生物制品学实验指导

生物制品技术实验指导

生物工程系

目录

实验规则?????????????????????? 2 实验

一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验???????? 3 实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒???? 4

实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价?? 5 实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备???? 6

实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备????????????7 实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备????????8 实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定??????9 实验八、兔瘟灭活苗的制备??????????????10 实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备?????????11 实验十、动物实验

??????????????????12 实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用????????15 实验十二、免疫血清的制备??????????????16 实验十二、细菌冷冻真空干燥实

验???????????18

实验规则实验中所用材料，多具有传染

性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物

等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，

防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。必须遵守以下各项。

1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。、进实验室不得将书包、衣物等放在实验

1

台上，不必需的物品勿携入室内。

2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。

5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。

6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。

7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。

8、实验完毕后，须将玻璃仪器、用具等清洗干净，按原来的位置摆设放置，如有破损须报告指导教师，并填写仪器损坏登记簿。关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。

10、实验结束后，由值日生负责打扫实验室，保持室内整洁，注意关上水、电、窗、门。

实验一猪瘟（HC ）、口蹄疫（FMD ）抗体间接凝集试验

一、目的要求：掌握正向间接凝集反应原理及操作方法。

二、原理：将病毒抗原吸附于醛化红细胞上，带抗原的红细胞可以和抗体发生凝集，从而可

以检测被检猪的相应抗体水平。

三、材料：微量反应板、移液器、滴头、HC 诊断抗原、FMD 诊断抗原、被检血清、阳性血

清、阴性血清各一瓶、生理盐水、微量振荡器、胶布适量。

四、方法步骤：

1、用移液器加滴头吸生理盐水。加入微量反应板孔内一排8 孔，每孔加50 微升。

2、换一滴头吸一被检血清从第一孔加入50 微升，吹吸3 次（1：2）吸此孔液体到第2

孔，吹吸3次，（1：4），依次类推倍比稀释至第8孔，第8 孔再弃去50微升。这

样每孔均为50微升，稀释度分别为1：2、1：4??1：256。

3、换一滴头吸HC 诊断抗原各25 微升，分别加入第4 孔、第6 孔。

4、换一滴头吸FMD 诊断抗原各25 微升，分别加入第5 孔、第7 孔。

2

5、每组做1 份对照：

在反应板最后一排分别滴阳性血清、阴性血清各2 孔，并分别加HC 、FMD 诊断

抗原各25 微升。

6、在微量振荡器上振荡2min ，室温下（25-30℃）1.5—2h 观察。

7、其他同学重复做1—4 步。

8、贴胶布、标明被检血清、组别、对照等。

9、结果判断：HC 抗体凝集（++）1：16以上为合格；FMD 抗体1：128 以上为合格。

五、思考题：

1、正向间接反应的原理是什么？

2、该试验应注意哪些事项？如何判定自己做的结果准确？

3、当结果出现错误时，有哪些原因造成的？

实验二鸡新城疫灭活疫苗的制备——照蛋及接毒

一、目的要求：通过试验掌握鸡新城疫灭活油乳疫苗的制备方法。

二、原理：新城疫病毒可以在鸡胚中生长、并引起病变和鸡胚死亡。收胚胎尿囊液毒后，可以

利用血凝实验测定效价（NDV 病毒具有血凝素，可自动凝集红细胞）。符合标准后灭活、加佐剂可制成灭活疫苗。

三、材料：孵化10 天的受精鸡胚、照蛋器、新城疫II 系和IV 系疫苗、生理盐水、1ml 注

射器、石蜡、滴头、注射针头、酒精棉球、镊子。

四、方法步骤：

1、将鸡胚先照蛋、画出气室，用酒精棉球消毒接种部位、离气室边缘1cm（避开血

管），先用消毒针头钻破蛋壳，然后针头与蛋成30 度角进针0.5cm 注入

3

0.1mlNDV ，1-4 组接II 系毒种，5-6 组接IV 系毒种，标记，每2 人1 个鸡

蛋、接种后封蜡。

2、毒种的准备：

将疫苗按1羽份0.1ml 稀释，然后加入青链霉素溶液，使之达到含500 单位青链

霉素/ml ，接毒时按0.1ml病毒液/枚蛋接种。

3、接毒后的鸡胚放入孵化箱中，37.5 ℃孵化，24h 挑出死胚蛋弃去，其它继续孵化，

以后每半天观察1 次，挑出死胚，放入4℃冰箱冷藏，到96—120h 不论是否死亡都放4 ℃冰箱冷藏1 天。

五、思考题：

1、如何确定鸡胚的死活？

2、鸡胚接种有几种方法？日龄是多少？

实验三鸡新城疫灭活疫苗的制备——鸡胚收毒及测效价

一、目的要求：掌握新城疫病毒血凝实验操作方法。

二、原理：新城疫病毒有血凝素，可以凝集鸡的红细跑，通过测血凝效价，知道尿囊液中病毒

的含量。

三、材料：无菌吸头、脱脂棉、无菌剪子、镊子、无菌烧杯、微量反应板、0.5% 鸡红细胞、

移液器、滴头、离心机、生理盐水、酒精棉球。

四、方法步骤：

1、提前准备0.5%鸡红细胞(鸡的抗凝血加生理盐水离心洗涤 5 次，3000 转/分、最

后配成0.5%红细胞)。

2、将气室用酒精棉球消毒、剪开气室、剪开尿囊膜、用吸头吸尿囊液于烧杯中(可垫少

量脱脂棉花，防堵吸头。 )

3、测效价：

(1)取一微量反应板用移液器吸生理盐水，按第1-12 孔各加加50 微升。

4

(2)换1个滴头吸被检尿囊液50微升放于第1孔，吹吸 3 次，再吸此孔50微升

到第2孔，依次类推，最后到11孔弃去50 微升。稀释度分别为1：2、1：

4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：

2048。

(3)空白12孔生理盐水50 微升，做阴性对照。

(4)1—12孔各加入0.5%红细胞50 微升，阴性对照也加入50微升0.5%红细胞。

(5)在微量振荡器上振荡2min，放入湿盒中，25℃、15min 后开始观察到60min 。

(6)判定病毒血凝效价，记录。

4、将尿囊液按每ml 加500 单位青链霉素，杀菌、4℃保存，同时加入0.1%甲醛灭活，

4℃ 1天。(一般合格弱毒疫苗病毒效价在1：512 以上)。

5、尿囊液冰冻保存。留做灭活油乳苗用。

五、思考题：

1、记录你测的血凝效价是多少？是否合格？

2、为什么血凝试验可测鸡新城疫病毒的效价？

5

实验四鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备

原理：油类是非特异性免疫佐剂，通过一定方法将水剂灭活疫苗和油类乳化在一起，

可提高该疫苗的免疫效果。

目的要求：要求学生掌握灭活油乳苗的制备方法。

材料：白油、吐温-80 、司本-80 、硬脂酸铝、新城疫灭活水剂苗、高速捣碎机、量筒、

烧杯、离心机、1ml 吸管、离心管。

方法步骤：

四、

1、预准备：油相：将白油中加入2%硬脂铝酸、6%司本-

80、加热溶化（160-170℃

半小时），分装500ml 瓶中，116℃灭菌30min，备用，同时灭菌吐温-80 。

2、制水相：将水剂疫苗中加入4%吐温-80 ，高速搅拌2-5min 。

3、乳化：将油相加入捣碎机中，

缓慢搅拌，慢慢加入水相（1：1 或1：2，水：油相），然后高速搅拌5min，即成。

4、检查：

（1）黏度检查：吸1ml 油乳苗放出（垂直）0.4ml 为15s，此为适用黏度。

（2）稳定性：3000r/min 离心15min 不分层。

六、

作业：

1、记录操作方法和过程。

2、油水能乳化在一起的原理是什么？

3、你做的油乳苗性能是否符合标准？影响因素有那些？

6

实验五氢氧化铝胶和蜂胶的制备

一、原理：明矾水和氨水起反应生成铝胶。铝胶是一个比较好的免疫佐剂，具有吸附沉淀、包埋

作用、可增强免疫效果。蜂胶的溶解和测定等级

二、目的要求：要求学生掌握氢氧化铝胶的制备方法。

2KAI （SO4）2?12H2O+HN 4OH——2AL（OH）3+K2SO4+3（NH4）+24H2O

三、材料：明矾、水桶、电炉、氨水、搅拌器、PH 纸、纱布、棉花。

四、方法步骤：

1、明矾水的准备：先将明矾砸碎，将水烧至80℃左右，将明矾按20%加入、搅拌、溶

化、澄清10-30 分钟、虹吸上清液纱布棉花过滤。

2、合成：将60℃的明矾水搅拌，边搅边加入氨水（缓慢加入），当出现浓稠时，PH 约

8 左右，停止加氨水。

3、打碎混匀。将已合成胶放入打碎机中，打磨 2 遍。

4、洗去SO42ˉ离子：将胶放入水桶1/4 —1/5 ，补充干净水（纱布棉花过滤）到满桶，

每天澄清1 次，同时倒去上清水，再补充水，连续4 次，以洗去SO42ˉ。

5、将制成胶装500ml 瓶，高压灭菌备用。

五、示教：磷酸三钙制备

先配20%磷酸氢二钠和20%氯化钙灭菌。在灭活菌液100ml 中加入2.5ml20% 氯化钙，摇匀，然后缓慢加入20%磷酸氢二钠7.5ml ，搅拌匀，即成絮状磷酸三钙佐剂疫苗。六、蜂胶制备：

1）酒精融化：一班称50 克蜂胶，4度下砸碎，倒入200毫升95%酒精中融化

24h。

2）第2 天滤纸过滤，渣滓45度烘干，第3 天称重，算出蜂胶等级，以及每毫升酒精蜂胶含量。

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3)使用，按疫苗每毫升加10mg，摇匀。

六、作业：

1、铝胶佐剂有何优缺点？

2、记录铝胶制作过程。

3、你测的蜂胶等级是多少？

实验六法氏囊炎病高免卵黄的制备

一、目的要求：掌握法氏囊病高免卵黄抗体的制备过程和技术。

二、原理：鸡蛋蛋黄中有卵黄抗体，通过人工免疫母鸡法氏囊疫苗多次，卵黄中就有较高的

法氏囊炎病毒的抗体，提取该抗体，就可以用于治疗和预防鸡法氏囊炎病。

三、材料：法氏囊炎油乳灭活苗、捣碎机、高免鸡蛋、青霉素、链霉素、纱布、0.1%新洁

尔灭、水桶、生理盐水。

四、方法步骤：

1、免疫母鸡：提前1 个月用法氏囊油乳灭活苗免疫鸡3 次，每次1.5ml，10 天免疫1

次，最后免疫后到10 天收蛋，测效价、符合1：128以上即可制法氏囊卵黄抗体。

2、洗高免鸡蛋：将高免鸡蛋置0.3%新洁尔灭溶液中，擦洗消毒、凉干。

3、分离蛋黄：将高免鸡蛋打开两瓣，将蛋清倒入桶中，留下蛋黄备用。

4、制高免蛋黄液：按蛋黄和生理盐水1：3比例制备，先将8个蛋黄约120ml 倒入捣

碎机中，开机10秒打匀，停机加入约360ml 生理盐水并加各20万青、链霉素，再

捣碎开机1-2 秒，一层纱布过滤分装于无菌瓶中，即成。零下5-10 ℃保存。若有鸡

发生法氏囊炎病，按1-2ml/kg 肌肉注射该抗体，即可起到治疗和预防作用。

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五、思考题：

1、制高免卵黄为什么要选用健康母鸡接种？

2、制的高免卵黄为什么要加青、链霉素？

实验七法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定

一、目的要求：掌握法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定方法。

二、原理：法氏囊炎病毒和法氏囊炎卵黄抗体在琼脂凝胶中可以自由扩散，当抗原和抗体相遇

时，出现白色沉淀线。以此测定卵黄中的抗体效价。

三、材料：法氏囊炎病毒抗原、法氏囊炎卵黄抗体、打孔笔尖、移液器、滴头、微量反应

板、酒精灯。

四、方法步骤：

1、制琼脂平板：将8%的氯化钠盐水中加入1%含量的琼脂，加热煮沸溶化，加入0.1%

石炭酸防腐，等冷至50℃时倒入平皿中，厚3-4mm 。

2、打孔：按中心打1 孔，周围打6孔，周围孔与中心孔距离4mm。呈6 角雪花型，用

笔尖头挑出孔中琼脂、最后平皿底在火焰上过几次封底。

3、稀释抗体：

（1）用移液器加入微量反应板1-6 孔中各50 微升生理盐水。

（2）换1滴头用移液器吸50微升卵黄抗体，加入第1 孔中，吹吸3次（1：2），再在此孔中吸50微升到第2孔中，吹吸3次（1：4），再吸此孔液到第3

孔，依次类推，逐步稀释成1：16，1：32、1：64 的稀释度。

4、加样：用移液器换1 滴头，中心孔加入法氏囊炎抗原，再换1 滴头在周围孔分别加

1：64、1：32、1：16、1：8、1：4、1：2 稀释的抗体。要从高稀释度到低稀释度

吸液体、加入，防止拖带现象。每个孔加满为止，不要外溢，一般为15 微升。

5、反应：将所做平皿标记、贴标签，放20℃室温，24-48h 内观察沉淀线。

6、判定：中心孔和周围孔出现白色的沉淀线为阳性发应。一般要求制好的卵黄抗体效

价达到1：16 以上，原液在1：128以上。

五、思考题：

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1、记录你测的卵黄抗体效价。

2、琼脂扩散的原理是什么？沉淀线什么样的特异的，什么是非特异线？

实验八兔瘟灭活苗的制备

一、目的要求：掌握兔瘟灭活疫苗的制备方法。

二、原理：兔瘟病毒高含量存在病死兔的肝脏中，给健康兔接种强毒毒种致死，取肝脏打碎、

过滤灭活即成。

三、材料：兔子、注射器、兔瘟毒种、剪子、镊子、解剖刀、捣碎机、移液器、滴头、微量反

应板、甲醛、疫苗瓶。

四、方法步骤：

1、接种毒种：用没有免疫过兔瘟的兔子，肌肉注射5ml 毒种，观察体温、症状。特

征为突然发病，呼吸困难，出血性败血病变死亡。

2、解剖：病死后，解剖，观察实质脏器是否出血，肺、肾、肝有花斑样外观，淋巴结出

血。取肝脏、肾、肺、淋巴结为病料。

3、打浆：按脏器：生理盐水为1：5在组织捣碎机中捣碎，装入三角瓶中，冻融 3 次，

用4 层纱布过滤。

4、测效价：用生理盐水将病毒液在微量反应板上对比稀释1：2、1：4、1：8、1：16、

1：32、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，同时每孔加入等量2%人

的红细胞悬液，摇匀，3-5min 出现结果，判定血凝效价。决定疫苗最后稀释度，一

般血凝效价在1：512 以上。

5、灭活：按病料溶液量，按0.4%加入甲醛，37℃灭活24h。若有凝固沉淀，再用纱布

过滤一次。

6、无菌检测：将制好的灭活苗接斜面培养基，37℃培养24h，应无细菌生长。

7、安全试验：将制好的灭活苗肌肉注射2只健康兔，每只肌肉注射2ml，观察3 天，

兔子健康，说明疫苗安全。

8、将制好的疫苗无菌分装于20ml 疫苗瓶中，封蜡、贴标签、2-15 ℃保存1 年，同时

每只兔子均注射1ml，3-4 天产生免疫力，免疫期半年以上。

五思考题：

10

1、为什么要用没免疫兔子接种强毒？

2、记录兔瘟灭活疫苗的制备过程。

实验九大肠杆菌自家灭活苗的制备

一、目的要求：通过一周实习，使同学们掌握大肠杆菌的分离鉴定及大肠杆菌灭活苗的制备方

法和技术。

二、原理：大肠杆菌血清型很多，不同猪场血清型不一致，采自家场仔猪黄白痢粪便，分离致

病大肠杆菌制成灭活苗，对本场防仔猪黄白痢具有较强的针对性。

三、材料：黄白痢病料、伊红美蓝培养基、小白鼠、注射器、牛肉膏、蛋白胨、肉汤培养

基、甲醛、接种环、酒精灯、血平板、平皿、试管、兔子、吸管、铝胶、量筒。

四、步骤：

1、分离大肠杆菌：用接种环沾仔猪黄白痢粪便划线于伊红美蓝培养基平板上，37℃培

养24h 。大肠杆菌为紫黑色金属光泽菌落。

2、检测致病性：

（1）挑紫黑色金属光泽菌落接血平板，37℃，24h 培养观察有无明显溶血环，有溶血环的为致病性的大肠杆菌。

（2）小白鼠致病力试验，将典型的大肠杆菌菌落接种肉汤试管，培养6-10h，每个菌株接种2 只小白鼠，腹腔注射0.2ml ，观察3 天。在3 天内死亡的为

致病性大肠杆菌。

（3）有条件的情况可检测大肠杆菌的肠毒素及做K88 、K99 、P987 等抗原的鉴定。

3、制牛肉膏蛋白胨液体培养基，每组做300ml （配方：牛肉膏1.5g，蛋白胨3g，氯化

钠1.5g，PH7.6 ，水300ml ）高压灭菌后备用。

4、接种：将检测鉴定的大肠杆菌，由无菌肉汤加入到斜面培养物中，洗脱下菌苔，每个斜

面菌接300ml 肉汤，标记菌株班、组、日期。接种后37℃、24h 培养。

5、计算菌数：按菌落总数测定方法进行：

（1）灭菌：包装的平皿、试管、生理盐水、吸管和营养琼脂。

（2）将培养的大肠杆菌液按1：9 的比例进行稀释，逐步稀释到10ˉ8。

（3）用无菌吸管各吸三个稀释度10--6~-- 8各1ml ，分别加于2个无菌平皿中，并标记，然后将灭菌冷至45-50 ℃的营养琼脂倾注到加稀释液平皿中，每个约

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15-20ml 培养基，摇匀，37℃，24h 培养。

（4）按照菌落计数标准，计30-300 个菌落数的平皿的实际菌落数，平均2 个平皿菌数（以备菌苗最后浓缩的比例，大肠杆菌灭活苗每ml 应含菌50 亿以

上）。

6、灭活：将以培养液按0.25% 甲醛的量加入，37℃灭活24h。

7、无菌检查：将灭活的大肠杆菌菌液，用接种环沾一环，接种划线于营养琼脂斜面，

37℃24h 培养，观察有无菌落生长，无菌生长说明灭活彻底。

8、加佐剂：将已灭活的菌液按20%的量加入氢氧化铝胶，摇匀后，静置24-48h ，倾去

上清夜，以浓缩，使其达到较高含菌量（按菌数计算来浓缩，一般可以浓缩2-3

倍）。

9、安全试验：将已制好的菌苗接种2 只兔子，每只注2ml 菌苗，观察3 天，应健康无

病。

10、分装：将已灭活浓缩的菌苗，无菌分装于20ml 疫苗瓶中，2-15 ℃可保存一年。贴

上标签，注明疫苗名称、使用方法、保存方法、制造时间。

11、使用：母猪产前1 个月肌肉注射5ml 菌苗，产前15 天再注射5ml 菌苗。母猪获得

免疫，仔猪出生后，通过吃初乳可被动获得免疫。

五、思考题：

1、大肠杆菌灭活苗为什么自家疫苗效果好？

2、大肠杆菌的致病性有哪些方面？

3、熟练掌握大肠杆菌自家灭活苗的制作程序。

4、鉴定大肠杆菌的生化实验有那些？

实验十动物试验

一、目的要求：

1、掌握常用实验动物保定法和接种法

2、掌握实验动物的剖检法及病料中病原微生物的检查

二、原理：生物制品的菌种毒力、免疫效果、制剂的安全等，都需要实验动物来完成。

三、材料：1ml 卡介苗注射器、小白鼠、兔子、生理盐水、炭疽弱毒疫苗、剪刀、镊子、酒精棉球、解剖板，大头针、5% 石炭酸消毒液、显微镜、酒精灯、载片、染色液等。

四、内容和步骤：

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（一）、实验动物保定法（教师示教操作）1、小白鼠保定法：右手拿镊子先夹着小鼠尾巴，让其前腿抓着一物体，后退悬空，左手食指和大拇指迅速夹捏紧鼠两耳之间的皮肤，使其头被固定，然后，将鼠背部拉在左手心，无名指和小指压紧尾巴，即固定。

2、家兔保定法：可有兔子固定架固定，即兔背躺固定板，固定四脚。另有固定盒子，兔子装入后，卡好，仅露头部。其次是人工手固定，左手食指和拇指把兔子前右腿翻之背部固定，左手中指和无名指把兔子左腿翻转固定于背部，右手抓后两腿拉紧，使兔子背部躺在桌子上，四腿被前后拉紧，兔子呈仰卧，另一助手可进行接种或心脏采血操作。

（二）、实验动物人工接种法。（用生理盐水练习）

1、练习注射器的使用，用生理盐水，练一个手拿注射器吸生理盐水，会排注射器空气，

针头前加酒精棉球，防止有毒液体污染环境。练到得心应手时，可以进行下步操作。

2、皮下注射法：小鼠：0、2--0.5ml ，针20---30°刺入真皮下0、5-1cm，在皮下结缔组织（有鼓包可以看出）。

3、腹腔注射法：小鼠：2ml：兔子5ml 。将小鼠后部抬高位置，使内脏前移，然后在两后腿之间皮肤往前进针1---5cm ，回针抽有空气，说明是腹腔，然后即可以注射。

4、肌肉注射法：（皮下注射剂量），在鼠的后腿肌肉或兔子肌肉进针0、5—1cm，可注射。（最后一只小白鼠注射0、5ml 炭疽疫苗，标记）

5、静脉注射法：

小白鼠尾静脉，酒精棉球搽或40 度热水烫红尾巴，用5 号针头，顺血管平行刺入，如果注射看血管血后退，说明正确。

兔的耳外侧静脉，指头弹几次耳朵，使之充血，然后用5 号针头平行血管进针，如果注

射在血管外，会有鼓包。

（三）、实验动物解剖

尸体—（5%石碳酸）（或75%酒精消毒）—将小白鼠背躺解剖板，四肢拉开大头针固定（灭菌剪刀）—胸腹部真皮剪开—（75%酒精消毒）—腹肌肉消毒—（灭菌剪刀）—打开腹肌和胸肌——观察器官病变、采取病料、抹片、染色、镜检——尸体焚毁或5%石炭酸

浸泡过液。

解剖注意观察，皮下、内脏、淋巴结有无出血、坏死、腹腔或胸腔有无积水，找出心脏、肺、肝、脾肾等脏器。然后涂片和染色，显微镜检查或接种合适培养基培养检验。

三、思考题：

1、动物实验目的是什么？

2、保定和接种方法有那些？

13

3、实验动物尸体剖检应在什么条件进行，剖检后可进行哪些检验工作？

实验十一、鸡白痢染色平板诊断抗原的制备及使用

一、目的：通过本实验，使学生掌握一般凝集实验抗原的制备方法。

二、原理：细菌颗粒性抗原经过处理可以作为凝集抗原，用已知抗原可以检测未知抗体，检

测传染病或评价抗体水平高低。

三、材料：标准鸡白痢菌种，平板培养基，生理盐水，1ml 吸管，10ml 吸管，L 涂抹棒，

接种环，酒精灯，甲醛，离心机，甘油，10%酒精溶解的结晶紫，ph7.2PBS，95%酒精，玻片，美蓝染色液，显微镜等。

四、步骤和方法：

1、增殖细菌：将约4ml 生理盐水，加入斜面标准鸡白痢菌种，接种环反复刮洗，取1ml 菌液

放于平板内，用L 涂抹棒刮匀涂抹接种于营养琼脂平板，37℃24 小时培养（此步骤应该提前1-3 天学生进行，为节省时间）。

2、洗脱菌液：已经培养好的平板内，加入2%甲醛PBS缓冲水5ml，用L 棒反复刮洗，倒入

小烧杯中，另再加2-3ml 涮洗平板，液体也倒入烧杯。

3、洗菌及离心：将菌悬液内加入等量的95%酒精，作用沉淀半小时，然后离心。

4、配适当浓度菌液：按菌液离心后的体积，按1：9 加1%甲醛PBS，摇匀，接种环一环涂

片，直径在0.5-1cm ，干燥和固定，美蓝染色2 分钟，显微镜检查，达到一个视野50-100 个细菌（3 亿/ml 合格浓度），浓度调整可以加1%PBS调整。

5、染色诊断抗原：菌液加结晶紫酒精溶液（3/10000 ）和甘油（加入10/100 ），摇匀，放

密闭小瓶保存2-8 ℃，3 年有效。

6、检测使用：摇匀使用，取0.05ml 抗原滴于玻璃板上，采成年鸡血或鸡血清0.05ml 与抗

原混匀，2 分钟判定结果，出现50%以上凝集者为阳性，不反应为阴性。阳性种鸡应该淘汰。

7、Ph7.2PBS配置：磷酸氢2 钠1.48 克,磷酸2 氢钾0.43 克,氯化钠6.8 克, 蒸馏水

1000 毫升,先加热溶解磷酸氢2钠,再加磷酸2 氢钾和氯化钠,补足蒸馏水.

五、作业及思考题：

1、凝集诊断抗原诊断传染病的原理是什么？

2、你做的抗原效果怎么样？那些地方需要改进？

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实验十二、免疫血清的制备

一、实验目的和内容目的：学习和掌握免疫血清的制备方法，为凝集反应和沉淀反应准备凝集素

和沉淀素。

内容：1、抗大肠杆菌血清(凝集素)的制备。

2、牛血清白蛋白抗血清(沉淀素) 的制备。

二、实验材料和用具

体重2~3kg 的健康雄家兔、大肠杆菌(E. coli) 斜面菌种；

牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL) 、牛肉膏蛋白胨斜面培养基、0.3%甲醛液(用

0.85% 生理盐水配制)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒干棉球；

细菌比浊标准管、无菌吸管、无菌注射器(5mL 、20mL) 、注射针头(5 号，B19)、无菌试管、装有玻璃珠的无菌血清瓶、解剖用具(解剖台、兔头夹、止血钳、解剖刀、眼科剪刀、

镊子、动脉夹等) 、双面刀片、丝线、玻璃管、胶管、离心机及无菌离心管、普通冰箱、超净工作台、水浴箱。

三、操作步骤

(一)凝集素的制备

1．凝集原(颗粒性抗原)的制备

(1)取37C 恒温培养24h 的牛肉膏蛋白胨大肠杆菌斜面。

(2)每支斜面菌种中加入5mL0.3% 甲醛液，小心地把菌苔洗下制成菌液。

(3)用无菌清洁吸管，吸取以上菌液，注入装有玻璃珠的无菌血清瓶内，振荡

10~25min ，分散菌块制成菌悬液。

(4)将含菌悬液的血清瓶置于60℃的水浴箱中水浴1h，并不时摇动，把菌杀死。

(5)将菌悬液重新接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，37℃培养24～48h，如有菌生长，则要在60℃水温中再处理。若无菌生长则进行比浊测定其含菌量。

(6)凝集素的制备

(1)免疫方法：选择2～3kg 健康雄免，从耳缘静脉采血2mL ，分离出血清。该血清与准备免疫用的抗原进行凝集反应，以检查有无天然凝集素。如没有或只有极微量时，该动物便可用来免疫。

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最常用的免疫途径是耳缘静脉注射。将家兔放在家兔固定箱内，一手轻轻拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外侧边缘静脉处消毒，然后用酒精棉球涂擦，并用手指轻轻弹几下静脉血管，使其扩张。消毒细菌悬液瓶塞后，用无菌注射器及5 号针头吸取菌液，沿着静脉平行方向刺入静脉血管，并慢慢注入菌液，注射完毕，用干棉球按压住注射处，然后拨出针头，并压迫血管注射处片刻，以防止血液向外溢出。注射时发现注射处隆起，不易推进时，表明针尖不在血管中，应拨出针头，重找位置再注射。有时针尖口被堵塞，菌液推不进去，应及时更换针头。注射途径、剂量和日程安排等视抗原和动物不同而有所不同。大肠杆菌免疫家兔的抗原注射剂量和日程安排如下表：

(2)试血：通常于最后一次注射后7~11d，从兔耳缘静脉抽取2mL 血，分离析出血清，用试管凝集反应测定抗血清效价。效价合格即可大量采血，如效价不高，可继续注射抗原免

疫，提高效价。

(3)采血：采血分为心脏采血和颈动脉放血。

心脏采血：使免疫家兔仰卧于台上，四肢固定。用左手探明心脏博动最明显处，用碘酒

棉球与酒精棉球消毒后，右手握消毒过的20mL 注射器和B19 号针头，在上述部位的肋骨间隙与胸部呈45°角刺入心脏，微微抽取针筒，此时可发现血液涌入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg 家兔一次可取血20~30mL 。取血完毕后，用消毒棉球按压进针处迅速拨出针头，进针处用棉球继续压住。并马上将所采的血液注入无菌大试管内，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒温箱中30min，使血清充分析出，然后放入4~6C 冰箱中。

颈动脉采血：将免疫家兔固定于兔台上，用少量乙醚麻醉，剪去颈部的毛，然后用碘酒

棉球和酒精棉球消毒。沿正中线将颈部皮肤切开到锁骨间，拨开肌膜，暴露出气管，在气管深侧处找到搏动的颈动脉。小心地将颈动脉和迷走神经剥离分开4~5cm 。用镊子拉出颈动脉，用丝线扎紧血管的离心端，在血管的向心端用止血钳夹住。然后用眼科剪在丝线与止血钳之间的血管上剪一个V 型小切口，将弯咀眼科镊自切口插入，使其张开，同时将一小玻管插入，用丝线扎紧，以防玻管脱漏。玻管另一端接入一条胶管，胶管通入大试管(或大离心管) 内，然后将止血钳慢慢松开，使血液流入试管，直至动物死亡，无血液流出为止。

(4)抗血清分离与保存：取凝固血液于4000r/min ，离心20min，获得抗血清(即凝集素)。

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加入石炭酸或硫柳汞使其浓度分别达到0.5%或0.01% 。测定抗血清的效价后，封好瓶口，

贴好标签，注明抗血清名称、效价及日期，置冰箱保存备用。

(二)沉淀素的制备

抗原为可溶性抗原（如脂多糖、类毒素或可溶性蛋白等）。通常每kg 兔体重注射2mg 蛋白，牛血清白蛋白抗原浓度为 1.5mg/mL ，则2.5kg 兔应注射5mg 蛋白。免疫方法、采血方

法和抗血清（沉淀素）的分离可参照凝集素制备方法，但效价测定则用沉淀反应来测定。

四、注意事项

由于每个动物对免疫反应不同，产生的抗体效份有高有低，所以在制备抗血清时至少免疫两只家兔。如须保留该免疫动物，刚采取心脏直接取血，取血后应从静脉注射等体积的50%葡萄糖溶液，经过2~3 个月的饲养，方可再次免疫。若不保留动物须一次取大量血时，则采用颈动脉放血法。

五、演示

1．耳缘静脉注射抗原的方法。2．心脏取血的操作过程。

六、实验报告

1．记录免疫家兔的操作过程及免疫过程中兔的反应。2．实验操作过程的体会。

七、问题和思考1．如果不用生理盐水来配制抗原，以这样的抗原免疫兔成不成？为什么？2．现有一支苏云金杆菌（Bacillus thuringinesis ）斜面菌种，你能否制备出相应的凝

集素？阐述其主要步骤。

实验十三、细菌冷冻真空干燥实验

一、目的要求：要求学生掌握疫苗冷冻干燥技术的步骤及原理。

二、原理：水剂疫苗加保护剂，冰冻后，真空干燥，可最大程度的保护细菌和延长保存期。

三、材料：细菌肉汤培养物，12%明胶、40%蔗糖保护剂，冻干机，4 脚塞，疫苗瓶。

四、步骤：

1、配保护剂，将保温37 ℃ 、7ml 细菌肉汤培养物加保温37℃、1ml 的12%明胶、

40% 蔗糖保护剂，摇匀。

2、分装，将加保护剂的细菌加入疫苗瓶约1ml ，高度约0.5cm。

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3、半加塞，将4 脚塞半按于瓶子。

4、冰冻，将装疫苗瓶子放—40℃低温冰柜中冷冻3-4 小时。

5、抽真空，将疫苗瓶均匀摆放冻干盘中，制冷和抽真空到10-30Pa ，时间20-30 小时。

6、压塞，观察冻干成功，转动压杆压塞。

7、关冻干机，取出疫苗，8℃冷藏保存。

五、作业：掌握冻干的原理和步骤。

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