愈伤组织的诱导形成及分化
第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的诱导、形成及特点
一、愈伤组织的诱导和形成
愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。
植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即： 外植体＋培养基＋环境
愈伤组织
愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。
图4.1 愈伤组织的形成特点
1. 诱导期
愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。
诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。
2. 分裂期
外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。
小麦幼胚 分裂期 分裂期
分化期 分化期
图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期
（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。烟草、胡萝卜等的脱分化很容易，而禾谷类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。
进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发生分化，产生新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。
3. 分化期
愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。
愈伤组织分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，细胞分裂活动突然转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面方向，出现瘤状结构外表和内部分化（见图 4.2）。此时，愈伤组织中出现瘤状结构的拟分生组织成为暂不再进一步分化的生长中心。分化的愈伤组织中有维管组织出现，但不形成维管系统，呈分散的节状和短束状结构。
二、愈伤组织的保持
1. 愈伤组织的颜色
外植体细胞经过诱导启动、分裂和分化等一系列变化后，形成无任何结构的愈伤组织。新鲜的愈伤组织颜色为奶黄色，也有白色且有光泽者，少数呈淡绿色。老化的愈伤组织则转变为黄色乃至褐色。
2. 愈伤组织的保持时间
愈伤组织在原来的培养基上保持一段时间后，由于培养基水分或营养物质的减少，以及愈伤组织本身分泌的代谢产物的不断积累，达到产生毒害的水平后，愈伤组织不再生长，如继续培养，愈伤组织开始老化，直至死亡。一般情况下，愈伤组织在原来的培养基上保持2～3周后，必须转移到新鲜的培养基上进行继代培养（Subculture）。继代培养的方法是将原来的愈伤组织分割成小块转移到新鲜的培养基上，用于继代培养的愈伤组织块必须达到一定的大小，一般直径为5 mm，重量约为100 mg，否则在新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生长十分缓慢。
应当注意的是，继代培养时愈伤组织不能硬性分割，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。因此，在分割愈伤组织时要根据具体情况，顺其自然进行分割，同时，还要选择新鲜健康的愈伤组织进行继代培养。
3. 愈伤组织的生长周期
愈伤组织自原来的培养基上转移到新鲜的培养基上3～7天即可恢复生长，随后2～3周内生长达到高峰，愈伤组织细胞分裂处于最活跃时期。到这一时期结束时，愈伤组织生长开始缓慢下来，此时愈伤组织体积达到最大。因此，通常在愈伤组织生长达到高峰前进行继代培养，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂状态，继代后有利于愈伤组织的恢复生长。否则，愈伤组织在停止生长较长一段时间后再转移到新鲜的培养基上，较难恢复细胞分裂。研究表明，24 C和弱光有利于愈伤组织的保存。据报道，大豆细胞系的愈伤组织在这种条件下可以保存15年。
4. 拟分生组织
一般认为愈伤组织是无任何组织结构的细胞团，但组织解剖学的研究表明，完全由均一薄壁细胞构成的愈伤组织极少存在。愈伤组织在分裂期会出现导管细胞、筛管细胞、分泌细胞、毛状体细胞及木栓细胞等，同时还会出现由小而密集分裂细胞构成的细胞团，这些细胞
团称为拟分生组织，并在以后的分化中成为形成芽原基及根原基的中心，此时的愈伤组织常呈颗粒状。
三、愈伤组织的继代时间与遗传稳定性和植株再生
愈伤组织经长期继代培养会出现遗传上的不稳定性和变异性，使染色体发生倍性和结构上的改变及分子水平上的变化。由其诱导产生的再生植株，也会相应产生遗传上与用于培养的原始亲本不同的遗传变异和遗传组成的不一致性。利用这种特性可进行作物品质改良及次生代谢产物的生产。
有些研究认为，愈伤组织经长期继代培养后会失去再生能力。到目前为止，多数研究表明，经长期继代培养的愈伤组织仍有再生能力。
愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间的不同而异。同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。组织培养中涉及到的遗传变异，主要是细胞核组成的改变，且变异不可逆。这种遗传上的改变包括染色体畸变、细胞核破碎以及由于细胞内复制引起的多倍性和分子水平上的改变等。培养基成分中外源激素的成分与变异的产生密切相关。此外，培养时间对变异的产生影响也很大，如烟草和胡萝卜的愈伤组织经几个月继代培养，细胞多倍性水平提高。但也有例外，经长期继代培养后，愈伤组织细胞的倍性仍保持不变，处于稳定状态，如桉属愈伤组织经3年和10年的继代培养未发现多倍体和非整倍体细胞。
四、胚性与非胚性愈伤组织的特点
不同物种、基因型或外植体在不同培养条件下可以形成不同类型的愈伤组织，有的仅能诱导形成非胚性愈伤组织，而有的在适宜条件下则被诱导形成胚性愈伤组织，二者具有明显的不同特点。例如，春小麦胚性和非胚性愈伤组织在颜色、表面光滑度、质地、胚性细胞的多少、细胞形态、细胞质和细胞核及核仁上，都表现出很大的差异（见表4.1）。胚性愈伤组织是体细胞胚胎发生的前提和基础。
表4.1 春小麦胚性与非胚性愈伤组织的特点
第二节愈伤组织的形态建成
一、愈伤组织形态建成的方式
愈伤组织细胞分裂常以无规则方式发生，尽管此时发生细胞分化，但并无器官发生。只有在适宜的培养条件下，愈伤组织才能进一步分化，进行器官发生，产生苗或芽的分生组织，进而再生植株。
愈伤组织的形态建成主要有以下几种方式（见图4.3）：
图4.3 愈伤组织形态建成的主要方式
① 通过产生单极性的不定芽，在不定芽的下方长出不定根，同时在二者之间形成维管束组织，进而形成完整植株。多数植物属这种类型。
② 通过产生单极性的不定根，在不定根的上方产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织，形成完整植株。这种类型在双子叶植物中较常见，而单子叶植物中则少有。
③ 愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，形成无根苗或无 苗根。
④ 在愈伤组织邻近部位分化出不定根和不定芽，然后两者再结合起来，形成完整植株，根和芽的维管束必须相连，否则植株不能成活（见图4.4）。丛生苗属此种形成方式，根和芽的连接方式同正常胚胎形成。
⑤ 通过体细胞胚胎途径再生植株，这也是一种较为常见的 类型。
1—芽开始分化；2，4—分化出不定芽；3，7，8—丛生苗；
5—再生小植株；6，9—再生植株
图4.4 小麦愈伤组织形态建成与植株再生
（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织
外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不全都具有形态建成的能力。具有形态建成能力的愈伤组织有一定的形态结构特点。但具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过调控培养条件，尤其是生长调节物质和继代方式，可以调控形态建成，将无形态建成能力的愈伤组织调控成具有形态建成能力的愈伤组织。如调控不当，也可以使具有较强形态建成能力的愈伤组织变为具形态建成能力较弱的愈伤 组织。
三、愈伤组织诱导、增殖及其形态建成的调控
愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程（见图4.5），主要受植物种类、基因型、外植体、培养基和培养环境等因素的调控（见图4.6）。
图4.5 小麦幼胚愈伤组织诱导与植株再生示意图
（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，1990）
图4.6 影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素
不定芽
不定根
1. 基因型
基因型是离体培养过程中影响愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的一个重要因素，同一物种不同基因型作用明显不同。例如，不同基因型春小麦成熟胚经离体培养后，愈伤组织的出愈率和增殖速度明显不同（见表4.2和表4.3），所有基因型的成熟胚几乎在接种后第2天开始萌动，第4天开始形成愈伤组织，基因型间出愈时间没有差异，但出愈率明显不同。各基因型的出愈率高低顺序为：辽10>东农7742>Roblin>东农7757>新克旱9。方差分析结果表明，愈伤组织出愈率的基因型效应差异显著（F＝28.67**）。
表4.2 不同基因型出愈率
注：“
（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
表4.3 各基因型愈伤组织生长势分析
注：
（东北农业大学小麦研究室，明凤，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
从表4.3可以看出，各基因型在接种前单胚重量没有显著的差异（F＝2.15）。但随着培养时间加长，基因型间单胚发生的愈伤组织鲜重出现明显差异，继代达100天时，各基因型间单胚愈伤组织鲜重差异极为显著（F＝20.94**）。5个基因型在继代过程中，单胚愈伤组
织鲜重虽均为上升趋势，但生长势强弱差异明显（见图4.7），基因型间生长势强弱顺序为东农7757>辽
图4.7 小麦不同基因型单胚愈伤组织在继代过程中鲜重变化
（东北农业大学小麦研究室，明凤，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
基因型对离体培养条件反应的差异在以往的报道中多有涉及，离体培养起始材料的选择十分重要。曾寒冰（1988）对小麦未熟胚离体培养的研究表明，不同基因型差异明显，最终成苗率最少只有9.8%，最高达100%。
基因型是控制愈伤组织形态建成的关键，不同物种外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜蓿等较易发生器官分化，而禾谷类、豆类、棉花等愈伤组织形态建成相对较难。同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不一样，如高单宁含量的高粱栽培品种8个基因型幼花序外植体诱导的胚性愈伤组织，分化成植株的能力不同，最低者SC 0167-14E仅获得11株，IS3150最高，达948株（见表4.4）。
表4.4 高粱花序外植体供体基因型及其愈伤组织年龄对其分
化成植株的影响
（引自
2. 外植体
一般而言，分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂时期的分生组织细胞较易诱导出愈伤组织。薄壁细胞分化水平较低，有较大发育的可塑性，进行分裂的潜力可保持很多年，如25年树龄的椴属茎的薄壁细胞仍可诱导形成愈伤组织。分生组织细胞分裂潜能强，而细胞分裂是脱分化形成愈伤组织的前提。
以不同器官作为外植体诱导的愈伤组织，其器官发生能力因植物而异，有的植物差别不大，如烟草和水稻；而有的则明显不同，如翅鞘莎，以根、茎和叶为外植体时，愈伤组织的
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
粉蕉愈伤组织的诱导
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.360docs.net/doc/a01931860.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
小麦愈伤组织的诱导
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心 细胞工程实验实验报告 胡萝卜愈伤组织诱导培养实验 摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。 关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养 胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。 1.材料和方法 1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。 1.2方法： 1.2.1愈伤组织的诱导培养 （1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8 （2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤） （3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次； （4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块； （5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶 （6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况 1.2.2继代培养 从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）1.2.3愈伤组织再分化的诱导 （1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L （2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养 一、实验目的 学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。 二、实验原理 愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。 通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。 三、实验用品 器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。 四、实验内容及操作方法 注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。1）超净工作台等准备工作：同前。 2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。 3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。 4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。 五、观察记载内容与实验报告 1、观察记载内容 每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。每隔3天观察一次。 2、实验报告
1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析 A. 描述培养物的变化及其形态特征； B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。 再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
绿豆芽愈伤组织诱导培养实验报告
生物工程中游技术实验 --植物组织、器官培养的研究 学校： 学院： 班级： 姓名： 学号：
绿豆芽愈伤组织诱导培养实验 【摘要】本实验以MS＋2,4-D为基本培养基,添加NAA或6-BA,对绿豆芽材料进行体外培养,诱导形成愈伤组织。结果表明,在一定浓度范围内,NAA和6-BA对绿豆芽的诱导有促进作用。不同激素组合培养下，绿豆芽外植体形成愈伤组织的类型不同,其色泽、细胞的形态结构显著不同。其中，细胞分裂素和生长素的组合诱导芽及芽的增殖效果最好，MS+6-BA(6mg/L)+NAA(0.4mg/L)培养基最适。 【关键词】绿豆芽；组织培养；愈伤组织；6-BA；2,4-D；NAA;全能性 一、前言 细胞工程(Cell engineering) 是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。本文主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。 植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性,即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。因而,每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样,经离体培养再生成植株。随着细胞工程技术的不断发展,植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展,目前已在许多植物上,特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。统计资料显示,目前全世界已有6000多种植物细胞和组织培养成株。实验证实,植物叶肉细胞、茎尖、根尖、花粉、胚、胚乳等细胞或组织均可以再生成植株。 本试验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导绿豆芽的愈伤组织，加深对植物外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。 6-BA为细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。如果超过0.1毫克就会抑制发根，超过0.5毫克则完全不发根。NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。2,4-D是一种人工合成的植物生长激素。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化 一、目的 掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。 二、原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 四、仪器设备及用具 （一） 仪器设备 超净工作台 培养室 （二） 用具（每组5人用量） 量筒：100ml ×2 培养皿：￠9cm ×1 三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1 枪形镊：×4 无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5 五、试剂及培养基 （一） 试剂 75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml) (二) 培养基 1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 六、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、消毒剂的配制 （1）、75%酒精：每组配95ml 。量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可. （2）、2%NaCLO ：每组配100ml. x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数； y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。 3、种子去壳 用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。 4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行） 将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 y X= (ml)
愈伤组织诱导及观察
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出
植物愈伤组织诱导培养基的配制
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25
愈伤组织的诱导形成及分化
第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化 第一节愈伤组织的诱导、形成及特点 、愈伤组织的诱导和形成 愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组 织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组 织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。 植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体+培养基+环境愈伤组织 愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图 4.1 ）。 改变原来的分化方向和代谢方式, 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质，为细胞的分裂和增殖奠定基础外植体外层细胞开始分 裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透 明愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，转向内部的局部地区，并改变 分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组 织，但不形成维管系统 图4.1 愈伤组织的形成特点 1. 诱导期 愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植 体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂 方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。 诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同 基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个 月后，诱导期延长为2天。 2. 分裂期 外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的 细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图 4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。 图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期 （东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况 分化期分化期
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 . 实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二. 实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技 术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件 下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期
起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是 成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4- 二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。 分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2?4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。 愈伤组织的形态发生方式 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化
龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验
108 林业科技开发2013年第27卷第1期 doi ：10．3969/j．issn．1000－8101．2013．01．030 龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验 袁云香 （渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000） 摘 要：以龙凤竹茎段为外植体，采用不同培养基进行愈伤组织诱导试验。将获得的龙凤竹愈伤组织转入再分化 培养基中，采用正交设计实验，添加不同浓度6－BA 、NAA 和蔗糖，组成9种不同的再生植株分化培养基，对龙凤竹愈伤组织进行再分化培养。结果表明:NMB 为最适的基本培养基;诱导培养基中添加6－BA 1mg /L +NAA 0．1mg /L 时，有利于龙凤竹愈伤组织形成，诱导率达86．67%;再分化率最高的培养基配方为NMB +6－BA 2．0mg /L +NAA 0．2mg /L +5%蔗糖。关键词：龙凤竹;组织培养;愈伤组织;再分化 Experiment on callus induction and redifferentiation of Pedilanthus tithymaloides var．nanus ∥YUAN Yun-xiang Abstract ：The stems of Pedilanthus tithymaloides var．nanus were taken as explant and induced callus formation．The dif-ferent culture media ，the proportion of different plant hormone were investigated．To add different concentration 6－BA and NAA to the medium composed of 9different plant regeneration medium by orthogonal design L 9（34）were investigated．The results showed that the suitable media NMB was in favor of the induction ，the induction medium added 1mg /L 6－BA and 0．1mg /L NAA was beneficial to the callus induction．The suitable regeneration medium was NMB containing 2．0mg /L 6－BA ，0．2mg /L NAA and 5%sucrose ，it could improve obviously the frequency of regenerated shoots．Key words ：Pedilanthus tithymaloides var．nanus ；tissue culture ；callus ；redifferentiation Author ’s address ：College of Chemistry and Life Science ，Weinan Teachers University ，Weinan 714000，Shaanxi ，China 收稿日期：2012－08－28修回日期：2012－10－29 基金项目：陕西省教育厅项目（编号：12JK0832）；陕西省教育厅项目（编号：09JK434）；国家自然科学基金项目（编号：31000410）。作者简介：袁云香（1980－），女，讲师，主要从事植物分子遗传学研究 工作。E- mail ：yuanyunxiang2006@126．com 龙凤竹（Pedilanthus tithymaloides var．nanus ）为 大戟科红雀珊瑚属红雀珊瑚的变种之一，植株小巧玲珑、通体绿色、茎肉质、叶排成两列、株型极为美观，其栽培育种技术已受到人们的高度重视。目前，关于其他变种的多肉多浆花卉的引种栽培研究已有报道，例如红雀珊瑚、玉麒麟、非洲霸王树等品种的栽培技术较为成功。由于龙凤竹种苗资源有限，常规的繁殖方 法耗时长、难以满足市场需求［1］ 。因此，组织培养技术已成为龙凤竹快速繁殖的重要途径。 在组织培养过程中，不同培养基、不同植物生长调节剂种类以及同一种植物生长调节剂的不同浓度都会影响龙凤竹愈伤组织植株的再生。因此，开展不同植物生长调节剂对龙凤竹愈伤组织植株再生的影响研究，有利于筛选出一种高效快速的龙凤竹愈伤组织植株再生方法，为龙凤竹的规模化生产研究奠定良好基础。 1材料与方法1．1 试验材料 以渭南市花鸟市场购买的龙凤竹当年生枝条的 嫩茎为试验材料。1．2试验方法 1．2．1 龙凤竹愈伤组织的诱导 剪取龙凤竹当年生枝条的新嫩枝，放入烧杯中，加入适量洗衣粉，在自来水下冲洗约2h 后，再用蒸馏水冲洗5min ，于超净工作台内，先用75%酒精处理15s ，再用0．1%升汞处理8min ，然后用无菌水冲洗5 6次，切成约0．5 1．0cm 的茎段作外植体，接种于诱导培养基上进行培养。诱导培养基基本成分为N 6、 MS 、NMB 、NB 。其中：（1）NMB 为N 6大量元素+MS 微量元素+B5有机元素；（2）NB 为N 6大量元素+B5微量元素及有机元素。4种基本培养基均添加脯氨酸500mg /L +水解酪蛋白300mg /L +6－BA 1．0mg /L +NAA 0．1mg /L +蔗糖3%+0．7%琼脂，pH 5．8（单位下同）。培养条件为24 26?光照培养，光照强度为1500 2000lx 、每天光照时间12h 。21d 后统计诱导率，并观察愈伤组织诱导及生长状 技术开发欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
水稻愈伤组织培养
水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083 摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。 关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL) 培养基：诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8） 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制： 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D； 用NaOH或HCl调节PH=5.8； 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，
愈伤组织
愈伤组织 愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。 概述 黑暗培养下烟草愈伤组织 在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。 形成 肉原生质体愈伤组织 在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l来诱导植物材料愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：
细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。 培养 愈伤组织的培养的培养分为继承培养和分化培养。 愈伤组织的继承培养 草莓花药愈伤组织 在外植体上形成以后，愈伤组织的继承培养在已充分发育，但没有出现老化现象之前，应及时从外植体上分离下来，转入继代培养基上进行继代培养。分离是必要的措施，继代培养时若连同外植体就会影响愈伤组织的产量和质量，可能是由于残存的外植体在死亡过程中会产生某些有毒物质，愈伤组织会出现老化、粘化及不正常分化等现象。一般情况下，从外植体上分离的愈伤组织须经过4～6周的培养才能得到充分的发育。为了增殖发育良好的愈伤组织，继代培养是有效的措施。在良好的培养条件下，甘蔗愈伤组织可继代一年以上而不丧失分化能力。影响甘蔗愈伤组织继代培养的主要因素是激素。为协调继代培养中既要维持愈伤组织增殖生长良好、又要保持愈伤组织的分化能力的矛盾，就必须筛选最佳的激素浓度。有报道指出，2，4－D （2～3mg/L）对保持愈伤组织不分化是有效的，但随继代培养次数的增加，其分化绿苗的能力也随之下降。