外周血淋巴细胞RNA提取(总结)

一．外周血淋巴细胞RNA提取

1.外周血淋巴细胞分离提取：

10ml 人外周血血样（EDTA-2K抗凝管采集）

稀释血样：D’Hanks 以1:1稀释

加入淋巴细胞分离液（稀释血样：淋巴细胞分离液=2:1）

室温，2000rpm/min 离心20min

吸取单个核细胞层

D’Hanks洗涤细胞

1500 rpm/min 离心10min

D’Hanks洗涤细胞

1000 rpm/min 离心10min

收集淋巴细胞沉淀（细胞计数：约1×107个细胞）

2.外周血淋巴细胞RNA提取：

1×107个淋巴细胞中加入1ml TriZol，4℃静置5min，裂解

加入200ul氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色，无分相现象

置于冰上5min；4℃，12000rpm/min，离心15 min

将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育10min 4℃，12000rpm/min，离心10 min

弃上清，在沉淀（含RNA）中加1ml 75%乙醇洗涤

4℃，12000 rpm/min，离心5 min，得到RNA沉淀；

空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用

RNA浓度：1400μg/μl，OD260/OD280=2.00

淋巴细胞分离液：

上海华精生物高科技有限公司

标准号：Q/GHSB 85-2001 批号：040524

二．1st-Strand cDNA合成反应：

2. 65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

4. 缓慢混匀。

5. 按下列条件进行反转录反应：42℃ 30-60min，95℃ 5min，冰上冷却。

以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签，

上游primer：5’-GGAATTC CATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3’ (Nde I酶切位点以及保护碱基)

下游primer：5’-CCG CTCGAG TTA AAATTTTAATAGCTAGTCTTCG-3’(Xho I酶切位点以及终止密码子、保护碱基)

提取外周血淋巴细胞

https://www.360docs.net/doc/a010711180.html,/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。我的经验 1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！） 3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 4. 离心 .转速：1500/分温度20c －28c 时间：20分钟 no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) 5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞 6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！ 7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。 8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！) 时间：10分钟温度：4c 9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你） 10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？ 11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形. a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数） b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞 c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形 d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度 e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？） 12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱. 看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！ 1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是 2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的 3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团建议; 不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.

西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

淋巴细胞分离与计数

淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟） 6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ──────────×10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。

人外周血淋巴细胞微核测定

人外周血淋巴细胞微核测定一、实验原理: 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G0期，在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。二、验用品（1）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水浴箱。（2）试剂：Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、RPMI1640培养液、PHA溶液、0.075mol／L KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液（3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。三、实验步骤 1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分别加入受试物（CP终浓度100ug/ml）培养72小时，收获前不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。 2、低渗：加入0.075mol／L KCl溶液4m1。混匀后放入37℃恒温水浴箱中低渗处理10分钟。低渗时间可根据预实验中细胞完整程度进行调整。 3、预固定：低渗结束后加入甲醇·冰乙酸（3:1）固定液lml，混匀后离心（1000rpm）5分钟。 4、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心（1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。 5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分钟。自来水细水冲洗后，晾干。 7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋巴细胞与未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁多，胞浆丰富，常见空泡

人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理

实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料人的外周血淋巴细胞

实验七+人体外周血淋巴细胞培养

实验五人的外周血淋巴细胞培养一、实验原理外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。二、实验目的掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。三、实验材料人的外周血。四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理

人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead 等所建立的。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。

外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会

RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。 M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。参考文献 [1] 丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9. (收稿日期:2010-12-16) v 通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin https://www.360docs.net/doc/a010711180.html, 。 #经验交流# 外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会马强,刘青松,蔡燕,邢艳,张国元 v (川北医学院附属医院检验科,四川南充637000) 摘要:目的总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。方法采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。结果该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。结论该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。1 淋巴细胞培养 1.1 外周血采集一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。 1.2 接种培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。 1.3 细胞培养细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。1.3.1 培养时间经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于分析。 1.3.2 培养温度与气体淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。2 细胞收获 2.1 秋水仙素与作用时间秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。 2.2 离心力将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。整个过程中,离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。这一步本室选择1900r /min 离心10min 。而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。 2.3 低渗低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。低渗液渗透压过

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案

实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。表1 人染色体组型及其特征

外周血淋巴细胞微核率测定

微核细胞率micronucleus frequency，在CB法微核试验中指1000个双核细胞中含有微核的细胞数。外周血淋巴细胞微核率测定外周血淋巴细胞微核率测定作为对职业性放射性工作者所受辐射损伤的评价是一项非常有意义的指标，亦列为我国慢性放射病诊断的重要检测指标之一。健康成人外周血淋巴细胞微核细胞率正常值范围为0-6‰,均值为1.2‰, 微核微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。微核是细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞浆中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核，位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。

人的外周血淋巴细胞培养

人的外周血淋巴细胞培养摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪

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第四大组实验方案外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的 1.了解动物细胞培养的方法。 2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 3.学会对人类染色体的组型分析。二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个： 1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。 2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~ 3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体 3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在 37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22

人的外周血淋巴细胞培养

人的外周血淋巴细胞培养摘要：各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体，每一个体细胞含有两组同样的染色体。染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。通过本实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人外周血淋巴细胞进行核型分析。人外周血中的淋巴细胞几乎都在G1期或G0期是不分裂的。当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。该方法已为临床医学、病毒学、药理遗传毒理学等方面的广泛应用。关键词：染色体有丝分裂人的外周血淋巴细胞核型分析要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显从而利于辨认。每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有一组染色体叫做单倍体，用n表示，两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒，亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体

人的外周血淋巴细胞培养

内容摘要：各种生物的染色体数目是恒定的，大多数高等动物是二倍体，即每一个细胞含有两组同样的染色体，染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构，是遗传物质的载体,携带着丰富的遗传信息。[1]在人类，只有精子和卵子是单倍体，其他细胞都是双倍体。如果一个人类胚胎部分染色体为多倍体，多数不能正常发育，但如果是性染色体是多倍体（XXX或XYY）、三套第21对染色体（唐氏综合症）、三套第18对染色体（爱德华氏症）、三套第13对染色体（巴陶氏症），则有机会长大成人。[2]实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都在 G1期（或G0期），一般情况下是不再分裂的，当在培养液中加入植物凝血素（PHA）时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。通过实验发现，人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和1对性染色体。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。关键词：外周血培养、低渗技术、组型分析引言：正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的形态特征，根据这些特征，可以对染色体进行组型分析。本次实验在操作过程中，主要采用了外周培养技术和低渗技术。外周血培养是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。通过许多学者的改进和革新，培养基由天然的动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长的物质从胎汁改为动物血清，本实验中用的小牛血清。体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。[3] 低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。[4] 1.实验材料与用品： 1.1材料：

人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备的几点体会

表4关联系数表 N1(k)1013657014099017400013978013993013333017198 N2(k)1016674017472016985017439016446015066014891 N3(k)1019643016928018139017930017347015890018469 计算关联度: C1=1 8 (1+013657+014099+017400+013978+013993+ 017198)=015457 C2=016872,C3=018043。根据关联度排序,各因素对合格率的关联程度依次为:体检率X3>发证率X2>食具合格率X1。 3讨论灰色关联分析是探讨灰色系统内部各因素之间发展变化的关联程度的一种新方法。通过对随机时间序列进行处理,明确各因素对系统的关联程度,从不完全的信息中找出影响系统的主要因素[1],为有关工作提供科学依据。近年来,国内一些学者采用此方法对妇幼保健内新法接生比[3]和医院门诊量[4]影响因素进行了分析,得到了这些内部各因素之间的关联程度,找出了影响系统的主要因素,明确了其工作的重点。关联度表示比较数列与参考数列之间的关联程度,关联度愈接近1,说明关联程度就越大。本文采用灰色关联分析法对某市1987~1994年食品卫生合格率的影响因素进行了分析,结果关了分别为:食具合格率C1=015457,发证率C2= 016872,体检率C3=018043。表明体检率与食品合格率的关联程度最高,所起作用就越大,发证率次之,食具合格率为第三。灰色关联分析具有所需样本小,原理简单,容易理解,计算简便,不受概论分布的限制,结果直观,适用范围广泛,易被基层防疫人员所掌握等优点,是食品卫生监测研究中的有用工具。参考文献 1.邓聚龙1灰色预测与决策1武汉:华中理工大学出版社119861104 ~110 2.林祥1运用模糊综合评判法评价梧州市近年食品卫生状况1中国卫生统计,1998,15(1):43 3.王增珍,李群荣1关联度分析及其与相关分析的比较1中国卫生统计,1991,8(6):22 4.马立军1关联度分析在医学研究中的应用1中国卫生统计,1992, 9(1):47 (收稿日期2003-11-20) 人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备的几点体会关晶田现书耿进妹 (济宁医学院生物学教研室) 为了研究人的染色体组成,所选用的组织细胞必须处于增殖状态,我们才能获得适于观察和分析的染色体标本。在人类,除少数组织(骨髓和睾丸组织)始终处于不断分裂之中外(但取材较困难,且不易为人们所接受),其余各种组织都需经过体外培养才能使细胞大量增殖。其中的外周血体外培养法运用最广泛,细胞遗传学领域中90%以上的研究取材于它。[1] 由于各个实验室实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同。作者在本实验室现有的条件下,经过长期摸索,总结出了一套适合本实验室的实验方法,现将具体方法和几点肤浅的体会介绍如下: 1材料与方法采血:常规消毒皮肤,用预先经012ml(200单位/ml)肝素湿润过的注射器抽取静脉血1~115ml,立即混匀。接种和培养:在无菌条件下,将抗凝血013ml(7号针头26滴)接种于装有5ml含小牛血清、PHA及双抗(青、链霉素)的RP M I1640培养液的培养瓶中,摇匀,置于37e培养箱中恒温培养68~70h。秋水仙素处理:在培养至68h加入秋水仙素,使终浓度为012~015L g/ml,轻摇后继续培养115h,以积累较多的中期分裂细胞。收获细胞:将培养物移至离心管中,以1000r/min离心10min,弃去上清液,沉淀物约留015~1ml。低渗:加入6ml已预温37e的01075M KCI低渗液至离心管中,用吸管轻轻吹打均匀制成细胞悬液,置37e温箱内,以使红细胞破坏,淋巴细胞膨胀,染色体分散。预固定:加入1ml固定液(甲醇:冰醋酸为3:1)混匀预固定5min。以1000r/min离心10min,弃去上清液。固定:加入固定液5ml,立即用吸管吹打细胞团块使之混匀,室温下固定20min,离心,去上清液。依上法重复固定2 ~3次。滴片:将固定后的沉淀物加新鲜固定液013~015ml(视细胞多少而定),用吸管吹打混匀,制成细胞悬液。吸取细胞悬液2~3滴,以约20cm或更高的距离滴于清洁冰湿的载玻片上,并轻轻吹一口气,以助细胞、染色体分散。室温晾干。染色:用Giemsa染液(1份G iemsa原液加9份pH为712的磷酸缓冲液)染色30分钟,自来水冲洗晾干备用。 2结果与讨论用上法制得的染色体标本分裂相多,染色体分散良好、清晰。以往资料通常是在终止培养前3~4h加入秋水仙素[2,3],由于秋水仙素作用时间较长,获得的染色体标本收缩过度,不便于显带。作者通过多次实践,将秋水仙素的作用时间控制在1h15min到115h范围内,使染色体标本较为伸展,便于显带和分析。低渗时间可延长至35min,以便使染色体分散、消除细胞背景,使标本更加清晰。但需注意不要过猛吹打细胞,否则会造成染色体散落、丢失。参考文献 11周焕庚.人类染色体.北京:科学出版社11987185~86 21蔡绍京.细胞生物学与医学遗传学实验指南.上海:第二军医大出版社,2002147~48 31柳家英.医学遗传学.北京:北京医科大学出版社,19981233~234 (收稿日期2003-11-08) # 33 #