Arg9-人抗HBsAg单链抗体-EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析
Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性
分析
作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢
【关键词】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9
【Abstract】 AIM: To construct R9/ScFv14/EGFP fusion genes and to analyze the binding activity of the fusion proteins after they were expressed in BL21. METHODS: A series of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the genes of ScFv14 and R9/ScFv14. The PCR products were cloned into pMD18T vector, followed by DNA sequencing. R9/ScFv14 gene and ScFv14 gene were ligated with EGFP gene respectively before they were rebined into the expression vector pET32a. After induced in BL21 by IPTG, the expressed fusion proteins named R9/ScFv14/EGFP and ScFv14/EGFP were detected by SDSPAGE and the binding activity of them were analyzed by indirect ELISA. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the two fusion genes were correctly constructed. SDSPAGE analysis showed that they were successfully expressed in BL21 and the percentages of them were 20% and 25% of total bacteria proteins respectively. Indirect ELISA confirmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSION: The two fusion genes were constructed successfully. And the products of them expressed in BL21 maintained the binding activity to HBsAg.
【Keywords】 hepatitis B; hepatitis B surface
antigens; ScFv; Arg9
【摘要】目的：构建带有转膜结构域Arg9编码序列的
R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活性. 方法：设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和
R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性. 结果：经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和
R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDSPAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达，表达量分别占菌体总蛋白的20% 和25%.间接ELISA 检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活性. 结论：成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的
R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大肠杆菌BL21中成功表达，表达产物
ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.
【关键词】肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg9
0引言
单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体.其分子质量仅为完整抗体的1/6，不仅能较好地保持抗原结合能力，并且具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等特点，更有利于体内应用［1-3］. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 是从水母中分离出来的一种发光蛋白,可在A450 nm～490 nm的蓝光激发下发出绿色荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白质之一.EGFP为一种突变型GFP，所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为
标签用于检测目的蛋白及指示目的蛋白的定位. ScFv与效应分子组成的融合蛋白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发挥具有非常关键的作用. Arg9是一个九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白转膜结构域（PTDs）的一种，它能够将与之融合的蛋白携带入细胞内［4］. 我们将抗HBsAg的单链抗体（ScFv14）基因［5］与EGFP基因融合，并将Arg9编码序列融合到ScFv14/EGFP基因的5′端，构建带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合蛋白基因，将它们在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物的亲和活性进行了分析.
1材料和方法
材料含有编码人抗HBsAg单链抗体ScFv14基因的载体pUC19ScFv14、大肠杆菌α株和原核表达载体pET32a（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室构建［5］并保存）；EGFP融合蛋白表达载体pEGFPN3（Clontech公司）；DNA Marker, T4 DNA Ligase, pMD18T vector和限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ, NotⅠ（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海华舜公司）；Werstern blot 显影液（Pierce公司）.
方法
引物的设计与合成根据ScFv14基因序列，设计引物扩增ScFv14基因，
并设计引物将Arg9的编码序列引入ScFv14基因的5′端，引物序列如下： 14F 5′TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3′；14R9F 5′ TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACG
CAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3′； L3 5′ TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3′. 其中划线部分为九聚精氨酸的编码序列.
重组质粒的构建与鉴定以pUC19ScFv14为模板，分别以14F，L3和14R9F，L3为引物扩增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反应条件：95℃ 35 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共进行25个循环.产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收. 回收产物分别连入pMD18T载体,转化α宿主菌，挑取单克隆,提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆命名为pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14，送北京
三博远志生物技术公司测序.将测序正确的pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14
用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，将pEGFPN3用BamHⅠ和NotⅠ酶切，得到EGFP基因片段.分别将ScFv14和
R9/ScFv14基因与EGFP基因在16℃条件下连接4 h后，再连入经EcoRⅠ和NotⅠ酶切的表达载体pET32a中，转化α后，筛选阳性克隆酶切鉴定.鉴定正确的质粒分别命名为pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP.
融合基因的诱导表达及鉴定将pET32aScFv14/EGFP和
pET32aR9/ScFv14/EGFP质粒分别转化入E .，挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220 r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220 r/min, 37℃条件下振荡培养至A600 nm=～,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导培养3 h，取1 mL诱导菌液离心，收集菌体，进行SDSPAGE分析.另取5 mL 诱导菌液离心，收集菌体，以 mol/L的TrisHCl(pH=)重悬，超声裂解后，离心取上清，沉淀用 mol/L TrisHCl(pH=)重悬，取上清和沉淀进行SDSPAGE分析.
重组融合蛋白的Western blot分析将诱导菌进行SDSPAGE 分离蛋白质，用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC）上，经50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，用鼠抗EGFP mAb（1∶1000稀释），4℃孵育过夜，用TBST
洗膜6次，每次5 min,再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h, 用TBST洗膜6次，每次5 min,按显影液说明加入显影液，用化学发光法进行检测.
融合蛋白亲和活性的ELISA检测用5 mg/L HBsAg包被ELISA板,每孔100 μL, 4℃过夜. 加入不同稀释度的细菌裂解上清,每孔100 μL, 37℃孵育1
h. 设空白和阴性对照. 洗涤后,加入鼠抗EGFP mAb（1∶1000稀释）,37℃孵育
1 h. 洗涤后再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG, 37℃孵育1 h. 最
后各孔加入新鲜配制的ABTS显色液100 μL, 37℃孵育30 min,终止反应.以酶标仪测定各孔A410 nm值.
2结果
目的基因扩增和酶切鉴定PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实分别扩增出大小约为750 bp和780 bp的条带(图1A) .测序结果证实扩增的ScFv14和R9/ScFv14基因完全正确. 用EcoRⅠ和BamHⅠ
双酶切鉴定，得到大小约为750 bp和780 bp的条带，与预期长度相符（图1B）.
原核表达载体的酶切鉴定重组载体pET32aScFv14/EGFP和
pET32aR9/ScFv14/EGFP用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切ScFv14和
R9/ScFv14基因，分别得到大小约为750 bp和780 bp的条带；用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切融合蛋白基因，分别得到大小约为1490 bp和1520 bp的条带,与预期长度相符（图2）.
重组融合蛋白表达的鉴定和分析SDSPAGE分析显示，与未诱导菌相比，两种诱导菌在Mr约为73 ku处均有一特异性蛋白条带，同预期的大小相符.经凝胶成像系统扫描显示，它们的表达量分别约占菌体总蛋白的 20%和25%（图3）. 取IPTG诱导后的菌液进行超声裂解，分别取其裂解上清和沉淀进行SDSPAGE分析，电泳结果显示两种目的蛋白均主要存在于诱导菌的裂解上清中（图4）.
重组融合蛋白的Western blot分析在Mr约为73 ku处有一特异性蛋白条带(图5)，与SDSPAGE分析结果相符，说明该诱导蛋白为目的蛋白.
融合蛋白亲和活性的ELISA检测间接ELISA检测结果显示表达的两种ScFv14/EGFP融合蛋白均能与HBsAg抗原特异性结合 (图6), 二者相比，
R9/ScFv14/EGFP 与HBsAg的亲和力稍大于ScFv14/EGFP与HBsAg，但不具有统计学意义（P>）.
2，4: 未诱导的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白质； 3，
5： IPTG 诱导的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白质.
B1: marker； 2，4: 未诱导的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白质；3，5： IPTG 诱导的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白质.
3讨论
天然Fv片段中VH和VL为非共价性结合，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段.将VH和VL用一个小肽(linker)连接起来，即单链抗体. 单链抗体易与效应分子相连，与其他蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白.近年来，以单链抗体为导向物的免疫融合蛋白在抗肿瘤、抗病毒等的治疗
和诊断方面展现了广阔的前景，引起了人们的广泛关注.由单链抗体与毒素、酶、细胞因子等的基因相连的免疫融合蛋白，可以结合到特定的靶部位，高效的发挥生物学功能［6-7］ .
蛋白转膜结构域（PTDs）是一类能够介导与之融合的蛋白内化入细胞的短肽.它们作为内化的工具被广泛应用，它不仅可以使多肽、多聚核苷酸、极小微粒进入细胞，甚至可以在体内介导蛋白质的内化［8］ . Futaki等［9］发现多种富含精氨酸的肽都具有转膜作用.在比较了不同长度的多聚精氨酸对内化效率的影响之后，他们发现八聚精氨酸（Arg8）的内化效果最好 . Wender等［10］发现Arg9具有更高效的内化作用.我们采用转膜结构域Arg9来增强融合蛋白的转膜功能，以期使产物具有更高的内化效率.
我们构建了带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合基因表达载体，并将该表达载体在E .中进行诱导表达，SDSPAGE分析表明融合蛋白在大肠杆菌中成功表达，并且主要在大肠杆菌的上清中表达，这就避免了变性复性的复杂过程，直接就可以获得具有生物学功能的活性蛋白.间接ELISA检测也证实融合有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白与不带有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白对HBsAg 具有相近的亲和活性.这为进一步研究Arg9对免疫融合蛋白内化的促进作用以
及为乙型病毒性肝炎的靶向治疗研究提供了实验基础.
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《基因指导蛋白质的合成》教学设计
第一节《基因指导蛋白质的合成》教学设计 一、教材分析 （一）教材的地位与作用 所使用的教材是中图版必修二。讲述的内容是第三单元第二章第二节“基因的表达”。本节是从本质上阐述生命现象的理论，是分子遗传学的核心。本节教材是本册教材的重点之一，有承上启下的作用。 （二）教材前后联系 “基因的表达”这部分内容，（1）从物质上看，讨论的是生命特有的两种大分子物质——蛋白质和核酸在生命现象中的关系。学习过程需要生物学第一模块《分子与细胞》的知识作为基础，其中密切相关的内容有第二单元“细胞的自我保障”中关于蛋白质的结构和合成，核酸的结构和功能等。（2）从结构上看，基因表达的过程是在细胞基本结构的不同区域中完成的，因此，还需要第一模块第一单元“有机体中的细胞”中细胞的结构和功能等内容作为基础。（3）从功能上看，细胞代谢过程都是性状的体现，都是基因表达的结果，从这一点上说，本节内容有有助于对生命最基本特征的理解，这涉及第一模块第三单元“细胞的新陈代谢”中，关于酶在代谢中的作用及第四单元“细胞的生命周期”中有关细胞增殖、分化等内容。 另外，本节教材与生物学第三模块《稳态和环境》的学习也有密切的联系。因为生命许多特有的调节活动都是基因——酶——性状或基因——蛋白质——性状的具体体现。 就本册而言本节有利于从本质上理解染色体变异与生物性状的关系；同时也有利于对第二单元基因的分离规律和自由组合规律的本质作进一步理解。 二、学情分析： 学生在学习《基因的本质》后，已经对基因产生了浓厚的兴趣，想进一步探知有关基因的其他问题，学习的欲望强烈，但具以往的经验，学生往往会陷入学习时明白，学完了就糊涂的困惑中，同时还有课时紧，任务重的矛盾。 三、教学目标 1、概述遗传信息的转录和翻译过程。
优质课基因指导蛋白质的合成教学设计
第一节基因指导蛋白质的合成教学设计 单位：横县中学授课班级：1609 授课教师：黎文华上课地点：1609班教室 一、教学目标 1、知识目标 （1）概述遗传信息的转录和翻译。 （2）能运用数学方法，分析碱基与氨基酸的对应关系。 2、能力目标 培养和发展学生的观察识图能力，分析归纳和推理判断的能力。让学生能利用文字、图表、图解等形式，阐述转录和翻译的概念、原理和过程。 3、情感目标 培养学生用生物学观点认识和分析生物体生命活动的基本规律。 二、教学重难点 重点：转录和翻译的概念和过程。 难点：遗传信息的翻译过程。 三、课时安排 1 课时 四、教学过程
二、遗传信息的翻 译 DNA RNA 组成元素 基本单位 碱基 结构 分布 分子大小 另外，教师补充：RNA的在细胞中有三种： mRNA（信使RNA），tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体 RNA）。 探究二 DNA的遗传信息是怎么传给mRNA的？ 观看动画，阅读教材63页，回答以下问题： 1、概述转录的过程？ 2、转录的单位是什么？ 3、DNA的两条链都能转录吗？ 4、DNA链完全解开吗？ 5、在转录过程中碱基互补配对原则有什么特殊情况？ 转录：图示P63图4-4以DNA为模板转录RNA的图解。 利用动画：显示转录过程。 探究三、mRNA上的碱基序列如何指导蛋白质合成的呢？ 思考：mRNA的4种碱基如何决定20种氨基酸？ 提出：mRNA上每3个相邻的碱基决定1个氨基酸。 小结：64种密码：61个编码控制20种氨基酸合成，另 外3个（UAG、UAA、UGA）不编码任何氨基酸，而是合成 蛋白质的终止信号又称终止密码。 继续设疑：是谁把细胞质中游离的氨基酸运到蛋白质的 “装配机器”——核糖体上的？————引出tRNA 课件显示：tRNA的结构示意图，特别注意反密码子的种 类和读取的方向（61种，从携带氨基酸的那一端开始 读取） 学生阅读课文，思 考问题，并填写表。 学生带着问题阅读 课文，小组讨论。 通过阅读课文，进 一步提高学生自 学能力。 教师导学，进一步 掌握知识要点。 并利用教材中的 图解，引导学生通 过观察、思考、归 纳获得知识。
融合蛋白定义
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
基因控制蛋白质的合成计算总结
基因控制蛋白质的合成计算总结 一、与碱基互补配对有关的计算（主要是转录过程）这种题型做题步骤：先画图→再标碱基（若题目中告诉有哪两个碱基之和，就把这两个碱基标在一起；若没告诉哪两个碱基之和就可以随便标）→分析题目类型（推断过程要么由DNA推RNA或由 RNA→DNA；所求结果要么求碱基个数或求碱基所占的比例）→分析计算（主要把握住某个碱基或某两个碱基之和占DNA一条链的比例是占两条链比例的二倍） 1、计算数量⑴已知一段mRNA含30个碱基，其中A和G有12个，转录该段mRNA的DNA分子中应有C和T的个数是（）A12 B24 C18 D30⑵已知有1000个碱基的一段单链mRNA分子中，腺嘌呤和尿嘧啶之和所占比例为20%，则转录mRNA的DNA中非模板链的胞嘧啶的数量最多是（）A1200 B800 C400 D1600⑶已知一个蛋白质由2条肽链组成，连接蛋白质分子中的氨基酸的肽键共有198个，翻译模板mRNA中有A和G共有200个，则转录成该mRNA 的DNA分子中，最少有C和T多少个？（）A400 B200 C600 D8002、计算比例⑴在双链DNA中，已知其中一条链（A+G）/ （T+C）=0、4，那么以它的互补链为模板转录成的mRNA中 （A+G）/（C+U）应是（）A 2、5 B1 C 0、4 D
1、25(2)某mRNA的碱基中，U占19%，A占21%，则作为它的模板基因DNA分子中胞嘧啶占全部碱基总数的( ) A21% B19% C60% D30% 二、与6：3：1有关的计算6是基因中的碱基个数，3是mRNA中的碱基个数，1是氨基酸的个数；基因中的碱基个数：mRNA中的碱基个数：氨基酸的个数＝6：3： 11、在6上进行变化角度出题（给出基因中的碱基个数或对数；给出基因中脱氧核苷酸的个数或对数。）要把握住基因中的碱基个数和基因中的脱氧核苷酸的个数相等。DNA中嘌呤碱基的数目和嘧啶碱基的数目相等。例：一个基因由600个脱氧核苷酸对组成，问形成的多肽中至多含有多少个氨基酸？（）A200 B100 C400 D8002、在1氨基酸上进行变换角度出题⑴联系缩合反应中公式：①氨基酸的数目＝肽键数目（水分子数目）＋肽链条数； ②蛋白质的分子量＝氨基酸的个数氨基酸的平均分子量－水分子个数18；①已知一个蛋白质分子由两条链组成，在合成蛋白质过程中生成310-21克水，那么指导该蛋白质合成的基因中至少含有多少个脱氧核苷酸对？（）A612 B306 C204 D606②由n个碱基组成的基因，控制合成由1条多肽链组成的蛋白质。氨基酸的平均分子量为a，则该蛋白质的分子量最大为（）A na/6 B na/3－ 18(n/3－1) C an－18(n－1)
高中生物基因指导蛋白质的合成测试题(附答案)知识讲解
高中生物基因指导蛋白质的合成测试题(附 答案)
高中生物必修2 第4章第1节基因指导蛋白质的合成测试题（附答案） 一、单选题 1．某细胞内相关的生理活动如图所示，下列表述正确的是 A. 若该细胞为记忆B细胞，其细胞核、细胞质中均能发生a、b过程 B. 细胞发生c过程时，mRNA沿着核糖体移动，参与的tRNA可能有61种 C. 图中蛋白质的结构和功能是由DNA中碱基的排列顺序和环境条件共同决定的 D. 分化的细胞中mRNA和蛋白质一定不同 2．某种物质可使DNA双链不能解开，若在细胞正常生长的培养液中加入适量的该物质，该物质不会阻断的细胞生理过程是 ①DNA复制②转录③翻译 A. ① B. ①② C. ③ D. ②③ 3．若图中甲、乙、丙所代表的结构或物质的关系，则表中相应的叙述与图示不符的选项是选项甲乙丙相应的叙述 A DNA RNA蛋白质①过程可表示转录；②过程可表示翻译 B二倍体花粉单倍体通过③得到甲的常用方法是用秋水仙素处理丙的种子 C离体细胞愈伤组织植物体①过程表示脱分化，②过程包括再分化 D CO 2+H 2 0C 6 H 12 O 6 丙酮酸 ①过程表示光合作用；②③过程表 示有氧呼吸 A. A B. B C. C D. D 4．下列有关DNA复制和基因表达的叙述，不正确的是 A. DNA复制和转录过程中都有氢键的断裂和形成 B. 人体不同细胞中DNA复制方式不同 C. 翻译过程中mRNA都要与核糖体结合 D. 转录过程中遗传信息可由DNA流向RNA 5．埃博拉出血热（EBHF）是由埃博拉病毒（EBV）（一种丝状单链RNA病毒）引起的当今世界上最致命的病毒性出血热，目前该病毒已经造成超过5160人死亡。EBV与宿主细胞结合后，将核酸-蛋白复合体释放至细胞质，通过下图途径进行增殖。下列推断正确的是
生物化学-(原创)蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法 摘要过去15年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重 要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文综述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括酵母双杂交技术，GST pull-down技术，免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等多种研究方法，总结了各种研究方法的原理及应用。 关键词：蛋白质，相互作用，研究方法 1 酵母双杂交技术(two hybrid system) 1.1基本原理真核生物细胞转录激活因子一般都含有2个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-bindingdomain, BD)和DNA转录激活结构域(transcription activation domain, AD)。这两个结构域相互独立但功能上又相互依赖,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的活性。将拟研究的编码“猎物”蛋白的基因与AD序列结合,编码“诱饵”蛋白的基因与BD序列结合,形成两段融合基因,并在同一菌株核内表达,若“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白在核内存在相互作用,就可以重新形成完整的有活性的转录因子,从而激活报告基因的转录。因此根据报告基因的表达与否,即可判断“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间是否具有相互作用。 1.2应用 Hurst等利用酵母双杂交的方法研究与乳腺癌转移抑制因子1（BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白为Hsp90伴侣蛋白。Reddi等利用酵母双杂交系统研究肝炎B病毒反式作用因子HBx蛋白的自我偶联作用，结果发现HBx蛋白在分子环境中可以通过其碳末端区域产生自我偶联作用。酵母双杂交技术也应用于大规模蛋白质相互作用网络的研究，Lim 等人利用此技术鉴定了770多个可能相互作用的蛋白，有75对蛋白质产生相互作用，其中有83%相互作用的蛋白质在哺乳动物细胞中得到验证。 1.3优点在检测蛋白质之间相互作用方面， 酵母双杂交系统具有非常高的灵敏度，尤其对蛋 白质间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因 的表达产物敏感地检测到。酵母双杂交技术研究 蛋白质相互作用是基于酵母细胞内的试验，不需 要经过提纯蛋白来研究蛋白的相互作用，避免了 提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物 活性的蛋白-蛋白相互作用，反映体内的真实的相 互作用情况。 1.4缺点（1）对相互作用蛋白在细胞内的定位 要求严格，酵母双杂交不能检测定位于胞浆内、 细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白而且融 合表达可能会影响目的蛋白修饰和折叠，尤其在 研究异源蛋白相互作用时，蛋白不一定能正确修 饰和折叠，从而影响蛋白的活性。 （2）由于某些蛋白质本身具有转录激活功，使"猎物"蛋白AD融合基因与“诱饵”
高中生物《基因指导蛋白质的合成》教学设计
基因指导蛋白质的合成教学设计 本节课高考要求为Ⅱ级，要求学生知其然也要知其所以然。本节内容为高考高频考点之一，近几年各省市高考命题多有涉及，多以选择题的形式进行命题考查。高考命题立意在能力，培养能力的前提是学生需要具备扎实的基础知识和基本技能。在进行授课时，采用在市编《自主学习指导课程》基础上，添加补充学案的方式。在今后的课堂教学中也要贯彻这种做法。 一、课前预习 1.课前安排学生认真阅读教材基础知识，完成《自主学习指导课程》第104页的“知识盘点梳理”填充。在这个阶段学生通过阅读《自主学习指导课程》104页上的“考纲预览导学”明确复习目标，通过阅读“学习支点阐释”初步明确复习方法。 2.抽查部分学生的市学案，检查学生对基础知识的掌握情况，也起到督促的作用。根据检查中发现的问题，及时调整课堂预设，使课堂教学更具有针对性。 二、课堂探究 课堂是教学的主阵地。本节课的课堂教学过程主要有： 1.出示“知识盘点梳理”的答案，让学生自主纠错。本环节要求学生：（1）快速认真核对“知识盘点梳理”部分的答案；（2）同桌互助解决出错点，有疑问请提出；（3）纠错完毕，熟记基础知识。 针对学生的疑问进行有针对性的解答释疑。本部分特别强调三处：转录需要的酶是什么、翻译的场所在哪里、tRNA的结构及重要部位。 2.预习效果检测。通过7个判断题，起到检查预习效果的作用，从中发现学生的知识盲点和误区，以便在课堂教学过程中对其进行强化。 3.明确复习目标、体验高考真题、明确复习方法。 （1）结合“考纲预览导学”，对复习目标进行解读和强调。 （2）让学生做“高考零距体验”中的7个判断题，让学生感悟高考命题视角，增强学习的针对性。 （3）结合“学习支点阐释”，让学生明确复习方法。 4.考点透析归纳。结合考纲，确立本节的三个重要考点分别为：①RNA的种
基因控制蛋白质的合成教学设计
教学设计
设计意图 （第2课时） 中心法则（补充有关中心法则的内容，充分利用中心法则图解，引导学生看图说出遗传信息流的方向，对RNA复制和逆转录过程进行补充讲解，再辅以习题训练。） 基因对性状的控制（通过例题的分析，引导学生认识到基因的选择性表达，与必修一细胞分化的实质相联系，注意新旧知识的衔接。） [复习提问]：转录和翻译的相关内容 （略）。 [讲述]：在遗传学上，把遗传信息的流 动方向叫做信息流。信息流的方向可以用科 家克里克提出的“中心法则”来表示。 [出示]：中心法则图解。 [提问]：你能根据中心法则的图解，说 出其中的遗传信息流动方向吗？ [介绍]：在某些病毒中，RNA也可以自 我复制。科学家还发现在一些病毒蛋白质的 合成过程中，RNA可以在逆转录酶的作用下 合成DNA。逆转录过程及以及RNA自我复制 过程的发现，补充和发展了“中心法则“， 使之更加完整。 [小结]：DNA的复制：DNA→DNA（以DNA 作为遗传物质的生物的DNA自我复制。） DNA的转录：DNA→RNA（细胞核中的转 录过程。） 翻译：RNA→蛋白质（细胞质的核糖体 上的翻译过程。） RNA的复制：RNA→RNA（以RNA作为遗 传物质的生物的RNA自我复制。） RNA逆转录：RNA→DNA（少数病毒在其 宿主细胞中的逆转录过程。） [例题]：见学案。 [引言]：生物的一切遗传性状都是受基 因控制的。个体发育过程中产生的众多体细 胞均来自同一受精卵的有丝分裂，因而含有 相同的遗传物质或基因，但生物体不同部分 细胞表现出的性状不同，这是为什么？ [例题]：人的胰岛细胞能产生胰岛素， 但不能产生血红蛋白，据此推测胰岛细胞中 ( C ) A.只有胰岛素基因 B.比人受精卵的基因要少 C.既有胰岛素基因，也有血红蛋白基 对照中心法 则说出DNA的复 制，DNA的转录、 翻译。 通过习题演 练加深对中心法 则的理解。 积极思维，与 必修一中的细胞 分化实质相联系， 进一步理解基因 的选择性表达。
单链抗体及重组白介素-双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测.
单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测 2010-10-22 目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的`抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv- IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv- IL-2)SN 在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting 对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist和蛋白质分析软件ANTHEPROT V5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体 pL(scFv- IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROT V5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据. 作者：史梦远王海涛张芳琳 SHI Meng-yu WANG Hai-tao ZHANG Fang- li 作者单位：第四军医大学基础部微生物教研室,陕西,西安,710032 刊名：新乡医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 25(2) 分类号：Q782 关键词：单链抗 体生物信息学资源融合蛋白
抗体标签
标签抗体 简介 标签抗体，别名为抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团，是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展，科研人员可以通过DNA重组技术，构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白，进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化，以达到研究的需求。 主要类别 Flag抗体-抗Flag标签抗体 融合标签，如Flag、GST等标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。常用的标签包括myc、HA、Flag、His、GST等。其中Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的Flag标签抗体也被广泛应用。由于Flag标签系统的纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。Flag标签可以通过加入肠激酶处理去除，肠激酶专一识别该肽序列C末端的5个氨基酸残基。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。 His抗体-抗His标签抗体 融合标签根据其相对分子质量大小可以分为两大类：大的蛋白质分子和小的多肽片段。融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。His 标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化。由于分子量较小，并且较容易分离和纯化，His融合标签与其他标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。利用His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等。 GST抗体-抗GST标签抗体 随着越来越多的新基因的发现，基因融合蛋白表达体系以其在新发现蛋白研究中的显著优势已得到广泛应用。其中GST标签体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解，从而除去GST 蛋白。融合蛋白又是一个非常好的强免疫原，因此，很容易制备抗新蛋白的抗体。正是由于以上的优点，商品化的GST融合蛋白表达体系以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。近年来在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶GST表达纯化系统的应用更为普遍。用GST 融合表达系统表达外源基因时，对融合表达产物的检测和纯化非常重要，这里面就包括了GST标签抗体的应用。 GFP抗体-抗GFP标签抗体 常用的标签包括GFP、HA、Flag、His、GST等。其中绿色萤光蛋白（Green Fluorescent Protein），简称GFP，这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria 的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。GFP或其突变体EGFP等被广泛用于基因表达效率的检测，以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分布。一般来说，GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当的突变体，也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(强克)说明书(完整版)
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白使用说明书 【药品名称】 通用名：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 商品名：强克 英文名：Recombinant Human TNF Receptor-Ig Fusion Protein for Injection 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren Erxing Zhongliuhuaisiyinzi Shouti －Kangti Ronghedanbai 【性状】 本品为无菌白色冻干粉针剂。 【主要成分】 每瓶含重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25毫克，甘露醇40毫克，蔗糖10毫克，三羟甲基氨基甲烷1.2毫克。用1毫升灭菌注射用水溶解。【药理毒理】 1.药理重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是一个二聚体的融合蛋白，包含人75KDa肿瘤坏死因子受体（TNFR）（p75）的细胞膜外配体结合部分与人IgG1的Fc片段，包含934个氨基酸，表观分子量约为150K道尔顿（KDa）。 TNF是机体自然产生的一种细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应。在强直性脊柱炎关节病变的炎症反应中，TNF起着重要的作用。TNF存在55KDa蛋白（p55）和75KDa蛋白（p75）两类受体，它们均以单体的形式存在于细胞表面。TNF的生物学活性取决于它与细胞表面两类受体分子的结合。 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的作用机制是竞争性地与TNF 结合，阻止TNF与细胞表面TNF受体的结合，抑制TNF的生物学活性。 2.毒理小鼠急性毒性试验结果显示，静脉注射1.09g/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见毒性反应。猴长期毒性试验结果显示，每周2次连续皮下注射180天15.0 mg/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见有明显的毒性。 【药代动力学】
基因指导蛋白质的合成(学案)
第1节基因指导蛋白质的合成 [学习目标] 1、知识目标： （1）说出基因控制蛋白质合成的中间物质──RNA的基本单位、化学组成和种类，以及它与DNA在组成、结构、功能和分布等方面的异同；（2）概述遗传信息的转录过程。 2、能力目标：尝试列表比较转录和复制的过程。 3、情感目标：养成提出问题、分析问题、解决问题的能力。 [学习重点和难点] 1、学习重点（1）遗传信息转录的过程。（2）转录和复制的异同点。 2、学习难点遗传信息转录的过程。 [学习过程] 一、为什么RNA适于做DNA的信使 1．RNA与DNA的比较 2．种类 (1) ：遗传信息传递的媒介。 (2) ：转运氨基酸的工具。 (3) ：与蛋白质合成核糖体。 二、基因控制蛋白质的合成 1．转录 (1)概念：在中，以DNA的为模板，按照原则，合成mRNA的过程。 (2)场所: (3)条件：模板（）、原料（）、能量、酶（如）。 (4)产物: (5)RNA出细胞核的途径：通过，RNA从细胞核内进入细胞质。 [思考与讨论] 1、写出以b链为模板转录形成的mRNA碱基序列，写出b链对应的a链的碱基序列。
2. DNA的两条链都转录吗？ 3、DNA链完全解开吗？ 4、在转录过程中碱基互补配对原则有什么特殊情况？ 5、转录发生在什么时候？ [随堂练习] 1、对比RNA和DNA化学成分，RNA特有的是（） A. 核糖和尿嘧啶 B. 脱氧核糖和尿嘧啶 C. 核糖和胸腺嘧啶 D. 脱氧核糖和胸腺嘧啶 2、DNA分子的解旋发生在哪一过程中（） A. 复制 B. 转录 C. 翻译 D. 复制和转录 3、以下哪项对RNA来说是正确的（） A. C＋G＝A＋U B. C＋G＞A＋U C. G＋A＝C＋U D. 前三项都不对 4、某信使RNA上，A的含量是24%，U的含量是26%，C的含量是27%，则控制其合成的模板链中G的含量为（） A. 23% B. 25% C. 27% D. 24% 5、RNA在彻底水解后得到的产物是（） A、氨基酸、葡萄糖、碱基 B、氨基酸、核苷酸、葡萄糖 C、核糖、碱基、磷酸 D、脱氧核糖、碱基、磷酸
知识梳理(第三节 基因控制蛋白质的合成)
第三节基因控制蛋白质的合成 知识梳理 一、从基因到蛋白质 1.基因是具有遗传效应的DNA片段；遗传信息是指碱基排列顺序。基因遗传信息的表达是通过基因控制蛋白质的合成来实现的。 2.转录场所：细胞核。模板：DNA的一条链。原料：4种核糖核苷酸。产物：mRNA。遵循碱基互补配对原则。注意转录时U代替T与A配对。特点：边解旋边转录。 3.遗传密码 遗传学上把决定1种氨基酸的3个相连的碱基叫做一个“密码子”。通过密码子表了解：所有生物共用一套密码子；每种氨基酸可对应1种或多种密码子，而每种密码子只决定1种氨基酸；共有64种密码子，决定氨基酸的为61种。基因突变，生物性状一定改变吗？不一定。 4.翻译 场所：蛋白质。模板：mRNA。原料氨基酸。产物：多肽。翻译过程分为起始、延伸、终止等阶段，信使RNA合成后，从核孔进入细胞质与核糖体结合；氨基酸到达核糖体通过tRNA运输。tRNA组成：一端携带氨基酸，另一端有3个碱基。tRNA与氨基酸的关系：一种tRNA只能转运一种氨基酸、一种氨基酸可以被多种tRNA转运。 二、基因对性状的控制 基因作为遗传物质，其主要功能是把遗传信息转变为有特定氨基酸，按一定顺序构成的多肽和蛋白质，从而决定生物的性状。 三、人类基因组计划 （1）主要内容：完成人体24条染色体上的全部基因的遗传作图、物理作图和全部碱基序列测定。 （2）后续研究与开发：主要是开展与重大疾病、重要生理功能相关的基因和蛋白质，以及重要病原菌功能基因组的研究与开发。 知识导学 1.对遗传信息的遗传和表达我们可以参照图形理解： 五条线路均遵循碱基互补配对原则： ①DNA→DNA：以DNA作为遗传物质的生物的自我复制。 ②RNA→RNA：以RNA作为遗传物质的生物的自我复制。 ③DNA→RNA：遗传信息从DNA流向RNA的转录过程。 ④RNA→蛋白质：细胞质核糖体上的翻译过程。 ⑤RNA→DNA：在逆转录酶作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 注意：科学家发现了疯牛病的病原体——朊病毒，其化学成分是蛋白质。朊病毒是有感染性的错误折叠的结构异常蛋白质，能促使与其有相同氨基酸序列的蛋白质发生同样错误折叠，朊病毒的发现对现代遗传理论有一定的补充作用。 2.基因对性状的控制有两种情况：一是通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物性状。另一情况是通过控制蛋白质的分子结构来直接影响性状。 疑难突破 1.如何理解转录的过程？ 剖析：转录是在细胞核内进行的，是以DNA的一条链为模板，合成mRNA的过程。
注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白
注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白Ⅰ期临床试验 邵威 【摘要】：注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白是一种由人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)胞外区和人免疫球蛋白G1(IgG1)修饰的Fc片段(铰链区、CH2和CH3区)相连接的融合蛋白。它是一种选择性共刺激调节剂,它与抗原提呈细胞上的B7分子的亲和力大大高于T细胞表面的CD28,可以封闭抗原提呈细胞上的B7,阻断CD28与之结合,从而阻断共刺激通路,抑制T细胞(T淋巴细胞)激活。T淋巴细胞的激活与类风湿关节炎(RA)的病理进程相关。在RA患者的关节腔滑液中可以找到激活的T淋巴细胞。根据我国药品食品监督管理局(SFDA)通过的《药品注册管理办法》,注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白属于生物制品7类,即已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品。目的: 建立酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定人血浆中重组人CTLA4-Ig浓度的方法,进行单次给药后重组人CTLA4-Ig在健康人体内的耐受性和药代动力学研究,为指导临床制定安全、合理的用药方案提供理论依据,为新药审批和临床用药提供试验依据,并为Ⅱ期临床研究提供参考依据。方法:本研究分以下三部分: 第一部分建立灵敏度高、专一性强、准确性好、重复性强的EL ISA法测定人血浆中rhCTLA4-Ig的分析方法学。测定步骤:将鼠抗人CTLA4单抗用包被缓冲液按比例稀释,包被96孔酶标板,4℃孵育18小时;加包被缓冲液室温封闭2小时;用洗涤液洗板;加入不同稀释浓度的标准品和稀释好的待测样品;加样后立即加入稀释好的生物素标记的二抗。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育2小时。加入按比例稀释好的HRP标记的链酶亲和素。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育0.5小时。避光条件下加入HRP显色液,室温反应15分钟。加终止液,终止反应后0.5小时内酶标仪读取450 nm的吸光度(A)值,记录结果。每份样品重复测定,各药盒都设置标准校正曲线,用以计算未知样品浓度。第二部分考察单次静脉滴注rhCTLA4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的耐受性。随机选取27名健康志愿者,年龄、体重、身高均符合试验要求,常规体检、心电图检查,实验室检查包括血、尿常规,肝、肾功能等各项生化检查均无异常,无其它系统性疾病及药物过敏史。3个月内未参加过临床试验,试验前两周内及试验期间未服用其他任何药物。试验中随时观察受试者症状、体征以及各种不良反应,并定期进行实验室检查(血尿常规、肝肾功能、血液生化及血沉等)。综合评价rhCTLA4-Ig在健康人体内的耐受性,整个试验期间配备有经验的医师和护士监护。所有计量资料均采用Excel或SPSS软件进行计算,以?X±SD表示,并进行t检验或方差分析。第三部分研究单次静脉滴注rhCTLA 4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的药代动力学特征。27名健康受试者随机平行分为低、中、高3个单次给药剂量组。按实验设计要求,27名受试者于试验当日晨按分组分别静脉滴注重组人CTLA4-抗体融合蛋白1 mg·kg-1、10 mg·kg -1、20 mg·kg-1,输液在(60±5)分钟内完成,而后按设计的采血时间点采血。分别于静脉滴注前、滴注开始第30分钟,滴注结束后0、2、4、12、24小时、2、3、4、7、14、28、42、56、70和84天各取血2 ml,置于15 % EDTA抗凝的试管内, 3600 r·min-1离心分离血清至另一无菌试管中,-80℃保存,待测。本试验采用ELISA法测定血浆中rhCTLA4-Ig的浓度。采用DAS2.1软件计算主要药代动力学参数,Tmax、Cmax采用实测值,AUC用公式计算。所有的数据均用几何均数±标准差(?X±SD)表示,采用单因素ANOVA和Student’s t test进行统计学分析。结果: 1. 27名健康受试者,均完成试验。单次给药耐受性试验观察至84 d。试验期间,全部试验的27名受试者应用不同剂量药物后均未有明显的不良反应发生;呼吸、心率、血压、脉搏、体温等生命体征未见异常;心电图正常。注射药物局部未发现皮肤红肿、瘀斑或皮疹等刺激性反应,试验观察期间未出现不适反应和异常体征。2.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后观察至84 d。试验过程中共进行七次血液生化指标检查。27名健康受试者用药前后血沉检查未发现异常改变,经t检验,各指标试验前后比较均无显著差异。试验前后进行尿常规指标检测,所有健康受试者尿常规指标无异常改变。3.本试验采用ELISA法测定健康志愿者血浆中rhCTLA4-Ig浓度,最低检测限为0.4 ng·mL-1,线性范围为1.95～500 ng·mL-1。本药在此线性范围内重现性好,CV %均小于10 %,准确度在-5.3～-1.1 %之间;不同药盒的批间精密度CV %也均小于10 %,准确度在0.6～6.2 %之间。4.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后的药代动力学参数:T1/2ke分别为(15.13±2.62),(14.21±2.35) 和(11.77±1.24)d;MRT分别为(19.913±2.086)、(19.630±1.832)和(18.795±0.832)d;AUC(0-84d)分别为(170.64±27.75)、(1490. 26±231.23)和(2977.25±362.31)μg·d·mL-1;Tmax均为0.0416 d;Cmax分别为(18.39±1.57)(,186.91±24.70)和(416.84±34.40)μg·mL-1。结论: 1. ELISA的分析方法具有灵敏度较高,准确性好,专一性较强,操作简便快捷、可重复性强的特点。高、中、低三种浓度样品-80℃冻存一个月后,CTLA4-Ig稳定性良好,与未经冻存的样本相比,统计学无显著性差异。适用于人体血浆中rhCTLA4-Ig的定量分析。2.试验表明健康受试者单次静脉滴注国产rhCTLA4-Ig在1～20 mg·kg-1剂量范围内是安
Arg9-人抗HBsAg单链抗体-EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析
Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性 分析 作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢 【关键词】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9 【Abstract】 AIM: To construct R9/ScFv14/EGFP fusion genes and to analyze the binding activity of the fusion proteins after they were expressed in BL21. METHODS: A series of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the genes of ScFv14 and R9/ScFv14. The PCR products were cloned into pMD18T vector, followed by DNA sequencing. R9/ScFv14 gene and ScFv14 gene were ligated with EGFP gene respectively before they were rebined into the expression vector pET32a. After induced in BL21 by IPTG, the expressed fusion proteins named R9/ScFv14/EGFP and ScFv14/EGFP were detected by SDSPAGE and the binding activity of them were analyzed by indirect ELISA. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the two fusion genes were correctly constructed. SDSPAGE analysis showed that they were successfully expressed in BL21 and the percentages of them were 20% and 25% of total bacteria proteins respectively. Indirect ELISA confirmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSION: The two fusion genes were constructed successfully. And the products of them expressed in BL21 maintained the binding activity to HBsAg. 【Keywords】 hepatitis B; hepatitis B surface antigens; ScFv; Arg9 【摘要】目的：构建带有转膜结构域Arg9编码序列的 R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活性. 方法：设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和 R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性. 结果：经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和
1 基因指导蛋白质的合成 教学设计 教案
教学准备 1. 教学目标 1.1 知识与技能： ①概述遗传信息的转录和翻译。 ②运用数学方法，分析碱基与氨基酸的对应关系。 1.2过程与方法： ①作好本章的引子。 ②准确把握主干知识与侧枝内容的教学要求 充分利用教材中的插图 1.3 情感态度与价值观： ①认同基因指导蛋白质合成的方法 2. 教学重点/难点 2.1 教学重点 ①遗传信息转录和翻译的过程 2.2 教学难点 ①遗传信息的翻译过程。 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 引入新课 片段1：导入
师：当我们认识到基因的本质后，能不能利用这一认识，分析现实生活中一些具体的问题呢？例如，在现实生活中，我们能不像电影《侏罗纪公园》中描述的那样，利用恐龙的DNA，使恐龙复活呢？ 生：讨论、争论，看图，形成新的问题 （提出探究的问题，引起悬念，明确探究的目标） 师：如果能利用恐龙的DNA使恐龙复活，你认为主要要解决什么问题？ 生：需要使恐龙DNA上的基因表达出来，表现恐龙的特性。 师：看来要解决这个问题，我们还需要研究“基因的表达”。引导学生看本章的章图。询问学生看懂了什么，又产生了哪些问题。 师：基因是如何指导蛋白质合成的？导入新课。 片段2学习转录过程 师：DNA在细胞核中，而蛋白质合成是在细胞质中进行的，两者如何联系起来？ 推测有一种物质能够作为传达DNA信息的信使，科学家发现此物质就是RNA。 师：如何解读DNA信息？ 生：看图分析比较核糖和脱氧核糖的区别，通过图形和CAI课件的演示，认识遗传信息的转录过程，并且完成对比表格。 RNA与DNA的比较
师：DNA是如何转录的，特点是什么？转录的单位是什么？转录与复制有何异同？ （通过问题的步步深入，学生推理分析，形成结论） 生：学生阅读教材找到答案。 （结合图解、讲CAI课件，认识转录的过程） 教师讲述：DNA相当于总司令。在战争中，如果总司令总是深入前沿阵地直接指挥， 就会影响他指挥全局。DNA被核膜限制在细胞核内，必须先把遗传信息传给mRNA，这一过程称为转录。 教师提问：为什么mRNA适于作DNA的信使呢？DNA的遗传信息是怎样传给mRNA 的？ 结合多媒体课件或图示教师精讲点拨： ①DNA双螺旋解开，DNA双链的碱基得以暴露，其中一条链提供准确模板； ②游离的核苷酸随机地与DNA链的碱基碰撞，当核苷酸的碱基与DNA的碱基互补时，两者以氢键结合。 ③新结合的核苷酸连接到正在合成的mRNA分子上； ④合成的mRNA从DNA链上释放，而后，DNA双链恢复。 学生听讲、阅读、思考，师生讨论共同完成以上问题，即①mRNA为单链，而且比DNA短，因此能够通过核孔，从细胞核转移到细胞质中；②转录成的RNA的碱基序列， 与供转录用的DNA单链的碱基序列之间的碱基是互补配对关系，与DNA双链间碱基互补 配对不同的是，RNA链中与DNA链的A配对的是U，不是T。这样转录出的这个mRNA 与DNA另一条链的碱基序列基本相同，只是DNA链上T的位置，RNA链上是U，从而 保证了转录的准确性。 教师讲述：转录与复制都需要模板、都遵循碱基互补配对规律，等等。可以从所需条件、过程中的具体步骤和过程中所表现出的规律等角度进行对比分析。 师：转录得到的RNA仍是碱基序列，而不是蛋白质。那么，RNA上的碱基序列如何 能变成蛋白质中氨基酸的种类、数量和排列顺序呢？RNA如何将信息翻译成蛋白质？