发酵工程复习

1.发酵工程的上游技术工艺流程划分包括哪几个部分？

答：优良菌种的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备。

2.简述微生物工程的发展史？

答：1）自然（天然）发酵时期

从史前到19世纪末，在微生物的性质尚未被人们所认识时，人类已经利用自然接种方法进行发酵制品的生产。

2）纯培养技术的建立时期

1900－1940年间，由巴斯德（Pasteur）和科赫（Koch）建立了微生物分离纯化和纯培养技术，可以认为纯培养技术的建立是发酵技术发展的第一个转折时期。

3）通气搅拌（好气性）发酵（工程）技术的建立时期

20世纪40年代初，随着青霉素的发现（1928年弗莱明(Fleming)发现青霉素，1965年获诺贝尔医学生理学奖。），抗生素发酵工业逐渐兴起。通气搅拌发酵技术的建立是发酵工业发展史上的第二个转折点。

4）人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立时期

20世纪60年代，随着生物化学、微生物生理学和遗传学的深入发展，科学家在深入研究微生物代谢途径和氨基酸生物合成的基础上，通过对微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变类型，再在人工控制的条件下培养，即利用调控代谢的手段进行微生物菌种选育和控制发酵条件，从而大量生产出人们所需要的产品。

5）发酵动力学、发酵的连续化自动化工程技术的建立时期

20世纪80年代以来，随着学科之间的不断交叉和渗透，微生物学家开始用数学、动力学、化学工程原理、计算机技术对发酵过程进行综合研究，使得对发酵过程的控制更为合理，新工艺、新设备层出不穷。如日本的塔式连续发酵设备、法国L-M型单级连续发酵槽等。在一些国家，已经能够自动记录和自动控制发酵过程的全部基本参数，包括温度、pH值、罐压、溶解氧、氧化还原电位、空气流量、CO2含量、泡沫等，明显提高了生产效率。

6）与基因操作技术相结合的现代发酵工程技术阶段时期

20世纪80年代以后，由于DNA体外重组技术的建立，使发酵工业进入了进入了一个崭新的阶段，即以基因工程为中心的生物工程时代，新产品层出不穷。

3.工业生产用微生物菌种保藏方法有哪些？如何防止菌体退化？

答:保藏方法：定期移植低温保藏，液氮超低温保藏法，甘油低温保藏法，沙土保藏法，麸皮保藏法，蒸馏水保藏法，冷冻干燥保藏法。

菌种退化是指整个菌体在多次接种传代过程中逐渐造成菌种发酵力或繁殖力下降或发酵产物得率低的现象。

措施：1）控制传代次数

2）创造良好的培养条件

3）利用不易衰退的细胞传代

4）采用有效的菌种保藏方法

5）合理的育种

6）选用合适的培养基

3.影响菌种质量的主要因素有哪些？

答：1）培养基：对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的培养基成分配比完全应该进行多因素的优选，通过对比试验去确定，从而最大地发挥菌种的特性，提高产量。

2）种龄与接种量：种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间称为种龄。通常以菌体处于生长旺盛期（对数生长期）为合适。移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例即为接种量。接种量取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度，接种量的大小直接影响发酵周期。一般地，细菌0.5～1% ，酵母菌10～15%

3）温度：温度直接影响微生物生长和合成酶。

4）pH值：由于环境中pH值不同，微生物原生质膜（具有胶体性质）所带的电荷也不同，从而影响微生物对营养物质的吸收、酶的合成及其活性、代谢途径和细胞膜的通透性的变化。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值。在种子扩培过程中。控制pH值，不但可以保证微生物种子的很好生长，而且可以防止杂菌污染。

5）通气和搅拌：通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好。

6）泡沫：泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排出；影响设备的利用率；易招致染菌。

7）染菌的控制：必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。

8）种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐级数一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。

3.简述淀粉水解糖的制备方法？

答：1）酸解法：是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。

优点：生产方法简单易行，对设备要求简单，水解时间短，设备生产能力大。

缺点：要求耐腐蚀、耐高温的设备，有副反应转化率降低，淀粉颗粒大小要均匀，浓度不宜过高

2）酶解法(双酶水解法）：第一步“液化”，是利用a-淀粉酶将淀粉液转化为糊精及低聚糖，是淀粉可溶性增加；第二步“糖化”，是利用糖化酶将糊精或低聚糖水解转变为葡萄糖。

优点：反应条件温和，转化率高，糖液营养物质丰富可简化发酵培养基的组成，制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高有利于糖液的精制。

缺点：反应时间长，设备多，糖液过滤困难

3）酸酶结合水解法：包括酸酶法和酶酸法

注：转化率及消耗时间：双酶水解>酸酶法>酸解法

6.为什么青霉素的前体物质（苯乙酸）不宜一次添加过多，而需要采用分批间歇添加或连续滴加的方法加入？

答：因为苯乙酸和大多数前体物质一样对生产菌体有毒，浓度过大队菌体的生长不利，并且添加过多容易引起挥发和氧化。

16.举例说明抗生素工业在发展过程中常用促进剂和抑制剂的作用？

答：

①“九二0”：促进某些放线菌的生长的发育，缩短发酵周期或提高抗生素发酵单位

②巴比妥药物：能增加链霉素产生菌的菌丝抗自溶能力

③硫氰化苄：降低菌在三羧循环中的酶活力，而增加戊糖代谢，使之更利于四环素的合成

④聚乙烯醇：改善通气效果，进而促进发酵单位提高

8.培养基灭菌常有哪些方法？大工业发酵生产用发酵液的灭菌方法常采用合法？

答：培养基灭菌：

①干热灭菌法：焚烧—最彻底的灭菌方法；烧灼—直接用火焰灭菌方法；干烤—加热160-180℃2小时。

②湿热灭菌法：加压蒸汽灭菌法（最有效的灭菌方法121 ℃20~30分钟）；煮沸消毒法（水煮100 ℃5分钟(繁殖体)~2小时(芽胞)）；巴氏消毒法（较低的温度（61 ℃30分钟）杀灭致病菌）。

③射线灭菌法：通常用紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和γ射线等进行灭菌，以紫外线最常用。紫外线穿透力低，只能用于表面灭菌，对固体物料灭菌不彻底，不能用于液体物料灭菌，一般用于无菌室、培养间等空间灭菌。

④化学药品灭菌法：生产车间环境灭菌，人们接种操作前双手的灭菌等，都必须采用化学药品灭菌法。化学药品灭菌的使用方法，根据灭菌对象不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。发酵工业中常用的化学药品灭菌剂有高锰酸钾溶液、漂白粉、75％酒精溶液、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类、抗生素等。

发酵液的灭菌：

11.试比较说明连续灭菌比分批灭菌具有哪些优势？

①可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率。

②发酵利用率高

③蒸汽负荷均衡

④采用板式热器时，可节约大量能量

⑤适宜自动控制，劳动强度小

14.简要分析柠檬酸发酵基质中，锰离子浓度的改变是如何影响黑曲霉对柠檬酸合成的。

答：锰离子缺乏时，蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白的再合成受阻，导致细胞内NH4+浓度升高，减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制，从而促进EMP途径的畅通。

15.概况说明柠檬酸的发酵积累机制及物质分离提纯精制过程。

答：积累机制：

①Mn+缺乏，抑制蛋白合成，导致NH4+浓度升高，解除柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制，促进EMP途径的畅通。

②由于丙酮酸羧化酶是组成酶，不被调节控制。

③丙酮酸氧化脱羧生产乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强啦合成柠檬酸的能力。

④由于顺乌头酸水合酶在催化是建立啦以下平衡：

⑤柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90:3:7 同时控制Fe2+含量是，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

⑥随着柠檬酸的积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。

提纯精制过程：

○1发酵液的预处理即去除细胞及不溶性物质，主要单元操作是离心和过滤○2产品的提取主要单元操作方法有萃取、吸附和蒸发。

○3产品的精制主要单元操作方法有层析法、膜分离法、离子交换法、沉淀法、电泳法等。

○4产品的最后加工主要单元操作方法有结晶、干燥蒸馏等。

18.什么是分批补料培养方法（FBC），与传统分批培养比较，有何特点与作用. 答：分批补料培养：是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式。

特点：①可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；

②可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长引起的一切影响，改善发酵液流变学的性质；

③可用作为控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；

④可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。同连续发酵相比，FBC不需要严格的无菌条件，产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。

作用：1)可以控制抑制性底物的浓度，获得高浓度的产物。

2）可以解除或减弱分解代谢产物的阻遏

3）可以使发酵过程最佳化

19.以乳糖和G为例，说明快速利用利用C源，缓慢利用C源对发酵过程的影响。答：对于青霉素的发酵，在迅速利用葡萄糖培养基中，葡萄糖能较迅速地参与代谢、合成菌体，产生的分解代谢产物却阻遏产物的合成，使得青霉素合成量很少：相反，在缓慢利用的乳糖培养基中，菌体缓慢利用乳糖，有利于延长代谢产物的合成，使得青霉素的产量明显增加。

21.平板划线法的操作步骤：先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱37°C,保温24h，检查无菌后，将待测样品在无菌平板上划线，分别置37°C、27°C培养，以适应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后可观察

23.双层平板培养基检测噬菌体的污染：培养基中低底层为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持40°C，加生产菌作为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12—20h培养，观察有无噬菌体产生.

24.固定化酶：用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

固定化细胞：固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。

特点：酶活性稳定性增强，酶促效率明显增高，具有多步没反应特低，反应时不需添加辅助因子，细胞透性增强，热稳定性增强，易产生副反应。

染菌率：一年内发酵染菌的批数与总投料批次数之比乘以100 %得到的百分率。