植物表达载体转化农杆菌操作步骤

第一部分：农杆菌介导转化水稻

1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101

2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/m l。28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：

1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；

5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；

制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：

1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；

2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；

4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）

5、重组农杆菌鉴定：

1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）

2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。3）质粒酶切或PCR鉴定。

6、三亲交配法：

参考一：

1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；

（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）

2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；

3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；

4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；

5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；

6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；

（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）

7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；

（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）

8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；

9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。

10）将阳性单菌落再次划线纯化。

三亲交配法：

参考二：

1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含

抗生素的LB液体培养基中，28℃, 200rpm培养24h;

2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB

液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;

3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗

生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm培养约8h;

4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于

无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;

5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含

有三种抗生素的LB平板上，作为对照。

注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用PCR鉴定。（PCR鉴定时要做好阴性对照。一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。

注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性

注意三、

1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度5 0~100L。

2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。

3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。工作浓度50ug/ml

4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。工作浓度50ug/ml

5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10 ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

抗生素储存液工作浓度

浓度(mg/ml) 保存条件严紧型质粒(μg/ml)松弛型质粒(μg/ml)

氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60

羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60

氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170

卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50

链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50

四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 50

7、水稻胚性愈伤组织的诱导

取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0. 1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4

－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。28℃暗培养至长出愈伤组织。

选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）8、根癌农杆菌的培养

平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 R if/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str），28℃摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗生素）培养8小时左右至OD600为0.5左右。

4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uM AS的AAM液培中，28℃摇床上培养至OD600=0.5。

9、愈伤组织的预培养

取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。

10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养

取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28℃（或25℃）暗培养2－3天。

11、洗除农杆菌

共培养2－3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mg"L-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30－50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置25℃培养箱内暗培养。

11、抗性愈伤的筛选

将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。

（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。

（N6 -S1：N6，100mg"L-1G418，250mg"L-1羧苄青霉素）

（N6 -S2：N6，50mg"L-1G418，125mg"L-1羧苄青霉素）

12、抗性愈伤的分化培养

经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养（12h光照，12h黑暗）。

13、转基因植株的再生及幼苗移栽

转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。（筛选4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进行分化出苗，光照24h/d，再生的小苗长至2-3cm左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7~10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5~7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。注意保湿，以提高移栽成活率。

筛选剂类型：

在植物基因转化中，外源基因稳定整合的频率低。如何选择适当的筛选标记以准确、有效地区分转化与非转化细胞，产生选择压力，使未转化细胞不能生长，且不干扰细胞的正常生长与植株再生是转化成功的重要环节之一。

1、较早应用于水稻转化实验的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)，对卡那霉素具有抗性。但由于水稻对卡那霉素具有天然抗性，没能广泛应用。G418是一种与卡那霉素饵近的氨基糖苷类抗生素，不能被新霉素磷酸转移酶激活，用它作选择标记比卡那霉素更有效，而且再生绿苗频率更高。

2、现在bar当作选择基因也已被用于水稻遗传转化研究（Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。）。

3、潮霉素磷酸转移酶(HPTⅡ)基因是另一应用广泛且更有效的标记基因，它具有对潮霉素的抗性，用潮霉素可以明显区分已转化和未转化的组织。不同选择剂应用浓度和选择时间应根据不同材料的具体情况而定。马炳田等报道了通过调节潮霉素的使用浓度，在抗虫转基因水稻研究中提高筛选率，结果表明：筛选时潮霉素使用浓度为20～30 mg／L；分化时潮霉素使用15～25 mg／L，可得到较高的抗性愈伤组织筛选率和绿苗分化率。

总结分析：

1、pEmu－mcs－N载体：载体带有Amp抗性基因，在大肠杆菌和农杆菌中可用Amp作抗性筛选。但是载体自身不带有NPT11或HPT基因，所以转基因植株不能用G418或者潮霉素来筛选。且载体不带有报告基因，因此不能用报告基因来筛选阳性植株。只能通过与带有抗性基因和报告基因的载体进行双质粒共转化来转化植株，才能用G418或者潮霉素和诸如GUS等报告基因筛选阳性克隆株。

2、pKYLX71:35S2载体：载体带有Tet和Kan抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ。在大肠杆菌和农杆菌中可用Kan和Tet来作抗性筛选，在转基因愈伤组织中可用G418来抗性筛选转化和未转化的组织。但是不确定改载体是否带有GUS报告基因，因此也不确定转基因植株是否可以用GUS报告基因来筛选。

3、pTCK303载体：载体带有Kan抗性基因、潮霉素磷酸转移酶(HPTⅡ)基因、GUS报告基因。在大肠杆菌和农杆菌中可用Kan来作抗性筛选，在转基因愈伤组织中可用潮霉素来作抗性筛选转化和未转化的组织。亦可以用GUS报告基因来筛选阳性植株。

用羧苄青霉素等抗生素进行抑菌试验,以羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好.头孢霉素对高梁愈伤组织的毒性表现出比羧苄青霉素大.浓度低于500 mg/L羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长起促进作用;而分化率随着羧苄青霉素浓度的提高而下降.在农杆菌介导高梁遗传转化时,选用羧苄青霉素是合适的,浓度以250 mg/L为宜。

乙酰丁香酮的使用，因为它可诱导农杆菌Vir 基因的活化，促进外源DNA 与植物基因组. 的整合；从而提高农杆菌转化植物的效率，乙酰丁香酮最佳浓度为200 μmol/L。