基因工程期末复习整理

动物基因工程

名词解释：

1、体细胞克隆：以体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等) 为受体，将目的基因以DNA 转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。

2、显微注射：：在显微操作仪下，将DNA用微吸管注射到处于原核时期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA复制而整合到基因组，然后将转化后的胚胎移植到受体子宫中继续发育，得到转基因动物。

3、ES细胞：

4、基因打靶：是指外源DNA通过与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组, 整合到预定位点, 从而改变细胞遗传特性的方法。

5、基因敲除：将一个结构已知但功能不祥的基因去除，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除表达机制，从而推测该基因的生物学功能。

6、乳腺生物反应器：通过转基因技术将外源基因在动物乳腺中高效表达，在乳汁中生产目的产品。

问题：

1、常用动物转基因的方法有哪些？比较优缺点

显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶法、精子载体法体、细胞核移植法、磷酸钙共沉淀法。其中，常用动物转基因的方法有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞介导法。

（1）显微注射法的优点：操作技术性很强

显微注射法的缺点：设备昂贵，胚胎死亡率高

（2）逆转录病毒法的优点：操作简便，可大量感染细胞，形成单拷贝，转化率高逆转录病毒法的缺点：没有包装蛋白，不能形成完整的病毒颗粒

2、谈谈如何获得转基因小鼠？

显微注射法：书118页

逆转录病毒法：书123页

胚胎干细胞法：书123页

3、转基因动物有哪些重要的应用？（书138-143页）

（1）研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质

（2）建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法

（3）改善动物生产性能，提高动物育种效率

（4）作为医用或食用蛋白的生物反应器，可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。

4、比较在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？

动物：

优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上

缺点：A、哺乳动物细胞的表达水平低B、高表达细胞株构建复杂C、细胞大规模培养工艺复杂D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高

第三章基因工程常规技术

一、名词解释

1．klenow fragment：DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5’ → 3’聚合酶活性和3’ → 5’外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。

2．Taq酶：水生栖热菌（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。

3．核酸酶S：来源于米曲霉素（aspergillusoryzas），作用于ssDNA和ssRNA。

4．末端转移酶：terminal transferase，来源于小牛胸腺。是仅存于前淋巴细胞及淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’OH末端。

5．碱性磷酸酶（AKP/ALP）：同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，同时每个单体均具有一个活性中心。是能够将对应底物去磷酸化的酶，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。包括BAP（细菌碱性磷酶）和CIP（小肠碱性磷酶）。

6．Plasmid：质粒，是细菌染色体外的闭合环状的双链DNA分子，主要有F 质粒（F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）。

7．表达载体：具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的元件的载体。为了有效的转录，必需有强大的启动子和终止子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD （RBS）

8．穿梭载体（shuttle vector）：能在两种宿主生物体内复制的载体，可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间。

9．MCS：多克隆位点，指质粒上的一段DNA，其上包括一序列限制性内切酶位点，以利于外源DNA的插入。

10．Cosmid：黏粒，柯斯质粒。一种由质粒和噬菌体联合构建的新载体。黏粒的基因组包括以下部分：质粒复制原点、多克隆位点、抗药性基因和λ噬菌体两端的cos位点。

11．YAC：酵母人工染色体。利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，克隆能力为200-2000kb。YAC载体含有的着丝粒,端粒和复制起点三种成份可以满足YAC自主复制，染色体在子代细胞间分离及保持染色体稳定的需要。YAC 以环状方式存在，具有大肠杆菌质粒的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

12．脉冲电场凝胶电泳：DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该方法可分离长至5Mb的DNA分子。

13．RT-PCR：反转录PCR，由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

14．RACE：cDNA末端的快速扩增。利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其5’或3’端缺失序列的方法。

15．差异显示：利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。

16．Real-time PCR:实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

17．基因组文库：从某种生物体中分离出完整的染色体DNA，并且用限制性内切酶消化到所需的平均长度，连于相应的载体，构建而成。

18.cDNA文库（cDNA Library ）：含某种细胞特定时间所有的mRNA经逆转录

产生的cDNA与相应载体（质粒或噬菌体）连接后，得到的重组克隆的总和

19.滴度：病毒悬液的浓度，可用pfu（噬菌斑形成单位）表示。如每微升的

噬菌斑形成单位(pfu/μL)。

20.差减cDNA文库：差减文库也称扣除文库，对存在差异表达的两种材料提

取mRNA (或反转录后合成cDNA)，用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(Driver)与含有目的基因的试验方(Tester)进行杂交，选择性的扣除两部分共同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。

21.Southern blotting：Northern blotting：都为核酸分子杂交技术。：探针与待测核酸序

列之间的杂交。指将核酸转移至固相载体（能吸附核酸的滤膜或滤纸），用探针（酶或同位素等标记的核苷酸片段）去反应，从而实现对核酸进行分析和鉴定的技术。不同的是，Southern 杂交的对象是DNA。另一个是RNA。

22.缺口平移法：有DNaseⅠ，PolⅠ，标记dNTP。

23.原位杂交（in situ hybridization，ISH）：探针直接与细胞或者组织中的核酸进行杂交，

DNA的变性、杂交及检测等都在载玻片上进行，如菌落杂交、噬菌斑杂交、染色体杂交、组织切片原位杂交、整胚原位杂交。如果探针是由荧光底物标记，最后的检测可以通过荧光显微镜进行直观观察，称为荧光原位杂交。

24.FISH（fluorescence in situ hybridization）：荧光原位杂交技术，是将DNA(或RNA)

探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA 序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。

25.基因芯片（DNA microarray）：又称DNA 阵列（DNA array)，在玻片、硅片、薄膜

等载体很小的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段，形成了高密度的DNA微阵列。

二．简答题

1.基因工程发展过程中标志性的事件有哪些？

1)发现DNA连接酶

2)分离限制性内切酶与逆转录酶

3)体外DNA重组技术的建立及基因工程的诞生

4)DNA测序技术

5)Ti质粒作为植物基因工程的载体

6)PCR技术的发明

2.基因工程的基本原理是什么？

在DNA 模板、引物、dNTP 、适当缓冲液（Mg 2+）的混合物中，在耐高温DNA 聚合酶的催化下，对一对寡聚核苷酸所界定的DNA 片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA 与引物之间的变性、退火（复性）、延伸三步反应为一周期，循环进行，使目的DNA 片段得以扩增。

3. 简述作为基因工程载体应具备的条件。

1) 具有一个或多个限制酶切点，以供外源基因插入其中; 2) 具有标记基因，以鉴定重组是否进入受体细胞; 3) 能自我复制，否则可能导致重组丢失; 4) 对受体细胞无害;

5) 大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大不便操作。

4. 基因中常用的抗性标记有哪些，工作原理是什么？

5. 质粒DNA 的分离提取及纯化的方法有哪些，原理是什么？

提取方法：

方法 原理

碱裂解法

在碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 的氢键断裂，致使宿主染色体DNA 变性，但闭合环状的质粒DNA 由于拓扑缠绕而不能彼此分开。当以pH 4.0的NaAc 高盐缓冲液调节其pH 至中性时，质粒DNA 迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA 不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA 、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。（小量制备质粒DNA ）

煮沸法

沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA 链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA 变性，但CCC 质粒DNA 因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC 质粒DNA 可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA ，然后回收上清中的质粒DNA 。（对于某些特殊的质粒，只能用煮沸的方法进行提取）

还有酚氯仿裂解法、SDS 法、 羟基磷灰石层析法等

常用的纯化方法有柱层析法，和氯化铯梯度离心法，二者都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。具体的氯化铯梯度离心法原理是：溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭

抗性标记基因

编码 原理

Ampr 酶 水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性

tetr 1个膜蛋白 阻止四环素进入细胞

camr 乙酰转移酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性 neor （kanr ）

氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（卡那霉素衍生物）转移酶失活 hygr

潮霉素β磷酸转移酶

使潮霉素β失活

分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。

6.蓝白斑筛选（α互补筛选）的基本原理是什么？

MCS处具有半乳糖苷酶N端编码基因（lacZ’），宿主菌具有该酶的C端编码基因，二者结合能够分解底物X-gal，产物使菌落显蓝色。当目的基因插入MCS时，lacZ’失活，无α互补现象，菌落为白色。

7.λ噬菌体载体如何从λ噬菌体改造而来？与质粒载体相比有何特殊用途？

去除λ噬菌体上的编码溶原生命周期的非必须序列及一些限制性内切酶位点，加入多克隆位点、某些筛选标记基因构建而成的载体。可将外来目的DNA替代或插入中段序列（包装范围35-51 kb），使其随左右臂一起包装成噬菌体。与质粒载体相比具有转化效率高、可以容纳长的外源DNA、可将外源DNA整合到细菌的基因组上等特点，适合建库。

类型：包括插入型载体、置换型载体。

8.简述M13噬菌体的特点及在基因工程领域的用途。

M13噬菌体是lacZ’筛选标记和MCS与M13噬菌体基因组进行重组而形成的载体，既能象质粒一样复制，又能产生单链DNA，用于DNA测序，体外定点诱变等。

9.限制性内切酶有哪些类型：基因工程常用的是哪一或几类？

限识别特定的DNA序列，在一定的条件下切割双链DNA。

可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类：I类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼具甲基化和内切酶活性，识别和切割位点不固定；II类酶是基因工程中主要的工具酶。

10.限制性内切酶有哪些特点？

1)识别双链分子的某种特定核苷酸序列

2)使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开

11.YAC为何能用于建立基因文库？

YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。Y AC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

12. 试比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE ）：普遍用于蛋白质及小分子核酸分析。分辨DNA 范围：1-1000 bp 。 琼脂糖凝胶：孔径较大，对蛋白质不起分子筛作用，一般用于DNA 的分析。分辨DNA 范围：0.1-60 kb 。

相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。

13. 核酸染色的方法有哪些？各自的原理是什么？

14. 简述PCR 技术的基本原理。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR ，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA 片段。可看作生物体外的特殊DNA 复制。

该技术是在模板DNA 、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。

15. Real-time PCR 分基本原理是什么？在基因表达分析方面有何优点？

实时定量荧光PCR ，是指在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1) 全封闭PCR ，无需跑胶，无需后处理；

2) 增加精确性，实时监测，直观看到反应的对数期；

3) 引物和探针同时与模板特异结合，降低反应的非特异性；

4) 结果分析快捷方便。

16. Real-time PCR 所使用的标记方法有哪些类型？ 1）SYBR 荧光染料： 2）TaqMan 荧光探针：

3） Molecular beacon 分子信标探针：

方法

原理

溴化乙锭(EB) 是一种荧光染料，EB 分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，

发出红色荧光

银染

银染色液中的Ag +可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag +还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。其灵敏度比EB 高200倍.但银染色后，DNA 回收复杂

SYBR Green I 染料 与DNA 小沟结合（而EB 则是嵌入到碱基之间） ；最大激发波长497nm ，

最大发射波长520nm ；高灵敏度，较低毒性；结合双链DNA 分子后荧光增

强800-1000倍

17.分离基因常用的方法。

类型常用方法用途

质粒DNA 碱裂解法DNA重组

基因组DNA CTAB法基因克隆、文库构建、遗传多态性分析总RNA 胍盐法RT-PCR克隆基因、Northern Blotting

18.外源基因导入宿主的方法有哪些。

物理法：DNA直接注射法；颗粒轰击技术

化学法：即用化学方法构建非病毒载体系统，借之完成基因转导。有脂质体载体法和受体介导法

生物学方法：主要通过构建病毒载体来完成。有腺病毒(Adv）、单纯疱疹病毒（HSV）、腺相关病毒等。

19.基因组文库的构建的基本步骤有哪些？

（1）基因组DNA的提取

破碎细胞，抽提蛋白，沉淀核酸。

（2）基因组DNA的片段化

用限制性内切酶Sau3A（识别4碱基）对基因组DNA进行部分酶切，能得到相对较长的DNA片段。回收20 kb左右大小的片段。

（3）DNA片段与载体连接

DNA片段与用BamHⅠ（与Sau3A为同尾酶）消化的置换型λ噬菌体载体臂进行连接，构成重组DNA分子。

（4）重组分子的转化与筛选

重组DNA分子与包装蛋白混合，就能够自动完成包装过程，

形成完整的、具有很强感染能力的噬菌体颗粒。

20.简述cDNA文库构建的基本步骤。

（1）mRNA的制备

提取总RNA，亲和层析纯化出mRNA。

（2）cDNA的合成

mRNA逆转录成cDNA，合成双链cDNA。

（3）双链cDNA与克隆载体连接

双链cDNA接上接头，插入载体，构成重组DNA分子。

（4）重组分子的转化与筛选

21.cDNA的合成有哪些方法？

mRNA逆转录成cDNA，合成双链cDNA。

cDNA第2条链的合成方法

置换法：第一条链合成完成后，用RNaseH降解杂交分子上的mRNA链。利用降解后的小片段作为引物，大肠杆菌聚合酶Ⅰ合成第二条链，片段之间的缺口由连接酶连接，形成完整的cDNA第二条链。这种方法应用较广，因为它能得到较完整的mRNA信息。

自身引导法：逆转录酶体外合成DNA链结束前，DNA链会自己折转回来几个核苷酸形成一个发夹结构。DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段从发夹结构的末端开始合成DNA链，反应完成后，用RNaseH降解RNA链，用S1核酸酶（专门切割单链DNA）打开发夹结构。用S1核酸酶对发夹结构进行切割会导致部分cDNA序列信息的丢失，因此这种方法应用较少。

22.基因芯片的基本原理及用途。

在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TA TGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选等。为快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。也应用在差异表达分析、杂交测序等技术中。

23.化学法测序法的基本原理。

碱基通过特定化学试剂修饰后，哌啶甲酸使该位置的磷酸二酯键断裂。

G反应：硫酸二甲酯使G上的N7甲基化；A ＋G反应：甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化；C ＋T反应：肼使T和C的嘧啶环断裂后重新环化成五元环；C反应：盐存在的条件下，肼只与C反应；

凝胶电泳将DNA链按长短分开；根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。适用性：测定短DNA片段和某些被修饰的DNA。

24.Sanger测序法的基本原理。

酶法（Sanger法、双脱氧法、末端终止法）。利用双脱氧核苷酸2’，3’-ddNTP来终止DNA的聚合反应。样品一链为模板，引物5’端标记。在4只试管中分别加入适当的引物、模板、4中dNTP、DNA聚合酶，再分别加入一种ddNTP。与模板结合引物在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应。当ddNTP参入时，由于它在3’位置没有羟基。故不与下一个dNTP结合从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只管中的反应物，由于每一反应管中只加入了ddNTP，则该管中各种长度的DNA都终止于该碱基，且电泳中该泳道不同带DNA3’端为同一种ddNTP。根据泳道中DNA带位置读出与模板链互补的新链系列。

25.酵母双杂交技术的基本原理

将BD与已知蛋白E融合产生的BD-E称为诱饵（Bait），将AD与末知蛋白F融合产生的AD-F称为猎物（Prey），当诱饵钓到猎物时（E和F间有相互作用），转录激活因子就能激活目标基因（报告基因）的转录与表达

26.核酸杂交中，探针标记的方法有哪些？

1)缺口平移法：标记dNTP

2)随机引物法：标记dNTP

3)末端标记法：碱性磷酸酶和多核苷酸激酶5’标记；末端转移酶3’标记

4)PCR法：标记dNTP

基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达

名词解释：

1、SD序列：mRNA中的核糖体结合位点，位于翻译起始位点上游，负责翻译的起始

2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体

3、融合表达：动物或者是植物的细胞经过某种培养经过酶的作用使其细胞相融合构成的新细胞

4、inclusion body：包含体，蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物活性的固体颗粒。

5、T7启动子：

A.强大的T7 启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，

B.T7 RNA 聚合酶合成mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合酶的快5 倍

C.由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5启动子控制下，IPTG间接诱导）。

6、AOX1：编码乙醇氧化酶的基因

问题：

1、表达载体有哪些特点？

（1）、具有强的启动子，如T7、SP6、tac、λ的PL等；

(2)、启动子和A TG之间具有核糖体结合位点（SD序列）；

(3)、具有强的转录终止序列。

2、谈谈pET表达载体系统表达目的蛋白的优点。

3、蛋白质分泌表达的优点及影响因素？

蛋白质分泌表达的优点：

1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单

2. 蛋白质酶解的程度不甚严重

3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）

4. 蛋白质的N-末端结构真实正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割

影响分泌表达的因素：

（1）信号肽存在与否及类型；

（2）启动子强弱；诱导剂浓度；

（3）宿主菌的类型；培养条件（温度、培养基）

4、原核表达系统和真核表达系统相比，各自的优缺点是什么？

原核表达系统的优点：

（1）产量高、表达高效；

（2）操作简单（可调控表达、方便纯化）；

（3）可大规模发酵生产；

（4）成本低。

原核表达系统的缺点：

（1）缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。

（2）表达产物易形成包含体

真核表达系统的优点：书78页（甲醇酵母表达系统的优点）

易培养、繁殖快、便于基因操作

真核表达系统的缺点：

（1）缺乏强有力的启动子

（2）分泌效率差

（3）表达质粒易丢失

5、原核表达中产生包含体的原因及解决措施有哪些？

产生包含体的原因：

（1）原核细胞缺乏真核细胞的修饰系统；

（2）缺乏折叠所需的酶和辅助因子，无法正确折叠；

（3）合成速度过快，产量太高；

（4）蛋白质类型；

（5）培养条件（温度及培养基）

解决措施：

（1）降低培养温度；诱导物浓度；

（2）培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。

6、酵母菌表达外源蛋白的优点。

（1）遗传背景清楚

(2)属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加工系统

（3）可发酵生产

（4）不产生内毒素，属安全的表达系统

7、甲醇酵母表达系统的基本构成及特点

基本构成：

甲醇酵母表达载体为整合型质粒，整合位点一般位于HIS4(组氨酸脱氢酶基因)区或AOX1(乙醇氧化酶)区。载体上含有5’AOX1启动子、多克隆位点、3’AOX1终止子，以HIS4基因作为互补选择标记。

特点：

8、自选一种新型的有药用价值的细胞因子，提出基因克隆、蛋白质表达与纯化、生物活性测定的实验研究方案。

书80-83页

基因工程

第五章植物基因工程

一、名词解释

Ti质粒：环状DNA 分子, 分子量90～150×106 D, 其长度约200～250kb。分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。由T-DNA区、毒性(vir) 区、结合转移区（con）、复制起始区（ori）组成。

T-DNA：决定肿瘤的形态和冠瘤碱的合成，两端25bp同向重复序列（左臂和右臂）。

双元载体系统：双元载体系统,包括两个质粒,一个是带有T-DNA的微型质粒(双元Ti载体),一个是带有Vir区的辅助质粒。

报告基因：编码易于检测的产物的基因，包括抗性基因（抗生素、抗除草剂）、酶基因（如gus）和发光基因（如gfp）等。

二、问答

1、回答植物基因工程技术实施的基本策略？

答：（1）目的基因分离和鉴定（2）植物表达载体的构建（3）繁殖扩增重组DNA（4）目的基因向植物细胞的转化（5）转基因植株的筛选和鉴定。

2、简述农杆菌介导的植物转基因技术的基本原理？

答：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

3、植物转基因中用到的报告基因有哪些？

答：gfp基因、gus基因、luc基因、Npt-Ⅱ基因、aphIV基因、spt基因、Bar基因、epsps基因。

4、什么是基因沉默，导致转基因发生失活的原因有哪些？

答：基因转入后不表达的现象，称为基因沉默。导致转基因发生失活的原因有：位置效应、DNA甲基化、重复序列诱导、共抑制。

5、植物基因工程技术的应用有哪些方面？

答：（1）农作物基因工程

提高农作物抗性

1）抗病性：抗病基因；抗病毒基因；病程相关蛋白类基因。

2）抗虫性：毒蛋白基因，如苏云金芽孢杆菌(Bt) 毒蛋白基因等;

蛋白酶抑制剂基因，如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cp TI)等;

淀粉酶抑制剂基因，如菜豆a2淀粉酶抑制剂基因等;

昆虫特异性神经毒素基因，如蜘蛛毒素基因等。

3）抗自然灾害：逆境诱导的植物蛋白激酶基因；编码细胞渗透压调节物质基因；超氧化物岐化酶(SOD)基因;防止细胞蛋白质变性的基因。

性状控制

1）延长存储期：多聚半乳糖醛酸酶基因；乙烯合成酶基因。

2）改善营养品质和技术性状：高赖氨酸基因；高分子量谷蛋白亚基(HMW) 基因。

3）代谢分配的调节：木质素生物合成酶基因AD、OMT。

（2）植物生物反应器

植物生物反应器是指通过基因工程途径，以农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。

1）可食用植物疫苗：食用含有抗原的新鲜水果，使食用者肠道免疫系统激发对病原体的抗

病能力，如乙肝、艾滋病等。

2）利用植物生产抗体：利用植物合成细菌（突变链球菌,引起龋齿）抗体。

3）植物营养品：水稻中过量表达维生素A霍植物甾醇类，可减少人体内的胆固醇。6、谈谈你对转基因植物的安全性的认识？

答：首先是毒性问题。一些研究学者认为，对于基因的人工提炼和添加，可能在达到某些人们想达到的效果的同时，也增加和积聚了食物中原有的微量毒素。

其次是过敏反应问题。对于一种食物过敏的人有时还会对一种以前他们不过敏的食物产生过敏，比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小麦和贝类食品过敏。

第三是营养问题。科学家们认为外来基因会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。

第四是对抗生素的抵抗作用。当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去，这个基因会与别的基因连接在一起。人们在服用了这种改良食物后，食物会在人体内将抗药性基因传给致病的细菌，使人体产生抗药性。

第五是对环境的威胁。在许多基因改良品种中包含有从杆菌中提取出来的细菌基因，这种基因会产生一种对昆虫和害虫有毒的蛋白质。在一次实验室研究中，一种蝴蝶的幼虫在吃了含杆菌基因的马利筋属植物的花粉之后，产生了死亡或不正常发育的现象，这引起了生态学家们的另一种担心，那些不在改良范围之内的其它物种有可能成为改良物种的受害者。

最后，生物学家们担心为了培养一些更具优良特性，比如说具有更强的抗病虫害能力和抗旱能力等，而对农作物进行的改良，其特性很可能会通过花粉等媒介传播给野生物种。

第八章蛋白质工程

一、名词解释：

蛋白质工程：以蛋白质结构和功能的关系为基础，通过分子设计，将蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质的过程。

定点突变：专一改变基因中某个或某些特定氨基酸编码序列的技术。改变一个核苷酸到改变某一结构域的编码序列。

二、问答

1、蛋白质分离纯化的一般程序

答：1、蛋白质的提取（1）实验材料的选择及处理（2）组织及细胞破碎（3）蛋白质分子的抽提

2、粗分级（1）沉淀；（2）透析；（3）超滤；（4）冷冻干燥；（5）超速离心

3、细分级（1）层析技术：凝胶过滤层析（分子筛层析）、离子交换层析、吸附层析、亲和层析

（2）电泳技术：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、双向电泳

2、简述蛋白质空间结构分析一般方法

答：一级结构测定具体步骤：（1）蛋白质的纯化（97％以上纯度）（2）打断二硫键（3）末端氨基酸序列测定（4）大肽断成小肽（5）小肽分离、纯化和测序（6）组合小肽，确定氨基酸序列

二级结构的测定：

圆二色谱法：

当圆偏振光通过蛋白质溶液时，受到整个蛋白质分子手性及氨基酸残基手性的综合影响，生成椭圆

偏振光，这种光学效应称为圆二色性。

蛋白质不同主链盘绕方式（α螺旋及β折叠等）所生成的椭圆偏振光不同，可计算出蛋白质主链中

α螺旋、β折叠及无规卷曲的相对比例。

三维结构测定：

（1）X射线衍射法

原理：X射线通过晶体发生衍射，得到衍射图案；对其进行数学计算，可得到电子密度图；可推测出蛋白质的三维构象。

对象：蛋白质晶体

（2）核磁共振（NMR）法

原理：蛋白质中的原子核由于自旋形成了自己的小磁场，受电磁辐射照射会发生能量吸收，原子核从低能态翻转到高能态，称此核与外加磁场发生共振，由此得名。

对象：蛋白质溶液

3、蛋白质的分子设计及其类型

答：蛋白质分子设计

（1）概念：为实现蛋白质工程而对蛋白质实施改造的方案，按照改造部位的多寡分为小改、中改和大改三类。

（2）类型

1）小改：通过定点突变或者化学修饰实现对蛋白质分子中的少数氨基酸残基的改造。是分子设计中最主要的方法。

2）中改：对不同蛋白来源的结构域进行拼接组装。

3）大改：完全从头设计全新的蛋白质分子。

4、简述蛋白质工程通常包括哪些主要步骤。

答：蛋白质工程的主要步骤通常包括：

（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；

（2）测定其氨基酸序列；

（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;

（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；

（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；

（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。

第八章蛋白质工程

一、名词解释

1.蛋白质工程：

2.定点突变（概念、技术和类型）：

二、简答题

1.蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质的抽提；粗分级（沉淀、透析、超滤、冷冻干燥）；细分级（凝胶过滤层析、离子交换层析、PAGE、SDS-PAGE等）；鉴定：含量测定、分子量及等电点测定、纯度分析、性质鉴定。

2.简述蛋白质空间结构分析一般方法

一级结构：二硫键打开，末端氨基酸测定；大肽断成小肽，小肽分离及测序，序列组合

二级结构：圆二色谱（说说原理）

三维构象：X衍射、核磁共振

3.蛋白质分子设计及其类型和分子设计及方法（小改、中改和大改）

4.简述蛋白质工程通常包括哪些主要步骤和蛋白质工程实施的五大要素

三、重难点

1．蛋白质结构预测及方法