基因工程期末高分复习题

基因工程复习题

一、名词解释：（10～20%）

基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶的Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统

原位杂交：将细胞或组织的核酸固定保持在原来的位置上，然后用探针与之杂交的一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目的基因在细胞或组织中的分布和表达变化。

粘性末端：双链DNA被限制性内切酶切割后，形成的两条链错开几个碱基，而不是平齐的末端。

转化：受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变的过程。

停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA 扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。

逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。

PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。

α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽），该序列不能产生有活性的β-半乳糖苷酶。

感染（infection）特指以λ噬菌体、粘粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。其中，由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程又称为转导（transduction）。

47、转染（transformation）指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

二、填空题（20%）

1、DNA片段重组连接的方法主要有平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接。

2、感受态细胞是指具有摄取外源DNA分子能力的细胞。

3、λ噬菌体蛋白对重组DNA体外包装时，包装长度为野生型λDNA的75~105%。

5、PCR反应体系含有耐热的T aqDNA聚合酶，化学合成的寡核苷酸引物，四种dNTP，合适的缓冲液体系。

6、核酸探针包括：cDNA探针；基因组DNA探针；寡核苷酸探针和RNA探针。

7、部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积

8、DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。枯草杆菌蛋白酶；(1)5'-3'合成酶的活性；(2)3'-5'外切核酸酶

9、为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。碱性磷酸酶；5’端的磷酸基团

10、基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。质粒DNA；病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体

11、pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。pMBl；pSCl01；pSF2124(R质粒)

13、DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)_________________(2)_______________ (3) _____________(4)_ ______________________。(1)黏性末端连接；(2)平末端连接；(3)同聚物接尾连接；(4)接头连接法

14、差示杂交(differential hybridization)技术需要__________________________。两种不同的

细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因

16、将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个___________，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个_________________。基因组DNA克隆；基因组DNA文库17、根据Northern杂交的结果可以说明：_____________________________。外源基因是否进行了转录

18、在________________技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的DNA探针杂交。Southern印迹

19、可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。5’→3’合成酶；3’ →5’外切核酸酶

20、根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素：(1)_______________ (2)__________________(3)_________________。(1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表达载体；(3)不含内含子

21、放射免疫筛选的原理基于以下三点：

(1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合；(3)抗体能够被标记

22、黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。质粒；λ噬菌体；45

23、限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名

24、第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内

切核酸酶是_____________。EcoK；EcoRl

25、切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。DNA聚合酶I：5'一3'外切核酸酶；5'一3'合成酶

26、就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。

复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入

27、pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过

和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。pBR322和M13；pMBl；转座子

28、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增；对某些噬菌体(如λ噬菌)的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽

29、Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：

(1)__________________________________________________________________

(2)_________________________________________________________________。

(1)印迹的对象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)电泳条件不同，前者是变性

条件，后者是非变性条件

30、限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的修饰来实现的。

31、II型限制酶既具有识别位点的专一性，也具有切割位点的专一性。它作用时需要Mg2+ 离子作辅助因子。

32、个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称限制性片段长度多态性（RFLP）。

33、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为___________时吸附DNA, ___________时摄人DNA。0?C；42?C

34、野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)

(2) (3) 。(1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记

35、形成平末端的方法有：用产生平末端的限制酶切，用S1核酸酶切除粘末端，用DNA 聚合酶填平粘末端。

36、回收DNA片段时，在确定DNA条带位置时，应使用长波长紫外灯，以最大限度减少对DNA的照射损伤。

37、基因工程受体菌的基因型常为r-m-rec-, r-表示限制缺陷型，m-表示修饰缺陷型，rec-表示重组缺陷型。

38、CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，DNA以DNA-Ca2+ 复合物形式吸附于细胞表面。

39、TaqDNA聚合酶具有，缺乏因此无。5‘→3‘聚合酶活性，3’→5‘外切酶活性，校正功能

40、PCR循环次数一般设定为，过多的循环次数会导致的出现。25－30次，PCR 反应“平台效应”。

41、如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5’突出的黏性末端，则可以用__________

进行3’末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3’突出的黏性末端，可以用__________________进行3’末端标记。Klenow酶填补的方法；T4DNA聚合酶

42、限制酶是一类专门切割DNA的酶，它能特异性识别切割双链DNA。

43、需要部分酶切时可采取的方法有：减少酶的用量；缩短反应时间；增大反应体积。45、重组DNA技术的基本过程：①目的基因的制备；②载体的选择和制备；③DNA分子的体外连接；④将重组DNA导入宿主细胞；⑤重组体的筛选和鉴定；⑥重组体的扩增、表达和其他研究。

46、在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增质粒DNA；抑制了菌体的数量，有利于裂解。

48、II型限制酶既具有识别位点的专一性，也具有切割位点的专一性。它作用时需要Mg2+离子作辅助因子。

50、基因工程受体菌的基因型常为r-m-rec-, r-表示限制缺陷型，m-表示修饰缺陷型，rec-表示重组缺陷型。

52、核酸的体外标记法分为和。化学法；酶法

53、核酸的体外标记法中的酶法最常用的是和标记。125I；光敏生物素标记。

54、影响核酸分子杂交的因素有：（1）核酸分子的浓度与长度；（2）温度；（3）离子强度；（4）甲酰胺；（5）核酸分子的复杂性；（6）非特异性杂交反应等。

三、选择题（20%）

1、下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（）C

A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体

B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达

2、下列不属于获取目的基因的方法是（）B

A．“鸟枪法”B．转录法C．反转录法D．根据已知氨基酸序列合成法

3、以下说法正确的是（） A

A. 在真核细胞的基因结构中，编码区也含有不能编码蛋白质的序列

B. 终止子是转录终止的信号，因此它的DNA序列与终止密码TAA相同

C. 基因的非编码区通常不起什么作用

D. 启动子的作用是阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来

4、Ⅱ型限制性内切核酸酶：( ) B

(A)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列

(B)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供

(C)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(D)有外切核酸酶和甲基化酶活性

(E)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供

5、关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。B

(A)由作用于同一DNA序列的两种酶构成

(B)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(C)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰

(D)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统

6．在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( ) B

(A)反应时间(B)酶量(C)反应体积(D)酶反应的温度

7、限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( ) B

(A)双链DNA的特定碱基对(B)双链DNA的特定碱基序列

(C)特定的三联密码(D)以上都正确

8、在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) A

(A)防止DNA的自身环化(B)同多核苷酸激酶一起进行DNA的5′末端标记

(C)制备突出的3′末端(D)上述说法都正确

9、下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的 C

(A)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，

因而有较多的拷贝数

(B)可以在氯霉素作用下进行扩增(C)通常带有抗药性标记

(D)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子

10、下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?( ) C

(A)质粒(B)黏粒(C)酵母人工染色体(Y AC)

(D) 噬菌体(E) cDNA表达载体

11、Col El是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒：( ) ACD

(A)是松弛复制型（B)具有四环素抗性

(C)能被氯霉素扩增(D)能产生肠杆菌素

12、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )B

(a)OCDNA>SCDNA>LDNA(b)SCDNA>LDNA>OCDNA

(c)LDNA>OCDNA>SCDNA(d)SCDNA>OCDNA>LDNA

13、能够用来克隆32kb以下大小的外源片段的质粒载体是( ) A

(A)charomid (B)plasmid (C)cosmid (D)phagemid

14、双脱氧末端终止法测序体系与PCR反应体系的主要区别是前者含有( ) D

(A) 模板(B) 引物

(C) DNA聚合酶(D) ddNTP(E) 缓冲液

15、PCR实验的特异性主要取决于（） C

(A) DNA聚合酶的种类(B)反应体系中模板DNA的量

(C)引物序列的结构和长度(D)四种dNTP的浓度

(E)循环周期的次数

16、常用的Southern转膜方法有哪几种（）。BCD

(A) 硝酸纤维素膜法(B) 毛细管虹吸印迹法

(C) 电转印法(D) 真空转移法

17、原位杂交可以用来检测（）ABCD

(A) DNA(B) RNA(C) cDNA( D) RNA和DNA

18、核酸酶S1能降解（）AC

(A) DNA单链(B) DNA双链

(C) RNA单链(D) DNA/RNA杂交双链

19、构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（A、B、C、D）

(A)避免载体自身环化(B) 提高连接效率(C)控制外源基因的插入方向

(D) 便于转化后的筛选(E) 便于修改阅读框

20、获得DNA重组体后，还需进一步鉴定，可采用的方法有：（A B C D）

(A) DNA序列测定(B) PCR鉴定

(C) 酶切鉴定(D) 表达产物的鉴定

(E) 进行定点突变

21、外源基因与载体的连接方式有：（A B C D E）

(A) 粘端连接(B) 平端连接

(C) 加同聚尾连接(D)加人工接头连接

(E) 用T载体连接

22、关于多克隆位点，下列叙述正确的是：（A B D）

(A) 是外源基因的插入部位(B) 由许多酶切位点组成

(C) 是宿主细胞上的一段特殊序列(D)是人工合成的一段DNA序列

(E) 含有药物抗性基因

23、用蓝白斑筛选重组子时，IPTG的作用是：（A）

(A)诱导载体上的Lac Z基因表达(B) 作为显色反应的指示剂

(C) 作为酶的作用底物(D) 诱导载体上的抗性基因表达

E. 诱导宿主上的Lac Z基因表达

24、PUC系列载体的抗性筛选标记为：（C）

(A)卡那霉素(B)四环素

(C) 氨苄青霉素(D)G418

(E)氯霉素

25、．免疫印迹法筛选重组体的原理是：（E）

(A) 根据载体抗性基因的表达(B)根据载体报告基因的表达

(C) 根据DNA与DNA的杂交(D) 根据DNA与mRNA的杂交

(E) 根据外源基因的表达

26、Ti质粒：( ) ACDE

(A)可从农杆菌转到植物细胞中(B)作为双链DNA被转移

(C)在植物中导致肿瘤(D)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素(E)需要细菌的vir基因帮助转移(F)在植物细胞中作为染色体外质粒

28、关于cDNA的最正确的说法是：( )C

(A)同mRNA互补的单链DNA(B)同mRNA互补的双链DNA

(C) 以mRNA为模板合成的双链DNA(D) 以上都正确

29、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( )C

(A)染色体DNA断成了碎片(B)染色体DNA分子量大，而不能释放

(C)染色体变性后来不及复性(D)染色体未同蛋白质分开而沉淀

30、关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( )D

(A)溶液I的作用是悬浮菌体(B)溶液Ⅱ的作用是使DNA变性

(C)溶液Ⅲ的作用是使DNA复性

(D)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

31、在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型 B

(A)r+m+rec*(B)r-m-rec-(C)r-m-rec+(D)r+m+rec-

32、cDNA文库包括该种生物的( )A

A某些蛋白质的结构基因B所有蛋白质的结构基因

C所有结构基因D内含子和调控区

33、Southem印迹的DNA探针( )杂交。C

A只与完全相同的片段B可与任何含有相同序列的DNA片段C可与任何含有互补序列的DNA片段

D可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段E以上都是

34、用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。C

ASouthem印迹杂交BNorthem印迹杂交

CWestern印迹D原位菌落杂交

35、报告基因( ) ACD

A以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列

B以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区

C能用于检测启动子的活性D能用于确定启动子何时何处有活性36、在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( )A

A诱导宿主的α肽的合成B诱导宿主的ω肽的合成

C作为酶的作用底物D作为显色反应的指示剂

37、切口移位是指在( )作用下，使( )带上放射性标记。B

A DNA聚合酶I，RNA

B DNA聚合酶I，DNA

C DNA聚合酶Ⅲ，RNA

D DNA聚合酶Ⅲ，DNA

38、用免疫化学法筛选重组体的原理是( )A

A根据外源基因的表达B根据载体基因的表达

C根据mRNA同DNA的杂交D根据DNA同DNA的杂交

39、分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是：( )B

A. 抑制核酸酶的活性

B. 保护DNA，防止断裂

C. 加速蛋白质变性

D. 有利于细胞破碎

40、CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：( )C

A氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去

B 氯化铯可以较多地插入到S

C DNA中去

C EB可以较多地插入到线状DNA中去

D EB可以较多地插入到SC DNA中去

41、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( )C

A染色体DNA断成了碎片

B 染色体DNA分子量大，而不能释放

C 染色体变性后来不及复性

D 染色体未同蛋白质分开而沉淀

42、切口平移法标记DNA探针时，需用的酶是：（B）

A限制酶 B DNase I

C RNase

D DNA连接酶

E 拓扑异构酶

43、重组DNA分子导入受体细胞的方法有：（A B C）

A. 转化

B. 转染

C. 转导

D. 转位

E. 转录

44、关于菌落杂交法筛选重组体，下列叙述正确的是：（B D）

A. 需要外源基因的表达

B. 需要探针与外源基因有同源性

C. 需要IPTG诱导

D. 不需要外源基因的表达

E. 不需要探针与外源基因有同源性

45、核酸分子杂交时，用于标记的探针可以是：（A B）

A. DNA

B. RNA

C. 抗原

D. 抗体

E. DNA连接酶

46、限制性内切酶可特异性识别( B )

A. 双链DNA的特定碱基对

B. 双链DNA的特定碱基序列

C. 单链RNA的特定碱基序列

D. 单链DNA的特定碱基序列

E 双链RNA的特定碱基对

47、下列因素中影响限制酶切割的有( A,B,C,D,E)

A. EDTA浓度

B. 甘油浓度

C. DNA纯度

D. 酶的自身活性

E. 盐浓度

48、重组连接时，反应体系必须的组分有（A、C）

A．Mg2+ B. BSA C. A TP D. PO43- E . EDTA

49、PCR产物具有特异性是因为( )C

A. Taq DNA酶保证了产物的特异性

B. 合适的变性,退火,延伸温度

C. 选择特异性的引物

D. 引物的Tm值不同.

50、要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是（）A

①限制酶②连接酶③解旋酶④还原酶

A．①②B．③④C．①④D．②③

51、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C

A. 染色体DNA断成了碎片

B. 染色体DNA分子量大，而不能释放

C. 染色体变性后来不及复性

D. 染色体未同蛋白质分开而沉淀

52、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：B

A. OC DNA>SC DNA>L DNA

B. SC DNA>L DNA>OC DNA

C. L DNA>OC DNA.SC DNA

D. SC DNA>OC DNA>L DNA

53、在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ）

A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶

E. RNAase

54、下列关于同裂酶的叙述错误的是( B )

A.是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。

B.它们的识别序列完全相同。

C.它们的切割方式可以相同，也可以不同。

D.有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。

E.两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。

55、需进行DNA部分酶切时，控制下列哪种条件最合适（ D ）

A. 反应时间

B. 反应体积

C. PH

D. 限制酶量

E.反应温度

56、在回收DNA片段时，观察电泳结果为尽量减少对DNA的照射损伤应使用（A）A．长波长紫外 B. 短波长紫外 C . 长波长红外 D. 短波长红外 E. ABCD 都不可

57、DNA回收时，如要除去EB（溴化乙锭）可用下列那种试剂（ A ）

A．正丁醇 B. 苯酚 C. 氯仿 D. 异戊醇 E. 乙醇

58、大肠杆菌出现感受态的生理期是（B ）

A．潜伏期 B. 对数期 C. 对数后期 D. 平衡期 E. 衰亡期

59、PCR实验的特异性主要取决于（C）

A.DNA聚合酶的种类

B.反应体系中模板DNA的量

C.引物序列的结构和长度

D.四种dNTP的浓度

E.循环周期的次数

60、在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间的氢链断裂，而核酸分子中所有的共价

键则不受影响的称为（）。A

A. DNA变性

B. DNA复性

C. DNA重组

D. DNA杂交

61、将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定

性及定量研究，称为（）。C

A. 原位杂交

B. 核酸酶保护实验

C. 斑点印迹

D. 狭缝印迹

62、在Southern印迹杂交中用来标记核酸探针最常用的核素是（）。A

A. 32P

B. 3H

C. 35S

D. 125I

四、简答题（30%）

1、简述用杂交法从文库中筛选重组DNA的基本过程。

答：一般要先得到文库的转化菌或噬菌体，涂板培养，形成单菌落或噬菌斑，将其影印到硝酸纤维素膜上，细菌影印物需在膜上重新形成菌落，而噬菌斑影印无须进一步培养。经过裂解—DNA变性—固定—制备探针—杂交—放射自显影等过程，最后从原始平板上挑取阳性克隆。

2、如果用EcoR I酶切DNA时出现星活性，试分析原因？

答：主要原因有：酶浓度太高；高PH；低盐；含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子；甘油浓度高于5%；存在某些有机溶剂。

3、某一质粒载体有T et r和Amp r的表型，在Amp抗性基因中有一EcoR I的酶切位点，现用EcoRI切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片段的重组体？

先将重组体的转化菌落涂布含有Tet抗性的平板，再从中挑取抗Tet的菌落接种于含有Amp抗性的平板，选取不在Amp抗性的平板上生长而仅在Tet抗性的平板上生长的菌落即可得到转化有重组体的菌落。

4、当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？

答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。

5、如何将一平末端的DNA片段与BamH I形成的粘末端连接？

答：使用加接头连接法。人工合成一段含BamH I酶切位点的DNA短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamH I切割连接片段，即可形成BamH I的粘末端。

6、什么是同聚尾连接法？具有哪些优缺点？

答：同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源DNA的3‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下，连接成重组DNA。

其优点在于（1）由于同一DNA两端粘尾相同，不会自身环化；（2）连接效率高；（3）用任何一种方法制备的DNA都可用这种方法连接。

其缺点在于（1）方法复杂；（2）外源片段较难回收；（3）由于添加了同聚尾，可能会

影响外源基因表达。

10、什么叫穿梭载体？

答：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。

12、简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的概念及其生物学功能？

限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

生物学功能：

①酶的切割位点可为获得DNA物理图谱的特殊标记

②利用限制性内切酶可切割产生特殊DNA片段的能力，使得纯化这些DNA片段成

为可能

③获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质

13、试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？

外因：是可以预见的，如反应条件（缓冲液、反应温度、反应时间、终止酶切的方法）、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积等等

内因：星星活性、末端长度、位点偏爱、甲基化底物、底物的构象

14、.何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。

影响因素：甘油浓度高（＞5%）、酶过量（＞100U/微升）、离子强度低（＜25mM）、PH值过高（＞8.0）、加了有机溶剂、用其它二价阳离子如Mn++、Cu++、Co++、Zn++代替了Mg++

克服方法：减少酶的用量可避免过份地酶切，减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100-150 mM（如果不会抑制酶活性的话），降低反应PH值到PH7.0，使用Mg++作二价阳离子

18、说明Sanger DNA测序法的原理。

答：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延

伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末

端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获

得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的

序列。

19、影响DNA迁移率的因素有哪些？

影响DNA迁移率的因素有：DNA分子的大小，琼脂糖浓度，DNA的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。

四、问答题：

1、什么是蓝白斑筛选法?

答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

3、试述切口平移法标记DNA探针的原理。

答：切口平移法是目前实验室中最常用的一种DNA探针标记方法。其原理是利用DNase I 在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口，切口处产生一个5′末端和一个3′末端，3′末端即可作为引物。利用大肠扩菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性的催化下,依次将dNTP 连接到切口的3′末端-OH上，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA链。如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸（如32P-dCTP）,则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射性活性的DNA探针。用此法标记的核苷酸的掺入率可达20~30%。

4、将外源性DNA克隆到b-LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？

答：β-半乳糖苷酶失活的插入型载体，在其基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ区段，此区段编码有β-半乳糖苷酶基因lacZ，在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal(5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷)形成蓝色化合物（5-溴-4-氯靛蓝）。这样由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌（lac基因缺陷菌），涂布在补加有IPTG和X-gal 的培养基平板上，会形成蓝色的噬斑，但若在lacZ区段上插入外源DNA片段，就会阻断β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，这种λ重组体感染的lac-指示菌由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑，相反未发生外源基因插入则出现蓝色噬菌斑，以利筛选。

6、整个基因克隆的过程则包括哪些步骤？

答：i）用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化；ii）外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；iii）将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞的程序；iv）获得了重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。

7、Y AC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，Y AC具有优越

性?

答：Y AC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两

个端粒。Y AC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

8、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?

答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。

9、什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?

答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。

Klenow酶主要有下列用途：

(1)修复反应，制备平末端

可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。

用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。

(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)

该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。

(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。

五、是非判断题

1. DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。( )

2. 质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。( )

3. COS位点，COS质粒，COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端。( )

4. 入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有2个成对的限制性酶切点。( )

5. 原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列，以利于进行有效的转录。( )

6. 甲基化酶能使DNA序列发生甲基化，早基化DNA的更为稳定，被甲基化的酶切点，不易被酶切割。（

7. S1酶具有补平DNA链粘性末端的特性。（）

8. cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。（）

9. 原核细胞的RNA聚合酶只能识别原核细胞的启动子以催化RNA的合成。（）