培养细胞的敏感性以及标本的采集、运输、贮存等操作未严格按照相应的标准操作规程操作有关。

实验中的10号和11号标本的细胞培养病变为圆大型，并不是麻疹病毒典型的特异性巨细胞融合病变，但用实时荧光检测麻疹病毒为阳性。RT-PCR反应中，11号标本的扩增条带较弱，在后续的测序反应中未能得到相应的核苷酸序列。此类标本认为是与某种病毒混合感染所致，可能另一种病毒较强，干扰了麻疹病毒的增殖，有待于后期做进一步的分析。

通过进化图和同源性分析，上半年分离到的10株病毒中，从发病时间和发病地点看，6株来自巴中市（编号1-5，10）的分离株同源性为100%，3株来自双流东升镇（编号7-9）的分离株同源性为100%，同一时间段，同一地点，证明为两起由H1a病毒株引起的多个传播链的麻疹暴发疫情。通过与H1基因型、H1a亚型流行株的核苷酸同源性对比分析，分离株的N基因片段的同源性在97.1%～98.9%之间。由此可见，麻疹病毒虽然遗传稳定，但仍存在着少量核苷酸变异，目前的这些变异，是否会改变人群对麻疹的免疫水平和影响病原学检测等方面，有待进一步研究。

麻疹病毒基因型别具有地理分布特征，不同地区有不同的本土流行株或优势流行株，同时全球麻疹野病毒流行也与年代存在一定相关性[8-10]。通过监测不同国家甚至同一国家不同地区所流行的麻疹病毒的基因型分布，可以鉴定病毒的来源，确定传播途径，提供评估麻疹控

制策略效果的方法，科学有效地阻断麻疹病毒的传播[11]。随着消除状态的临近，非本土病毒的输入就会凸现，这一规律已在其他已消除本土麻疹传播的国家中得到证实[12]，例如我省在09年就分离到一株从泰国传入的输入性病例D9 [6]。分子病毒学监测流行麻疹病毒的基因特征，及时确定病毒传播是本土还是输入，并确定输入来源，对于控制和消除麻疹，及时阻断外来输入病毒的传播有重要意义[13]。

通过2011年上半年四川省麻疹病毒分子流行病学的研究，丰富了本土麻疹病毒毒株库，积累了麻疹病毒分子流行病学数据，也进一步证实了H1a基因型仍是四川省麻疹病毒流行的绝对优势基因亚型[14]。在接下来的工作中，我们要提高爆发疫情中病原学标本的采集率，加强其病毒分离，以鉴别病毒的传播链。将实验室检测结果和流行病学信息结合起来，才能充分体现分子流行病学在病毒溯源、确定传播途径中的作用，从而更好地为消除麻疹提供科学的依据。

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