综述-单克隆抗体的研究报告进展

单克隆抗体的研究进展

摘要：单克隆抗体近年来发展迅速，并广泛应用于医学，生物学，免疫学等多种学科。单抗药物可用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是用于治疗肿瘤，已显示出良好的前景。本文参阅近10年国外相关文献，并进行整理，综述单克隆抗体的研究进展，着重阐述用于治疗肿瘤的单克隆抗体应用中存在的问题、解决方法以及研究的展望。

关键词：单克隆抗体；抗肿瘤药物；治疗

单抗药物治疗疾病具有明确的靶向性，作用机制明确，因而具有起效快、疗效好、副作用小等优点。尤其是对肿瘤的治疗，能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。同时，单克隆抗体体积小，能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后，可较快被清除；循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障，因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物，把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位，利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别，从而把药物直接导向肿瘤细胞，提高药物疗效，降低药物对循环系统及其他部位的毒性[1]。

1作用机制

目前，单抗的作用机制并不十分明确，通过研究，目前认为有阻断作用、信号传导作用以及靶向作用等三种作用机制[1]。

1.1阻断作用

现用于临床的大部分未偶联单抗主要用于自身免疫和免疫抑制，是通过阻断和调节作用完成的。几乎在所有的单抗应用中，通常是通过阻断免疫系统的一种重要的胞桨或受体-配体相互作用而实现的。另一种相类似的阻断活性可能存在于单抗的抗病毒感染中，通过阻断和抵消病原体的进入和扩散表现出对机体的防御功能，短期给予单抗后可取得长期疗效。肿瘤细胞生长、扩增和分化，需要各种生长因子的持续性刺激，而这些生长因子也参与肿瘤的侵润、转移和血管生成，单克隆抗体与其受体结合，可抑制配体-受体的相互作用，从而使得这些肿瘤细胞得不到生长因子的刺激而自行死亡。贝伐单抗通过结合VEGF受体，阻断VEGR与受体的结合，抑制皮细胞增殖或者血管生成，抑制病灶转移[2]。

1.2信号传导作用

许多抗癌单抗是通过恢复效应因子，直接启动信号机制而获得细胞毒效应的。对Trastuzumab而言，单抗结合可诱导一系列在肿瘤生长控制中起作用的信号传递，该抗原是生长因子受体家族的一个成员，能

提供重要的有丝分裂信号，其单抗似乎能阻断与促进肿瘤生长有关的重要的配体—受体相互作用[3]。

1.3靶向作用

单抗靶向肿瘤细胞的首要目的是产生肿瘤特异性反应物，然后由免疫系统中的活化因子将其消灭。但现在对体的抗体—效应因子作用机制发挥程度还不清楚，也不清楚能否作用于大量肿瘤细胞。

2单克隆抗体药物应用现状

单抗药物一般分为：治疗疾病（尤其是肿瘤）的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。

单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如：最早被美国FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗。抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物（Immunoconjugate）由单抗与有治疗作用的物质（如：放射性核素、毒素和药物等）两部分构成，其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物，此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等[4]。化学药物与单抗相结合的偶联物，作用于病变区域，不但提高药物的疗效，而且还能降低药物对各脏器组织的细胞毒性。单抗与放射性同位素的偶联物，即放射免疫偶联物，其与化学药物连接在一起，起一种双“弹头”的靶向作用，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效应、提高对肿瘤细胞的细胞毒性。毒素与单抗的偶联物，免疫毒素来源于植物或细胞毒素由于有强烈的毒性很难作为治疗剂使用，但毒素与单抗的偶联物可在动物模型中显示疗效。

单抗由于具有诸多优点，在疾病的治疗中发挥了重要的作用。在恶性肿瘤治疗方面，无论是单抗为主，还是单抗耦联放射性物质、化疗药物等的免疫治疗，都取得了较好的效果。在其他疾病（如过敏性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、器官移植、自身免疫性疾病等）以及一些临床上疑难病的治疗上也取得了新的进展，使疾病的治疗有了更广的选择性，不再局限于原有药物的治疗，特别是人源化程度较好的抗体的使用，已大大减少了异源性反应[5]。

3单抗应用中存在的问题及解决途径

单抗药物的临床研究结果已展示出良好的前景,但仍有些问题需要进一步研究解决。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面：

3.1免疫学方面问题

主要是人抗鼠抗体(HAMA)反应。因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备,往往导致HAMA反应。此外，肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性，可能影响单抗药物的疗效。Maki Goto等[6]研究发现在单抗治疗结直肠癌之前，患者的血清中就有HAMA相关反应，临床医师在使用抗体治疗时应该警惕HAMA表达的可能性。

对于免疫学方面的问题，仍有许多需要研究的地方，现在解决的方法一般是降低药物的免疫原性，主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌合抗体或

改形抗体，嵌合抗体是将Fc段置换为人源性，其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外，其它部分均为人源性。临床研究表明，嵌合抗体的副反应轻，HAMA反应率较鼠源性单抗低，在血中半衰期也较长。

3.2 药理学方面的问题

主要是到达作用部位的药量不足。单抗药物具有体分布特异性，但有研究表明，能到达作用部位的药物量仍属有限。据推算，肿瘤组织的单抗摄取量约为0.005% (注入剂量/克组织)，说明可到达靶部位的药物量甚少。单抗药物在体运送过程受多种因素影响。由于它是异体蛋白，会被网状皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓。单抗药物是大分子物质，通过毛细血管皮层以及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。此外，部分偶联药物分子质量过大，难于透过毛细管皮层和穿过肿瘤细胞外间隙进入肿瘤深部滞留，也是一个急需解决的问题。

解决方法主要是提高单抗药物在作用部位的浓度。

第一，为提高药物在肿瘤的浓度,单抗药物分子的小型化是研制的重要途径。使用抗体片段，如Fab、双特异性抗体（bsAbs）、单链可变区片段(scFvs)制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量[7]。

第二，采用局部注射。据报道，Jamerson SC等[8]采用玻璃体注射贝伐单抗，用于治疗假性脑瘤，发现颅压下降，并且脉络膜新生血管减少。此外，抗血管生成皮生长因子药物(anti-VEGF) 的玻璃体注射广泛用于治疗年龄相关性黄斑病变（AMD）和其他疾病的脉络膜新生血管，并且有良好的效果[9]。

第三，利用药物制剂新技术，研究增加药物在作用部位的浓度。抗体药物也是属于蛋白类，注射给药后，由于肾的滤过，抗体和细胞的识别，以及物理降解，使得药物在体迅速清除掉。PEG与化合物相连，能够增加血清半衰期，减少免疫原性并增加生物利用度。如果将PEG与抗体或者抗体片段连接，将有可能延长药物在体的循环时间。近年来，一些研究人员对scFv, Fab等抗体片段进行PEG化修饰，scFv的PEG 化能降低mAbs的免疫原性，简化单抗的生产的步骤，PEG-scFv共轭物具有与mAbs不同的清除速率和途径[10]。基于这点，新的可释放的PEG化设计可能用于抗体药物[11]。

单抗药物在体半衰期短，需要重复给药，从而限制了它的使用，理想的释放模型是，先快速释药，然后以一个比较稳定的速率恒定释药。研究表明，脂质体具有缓释作用，能够缓慢释放，延缓肾排泄和代，从而延长作用时间；同时能够降低药物毒性，提高稳定性，如可提高胰岛素脂质体、疫苗等的稳定性。脂质体已经广泛应用于蛋白多肽类的药物，但是对单抗的给药系统研究很少，目前报道的有Majid Abrishami 等[12]用脂质体包载贝伐单抗，用于玻璃体注射给药，与市售制剂相比，使得半衰期延长，曲线下面积是后者的1.5倍，同时也降低了毒副作用。但是，使用脂质体包载单抗的包封率很低，只有40%左右，这将成为脂质体用于单抗给药系统的一个瓶颈，需要进一步地探索。

4展望

抗肿瘤单抗药物研究经历了比较曲折的发展过程。80年代迅猛发展，90年代初期一度处于低谷，以

至近年再度成为生物技术药物领域研究的热点。单抗药物研究的发展趋势具有以下特点：

4.1单抗的人源化及小型化

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上，创建杂交瘤技术，实现了结构、氨基酸顺序、特异性等都一致的单抗（McAb）大量地、高滴度地、均一地生产。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的，从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，使得单抗的在很多疾病的诊断和治疗中，有着不可替代的优势。但是第一代单抗（英文名后缀是：-momab，如Ibritumomab,T ositumomab）是鼠源的，会引发人体抗鼠单抗免疫反应(HAMA)，引起严重的安全性问题，并限制了单抗的药效。为了克服这个缺点，人们制备了人鼠嵌合单抗(后缀: -ximab, 如: Cetuximab)。它是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体[13]。这样既能保持鼠单抗的特性，又降低了单抗在人体的免疫反应。这种单抗大约有1/3是鼠源，仍有引起潜在的免疫原性的可能，因此，人源化的单抗(后缀: -zumab，如：trastuzumab, matuzumab)发展起来。人源化单抗大概含有10%的鼠可变区片段，也能诱导免疫原性，但是并不会完全地排除。为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力、质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体(后缀: -mumab, 如:panitumumab, zalutumumab)，主要有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术和核糖体展示技术[14]。这种完全人源化的单抗具有最小的免疫原性或者根本没有免疫原性[15]。

近年来，随着抗体基因结构的阐明，DNA重组及转基因技术开始用于抗体的改造，抗体的研发进入了第3代，即基因工程抗体时代，如人源化抗体、单链抗体、抗体片段（包括抗原结合片断（Fab）、可变区片段(Fv)、单链可变区片段(ScFv))、小分子抗体、某些特殊类型抗体（双特异抗体、免疫脂质体）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫粘连素）等。与第2代单抗相比，基因工程抗体免疫原性低、特异性高、穿透力强，并且可以大量表达，大大降低了生产成本[16]。

4.2偶联物分子的小型化及修饰

庞大的偶联物分子难以通过毛细管皮层和细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化单抗药物对提高疗效有重要意义。通过酶切方法可得到单抗(Fab)2或Fab片段，其相对分子质量分别相当于原抗体的2/3和1/3左右。通过基因工程技术制备的Fv片段或单链抗体scFv，相对分子质量约相当于抗体的1/6。研究表明，Fab片段较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞[17]。

使用上述小型化抗体制成的单抗药物,在药代动力学方面将具有新特点，并可能减少或推迟人体的抗体反应。分子的小型化无疑是研制高效单抗药物的一条重要途径。

4.3寻找新的靶点

目前，在临床应用和已进入临床试验阶段的单克隆抗体抗肿瘤药，根据其作用靶位不同被分成7类，分别为人类表皮生长因子受体（Human epidermal growth factor receptor，HER）、细胞分化抗原（Cluster

of differentiation，CD）20、血管皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）/VEGF受体（VEGFR）、胰岛素样生长激素-Ⅰ受体（Insulin-like growth factor-Ⅰreceptor，IGF-ⅠR）、凋亡增强子、整合素、细胞生长因子受体（c-Met）等。其中，针对HER受体、CD20和VEGF/VEGFR的这3类单克隆抗体已有药物被批准在临床正式应用，另外4类也有药物被批准进入临床试验阶段，主要用于实体瘤和血液系统恶性肿瘤的治疗[18]。

基因序列库和细胞信号的广泛研究，为抗体靶向治疗提供了许多新的靶点，尤其在肿瘤治疗的应用中。单抗对相应的抗原具有高度特异性,这是单抗药物显示靶向性抗肿瘤作用的基础。寻求与肿瘤细胞相关的靶点是研制单抗药物的关键。特定的癌基因表达蛋白、生长因子受体等均可作为单抗药物的分子靶点。例如，TRAIL受体和CEA，这两个靶点很有可能成为未来抗体药研究的重点。

肿瘤坏死因子-凋亡相关-诱导配体受体（T umor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAIL-R），对一些肿瘤组织细胞表达水平较高，一旦该受体被激活，可通过天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤缩小。另外，受体的激活还能增强细胞毒性抗肿瘤药的作用。因此，以TRAIL-R为靶点，通过单克隆抗体激活，可起到抗肿瘤作用。目前，正在开发的此类单克隆抗体抗肿瘤药有Mapatumumab和Conatumumab[19]。前者是TRAIL-1R激动药，后者是TRAIL-5R激动药。

TRAIL受体是相对比较新的研究靶点, 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA)是最早研究的抗体靶点之一，是很多癌症细胞的标志物，但是并没有被癌症生物学广泛研究。但是Stanners等[20]人在2006年提出了CEA在肿瘤形成中的主导地位，以及与肿瘤形成相关的CEACAM6蛋白，使用单价Fab抗体片段结合CEA的特异性亚域，细胞粘附功能被抑制，CEA的肌分化阻塞第二功能被释放。可以预测，CEA即将成为一种很有研究前景的抗体治疗的新靶点。

4.4开发单抗新的用途

单抗广泛地应用于生物界和医学界，目前其主要用于以下几方面：1 作为亲合层析的配体；2 作为生物治疗的导向武器；3 作为免疫抑制剂；4 作为研究工作中的探针；5 增强抗原的免疫原性；6 作为医学检验试剂：(1)诊断各类病原体。这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。Nalbantsoy A等[21]将抗D7单抗用于沙门氏菌引起的肠炎的诊断。(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测。用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。综上所述，随着研究的深入，单抗即将在科研，医药等领域占有举足轻重的地位。

参考文献

[1]红, 段蓉. 单克隆抗体治疗肿瘤的研究进展[J]. 中国医院药学杂志. 2006, 26(11): 1407-1409

[2]Napoleone Ferrara, Kenneth J. Hillan, William Novotny, et al. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF

monoclonal antibody for cancer therapy[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications.

2005,333:328–335

[3]Wanyi Tai, Rubi Mahato, Kun Cheng,et al. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery[J].

Journal of Controlled Release. 2010,146:264–275

[4]文明,童德文,立,等.抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[J].西北农林科技大学学报(自然科学版) . 2006,8,34(8):44-48

[5]王怡,郭潮潭. 单克隆抗体在疾病治疗中的应用进展[J]. 省医学科学院学. 2010,21(2):44-47

[6]Maki Goto, Kageaki Kuribayashi, Yoshifumi Umemori, et al. High Prevalence of Human Anti-mouse Antibodies in

the Serum of Colorectal Cancer Patients[J]. Anticancer Research. 2010,30(10):4353-4356

[7]Mabry R, Snavely M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome

engineering obstacles[J]. IDrugs. 2010,13(8):543-9

[8]Jamerson SC, Arunagiri G, Ellis BD, et al. Intravitreal bevacizumab for the treatment of choroidal

neovascularization secondary to pseudotumor cerebri.[J]. Int Ophthalmol. 2009,29(3):183-195

[9]Cohen SY. Anti-VEGF drugs as the 2009 first-line therapy for choroidal neovascularization in pathologic myopia[J].

Retina. 2009,29(8):1062-6.

[10]Albrecht H, Denardo GL, Denardo SJ. Development of anti-MUC1 di-scFvs for molecular targeting of epithelial

cancers, such as breast and prostate cancers[J]. Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007 Dec; 2007,51(4):304-13

[11]Zhao, H., Yang, K., Martinez, A.,et al. Linear and branched bicin linkers for releasable PEGylation of

macromolecules: controlled release in vivo and in vitro from mono- and multi-PEGylated proteins[J]. Bioconjug.

Chem. 2006,17:341–351

[12]Majid Abrishami, Siamak Zarei Ganavat, Dina Soroush, et al. Preparation,characterization,and in vivo evaluation

of nanoliposomes-encapsulated bevacizumab(Avastin) for intravitreal administration[J]. the journal of retinal and vitreous diseases. 2009 ,29(5):699-703

[13]Makiko Yamashita, Yoshinroi Katakura, Sanetaka Shirahata, et al. Recent advances in the generation of human

monoclonal antibody[J]. Cytotechnology. 2007,55:55-60

[14]泮结超,石君帆.单克隆抗体的制备及其应用研究进展[J]. 省医学科学院学报,2009,9(78):38-41

[15]Fernando Rivera, M Eugenia Vega-Villegas, Marta.Lopea-Brea&Raul Marquez. Current situation of Panitumumab,

Matuzumab, Nimotuzumab and Zalutumumab[J]. Acta Oncologica 2008; 47: 9-19

[16]David Filpula. Antibody engineering and modi?cation technologies. Biomolecular Engineering[J]. 2007,24:201–215

[17]Janice M. Reichert and Viia E. Valge-Archer. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics[J].

nature. 2007,5,6:349-356

[18]梁宁生.单克隆抗体抗肿瘤药研究和应用新进展[J].中国药房.2010,21(14):1261-1264

[19]Kaplan-Lefko PJ，Graves JD，Zoog SJ，et al.Conatumumab，a fully human agonist antibody to death receptor 5，

induces apoptosis via caspase activation in multiple tumor types[J].Cancer Biol Ther，2010，9（8）：1 601 [20]Chan, C.H., Cook, D., Stanners, C.P.,. Increased colon tumor susceptibility in azoxymethane treated CEABAC

transgenic mice[J]. Carcinogenesis. 2006,27:1909–1916

[21]Nalbantsoy A, Karaboz I, Gurhan ID. Production of monoclonal antibody against Salmonella H: g,m flagellar antigen

and potential diagnostic application[J]. Hybridoma (Larchmt). 2010,29(5):419-23