透射电镜包埋切片样品制备程序

透射电镜样品制备方法

透射电镜样品制备方法 由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 一．取材的基本要求 组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。 （1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。 （2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。因为固定剂的渗 透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的 固定。 （3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。 （4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防

止细胞自溶。 （5）取材部位要准确。 二．取材方法 将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。 1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行） 动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的 小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的 1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以 上。 *固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。 2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行） 培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，

S4800扫描电镜操作说明书

冷场发射扫描电子显微镜S4800操作说明（普通用户） 燕山大学材料学院材料管A104（场发射，钨灯丝） 编写人：李月晴吕益飞 普通用户在熟练操作1个月后，如无不良记录，可申请高级用户培训。 高倍调清晰：局部放大(Red) →聚焦Focus→消像散 一、日常开机 1，开启冷却循环水电源。 2，按下Display开关至，PC自动开机进入用户界面并自动运行PC_SEM程序，以空口令登入。 3，打开信号采集开关，位置打到1，为打开。 4，打开电源插排的开关。 5，打开装有EDS软件的主机电源。 6，记录仪器运行参数(右下角Mainte)，即钨灯丝真空度。如：IP1：0.0×10-8Pa；IP2：0.0×10-8Pa； IP3：9.6×10-7Pa。PeG-1，<1×10-3；PeG-2，<1×10+2。 注意：PeG≤1×10-3Pa时才能加高压测量。记录的参数：①点Flashing时会显示：In2(Ie)Flashing时电流最大值，如32.9μA；②加上高压后会显示，V ext=3.4kV。 二、轰击（点flashing，即在阴极加额外电压） 目的：高温去除针尖表面吸附的气体 1，最好在每天开始观察样品前一时做flashing； 2，选择flashing intensity为2 ； 3，若flashing运行时Ie小于20μA，则反复执行直至Ie值超过20μA且不再增加。 4，若flashing后超过8个小时仍继续使用，重新执行flshing 。 三、加液氮 容积不要超过1L，能维持4~6h。 四、样品制备及装入 样品制备简单，对样品要求较低，只要能放进样品室，都可进行观察。 1，化学上和物理上稳定的干燥固体，表面清洁，在真空中及在电子束轰击下不挥发或变形，无放射性和腐蚀性。 2，样品必须导电，非导电样品，可在表面喷镀金膜。 3，带有磁性的样品，由于物镜有强磁性，制样必须非常小心，防止在强磁场中样品被吸入

透射电镜的样品制备方法详解

透射电镜的样品制备 透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）． 透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤： ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直

接切割． ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来． ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ． ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等． 制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也

扫描电镜实验报告

扫描电镜实验报告 姓名：xxx 专业：xxx 学号：xxxxxxxx 一、实验目的 1. 了解扫描电镜的构造及工作原理； 2.学习扫描电镜的样品制备； 3. 学习扫描电镜的操作； 3. 利用扫描电镜对铝粉的形貌进行观察。 二、实验原理 扫描电镜原理是由电子枪发射并经过聚焦的电子束在样品表面扫描，激发样品产生各种物理信号，经过检测、视频放大和信号处理，在荧光屏上获得能反映样品表面各种特征的扫描图像。扫描电镜由下列五部分组成，主要作用简介如下： 1．电子光学系统。其由电子枪、电磁透镜、光阑、样品室等部件组成。为了获得较高的信号强度和扫描像，由电子枪发射的扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。常用的电子枪有三种形式：普通热阴极三极电子枪、六硼化镧阴极电子枪和场发射电子枪。前两种属于热发射电子枪；后一种则属于冷发射电子枪，也叫场发射电子枪，其亮度最高、电子源直径最小，是高分辨本领扫描电镜的理想电子源。电磁透镜的功能是把电子枪的束斑逐级聚焦缩小，因照射到样品上的电子束斑越小，其分辨率就越高。扫描电镜通常有三个磁透镜，前两个是强透镜，缩小束斑，第三个透镜是弱透镜，焦距长，便于在样品室和聚光镜之间装入各种信号探测器。为了降低电子束的发散程度，每级磁透镜都装有光阑；为了消除像散，装有消像散器。样品室中有样品台和信号探测器，样品台还能使样品做平移、倾斜、转动等运动。 2. 扫描系统。扫描系统的作用是提供入射电子束在样品表面上以及阴极射线管电子束在荧光屏上的同步扫描信号。 3. 信号检测、放大系统。样品在入射电子作用下会产生各种物理信号、有二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光和透射电子。不同的物理信号要用不同类型的检测系统。它大致可分为三大类，即电子检测器、阴极荧光检测器和X射线检测器。 4. 真空系统。镜筒和样品室处于高真空下，它由机械泵和分子涡轮泵来实现。开机后先由机械泵抽低真空，约20分钟后由分子涡轮泵抽真空，约几分钟后就能达到高真空度。此时才能放试样进行测试，在放试样或更换灯丝时，阀门会将镜筒部分、电子枪室和样品室分别分隔开，这样保持镜筒部分真空不被破坏。 5. 电源系统。其由稳压、稳流及相应的安全保护电路所组成，提供扫描电镜各部分所需要的电源。

扫描电镜SEM制样步骤

扫描电镜S E M制样步 骤 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

扫描电镜观察制样步骤 固定： 1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中, 2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时 3、置于 4℃冰箱中固定12小时。 冲洗： 用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。Or 离心 脱水： 分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟， 干燥： 将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上 预处理好的样品放入干净离心管中待检。 SEM上机测样--测定条件参数设置 分子克隆实验指南第三版，1568页： 25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制； 先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4 配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需： 0.1mol/L K2HPO4，80.2ml 0.1mol/L KH2PO4，19.8ml 混合即是，不用酸碱调PH。 参考文献： DOI:?10.1021/es902165y Microbial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilm Selecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterization A severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer 2

电镜切片样品制作步骤知识讲解

A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗； 固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附：2.5%戊二醛的配制 Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制： --------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克 双蒸馏水加至500毫升 pH调至7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25% 戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值7.3-7.4

扫描电镜生物样品制备步骤

扫描电镜样品制备方法 一、取材 组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。 二、固定 前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。 用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。 后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。 用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。 三、脱水 ＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。 ＊整个过程，样品不要暴露于空气。 1.乙醇脱水，每一级10-20分钟： 30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇； 2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上； 此系列操作均在25度环境中进行； 3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。 四、冷冻干燥 ＊需事先预约冷冻干燥时间； 第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。 五、喷金

附件1： 细菌类样品的前处理方法 1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。玻 片过大或者过厚影响观察效果。 2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰 箱固定2小时左右。 3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。离心去PBS，固体沉 淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。 4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的 玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。 将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。 （样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。 5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入 干燥杯开始进行脱水。

透射电镜样品制作(2015-12-11)

透射电镜样品包埋块制作原理步骤 一、取材： 1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。 2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。 3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。 二、固定： 固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。 1.使用锇酸的注意事项： 锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS稀释成1%的锇酸溶液。 2.戊二醇 戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。 3.固定方法： 样本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。根据不同组织，可适当延长固定时间。由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。一般清洗3次，每次15min左右(或过夜)。 三、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂，如环氧树脂，大多都是非水溶 性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织，常用脱水剂是乙醇和丙酮。乙醇对细胞物质抽提少，组织收缩也少，但它和环氧树脂互溶性差，因此使用乙醇脱水时须用环氧丙烷作为中间溶剂。丙酮和酒精、环氧丙烷互溶，所以通常先用乙醇后再用丙酮的脱水方法。急剧脱水会引起细胞收缩，因此应采用逐级脱水(50%-70%-90%-100%乙醇)而不能急剧脱水。更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%乙醇或丙酮中，并在4℃保存。 四、包埋 1.渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。一般可先用环氧丙烷对半稀释的包埋剂浸透1-2h，再用纯包埋剂37℃烤箱渗透2h左右。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。 2.包埋：目的是以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬固体。理想包埋剂应具备的条件：黏稠适中，有良好切割性；能经受电子轰击；透明度较好；对人体无害。目前常用国产环氧树脂618、Epon812环氧树脂、及低黏度包埋剂Spurr。 3.环氧树脂：环氧树脂为热塑性树脂，主要有两种化学反应基团，即环氧基和羟基。末端环氧基易与其他含活性氢原子化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。单体中羟基能与酸酐结合，形成分子间横桥连接。因此，把环氧树脂单体、胺类、酸酐等三者按一定比例混合，加上适当温度，可形成稳定的交 １

电镜切片样品制作步骤

扫描电镜样品的准备 A悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量 2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。 SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁： 使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定 2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附： 2.5%戊二醛的配制

Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制：--------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO 4.H2O） 2.6xx 磷酸氢二钠(Na2HPO 4.12H2O)29xx 双蒸馏水加至500毫升pH调至 7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25%戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值 7.3-

TEM制样方法及详细步骤

由透射电镜的工作原理可知，供透射电镜分析的样品必须对电子束是透明的；此外，所制得的样品还必须可以真实反映所分析材料的某些特征，因此，样品制备在透射电子显微分析技术中占有相当重要的位置，也是一个涉及面很广的题目。大体上透射电镜样品可分为间接样品和直接样品。我们下面将对间接样品的制备作简单介绍。 间接样品“复型”可以分为五步来进行： 第一步，在拟分析的样品表面滴一滴丙酮，将醋酸纤维素薄膜即A.C.纸覆盖其上，适当按压形成不夹气泡的一级复型； 第二步，待上述一级复型干燥后，小心地将其剥离，并将复制面向上平整地固定在玻璃片上； 第三步，将固定好复型地玻璃片连同一白瓷片置于真空镀膜室中，以垂直方向喷涂碳，以制备由塑料和碳膜构成地“复合复型”。白色瓷片表面在喷碳过程中颜色的变化可以表示碳膜的厚度。 第四步，将复合复型上要分析的区域剪为略小于样品台钢网的小方块后，使碳膜面朝里，贴在事先熔在干净玻璃片上的低熔点石蜡层上，石蜡液层冷凝后即把复合膜块固定在玻璃片上。将该玻璃片放入丙酮液中，复合复型的A.C.纸在丙酮中将逐渐被溶解，同时适当加热以溶解石蜡。 最后，待AC纸和石蜡溶解干净后，碳膜（即二级复型）将漂浮在丙酮液中，将其转移至清洁的丙酮液中清洗后，再转移至盛蒸馏水的器皿中。此时，由于水的表面张力，碳膜会平展地漂浮在水面，用样品铜网将其捞起，干燥后即可置于电镜下观察。

透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）． 透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤： ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直接切割． ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来．

扫描电镜样品制备程序

扫描电镜样品制备程序 一、固定：戊二醛-锇酸双固定法 1．2.5%戊二醛（试剂1）固定4小时（或者过夜） 2．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15-30分钟 3．1%锇酸（试剂3）固定2-4小时 4．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15分钟 二、脱水：乙醇系列 1．30%乙醇15－20分钟 2．50%乙醇15－20分钟 3．70%乙醇15－20分钟 4．80％乙醇15－20分钟 5．90%乙醇15－20分钟 6．95%乙醇15－20分钟 7.100%乙醇两次每次15-20分钟 三、置换： 乙酸异戊酯2次，每次15分钟（或过夜）。 四、干燥： 临界点干燥 五、离子溅射金 六、扫描电镜观察 附注：试剂配置 试剂1：2.5%戊二醛 取0.2M磷酸氢二钠40.5mL（A液），0.2M磷酸二氢钠9.5mL（B液），混合均匀（即0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4），加入10mL浓度为25%的戊二醛，用超纯水稀释至100mL。 试剂2：0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4） A液：0.2M磷酸氢二钠 称取3.561g Na2HPO4.2H2O（或者5.365g Na2HPO4.7H2O）; 或7.164g Na2HPO4.12H2O)，溶于100mL双蒸水中。 B液：0.2M磷酸二氢钠 称取2.760g NaH2PO4.H2O（或者3.121g NaH2PO4.2H2O），溶于100mL双蒸水中。 量取A液36.0mL, B液14.0mL，混合均匀后用双蒸水稀释至100mL，得0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。 试剂3：1%锇酸 将2%的锇酸溶液与0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）等体积混合，得1%锇酸。 注意：该操作在通风橱中进行。

透射电镜常规样品制备流程

透射电镜样品制备流程 由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法： 一．负染色技术 负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。 样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。 二、超薄切片技术 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下： 1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。 2．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。

透射电镜粉末样品制备方法

一、样品要求 1．粉末样品基本要求 （1）单颗粉末尺寸最好小于1μm； （2）无磁性； （3）以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪； 2．块状样品基本要求 （1）需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察； （2）如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察； （3）无磁性； （4）块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备；样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1．目的要明确：（1）做什么内容（如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等）；（2）希望能解决什么问题； 2．样品通过X-Ray粉末衍射（XRD）测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM；这样即可节省时间，又能在XRD 的基础上获得更多的微观结构信息。 3．做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的；同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。） 2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上； 3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微

电镜样品制备方法中英文(常用_

No.1 扫描电镜样品制备方法 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； ?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用梯度浓度（包括30%,50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙 醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。 ?用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸 异戊酯处理样品1-2h。 ?临界点干燥。 ?镀膜，观察。 处理好的样品在Hitachi TM-1000型扫描电镜中观察。 1.Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer. 2.Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (30%,50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to the mixture of alcohol and iso-amyl acetate (v:v=1:1) for about 30 minutes, then transferred to pure iso-amyl acetate for about 1hour. In the end, the specimen was dehydrated in Hitachi Model HCP-2 critical point dryer with liquid CO2. 3.Coating and observation: The dehydrated specimen was coated with gold-palladium and observed in Philips Model TM-1000 SEM. No.2 Negative staining of bacterium The bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then, the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230. No.3透射电镜样品制备方法 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； ?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用梯度浓度（包括30%,50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙 醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇

透射电镜样品的制备方法(精)

试验材料为经过热处理后的钢材! 一、样品要求 1.粉末样品基本要求 (1)单颗粉末尺寸最好小于1μm; (2)无磁性; (3)以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪; 2.块状样品基本要求 (1)需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察; (2)如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察; (3)无磁性; (4)块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备;样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1.目的要明确：(1)做什么内容(如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等);(2)希望能解决什么问题; 2.样品通过X-Ray粉末衍射(XRD)测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM;这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。 3.做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的;同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1.选择高质量的微栅网(直径3mm)，这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步;(注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只;普通碳膜铜网免费提供使用。) 2.用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上(在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面)，轻轻平放在白色滤纸上; 3.取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上(如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。滴得太多，则粉末分散不开，不利于观察，同时粉末掉入电镜的几率大增，严重影响电镜的使用寿命;滴得太少，则对电镜观察不利，难以找到实验所要求粉末颗粒。建议由老师制备或在老师指导下制备。)

扫描电镜的样品制备

3.1 试样制备技术 试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。 和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。扫描电镜的特点是： ①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。 ②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。 ③试样表面一般起伏（凹凸）较大。 ④观察方式不同，制样方法有明显区别。 ⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。 上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和

照相。 3.1.1 块状试样制备 1．导电性材料 导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。这类材料的试样制备最为简单。只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。但在制备试样过程中，还应注意： ①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。 ②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。要防止机械损伤或引进水、油污及尘埃等污染物。 ③观察表面，特别是各种断口间隙处存在污染物时，要用无水乙醇、丙酮或超声波清洗法清理干净。这些污染物都是掩盖图像细节，引起试样荷电及图像质量变坏的原因。 ④故障构件断口或电器触点处存在的油污、氧化层及腐蚀产物，不要轻易清除。观察这些物质，往往对分析故障产生的原因是有益的。如确信这些异物是故障后才引入的，一般可用塑料胶带或醋酸纤维素薄膜粘贴几次，再用有机溶剂冲洗即可除去。 ⑤试样表面的氧化层一般难以去除，必要时可通过化学方法或

电镜样品制作(完全版)

相关仪器的信息： 透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本 超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利 扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克 临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本 真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本 包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USA TEM样品包埋块制作有关注意事项 一、取材： 1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织 细胞尽可能保持原来的生活状态； 2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织； 3、组织块大小：一般要小于1mm3。 二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞 的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。 1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方 法让样品沉入溶液中 2、使用锇酸的注意事项 I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或

二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。 II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。 三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的 反应。 四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包 埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。 脱水过程中应注意： I 逐级脱水而不能急剧脱水； II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡； III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。 五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外 空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。 包埋剂配制及使用过程中的注意事项： I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的； II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；

电子显微镜生物样品的制备实验

电子显微镜生物样品的制备实验 一、目的要求 学习并掌握制备微生物及核酸电镜样品的基本方法。 二、电子显微镜与光学显微镜的主要区别 显微镜的分辨率取决于所用光的波长，1933年开始出现的电子显微镜正是由于使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。而光源的不同，也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异（表Ⅲ-1）。表Ⅲ-1 根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型，目前最常用的是透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜(scanning electron microscope)，前者总放大倍数可在1000~1000000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20~300000倍之间变化。本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。 三、器材 1.菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。 2.溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷钨酸钠（pH6.5~8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素c，醋酸铵，质粒pBR322。 3.仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。 四、操作步骤 （一）透射电镜的样品制备及观察 1.金属网的处理 光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃，只能采用网状材料作为载物，通常称为载网。载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是200~400目（孔数）的铜网。网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。本实验选用的是400目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸1~2分钟，或在1% NaOH 溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。 2．支持膜的制备 在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜。支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20nm；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右。支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求，而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易，但强度不如聚乙烯甲醛膜。 （1）火棉胶棉的制备在一干净容器（烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放入一定量的无菌水，用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振动，待醋酸戊