ch6细胞工程教案

第六章植物细胞培养与次生产物生产

（4学时）

教学目的与要求：

深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性，掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。

第一节、悬浮培养(suspension culture)

悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。

一、愈伤组织的诱导与起始培养物的建立

●选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

●选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。

●愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强

二、悬浮系的建立与继代培养

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

● 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培

养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

● 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，

培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

● 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。

三．悬浮细胞的生长动态

影响悬浮细胞生长的因素：

●起始愈伤组织的质量

●接种细胞密度

●培养条件：方式、温度、

●继代周期

四、悬浮培养细胞的同步化

细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

●植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因

此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。

●也正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使

悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。

●通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。

细胞同步化的常用方法：

●饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿

而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将

饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。

●抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，

当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期－G1期的同步化细胞。

●分选法：通过细胞体积大小分级将处于相同周期的细胞进行分选，将同一周期的

细胞继代培养于同一体系中，使相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。

●低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用

此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化。梅兴国等（2001）采用6 ℃低温处理

红豆杉细胞也获得较明显得同步化效果。

第二节、植物细胞的规模培养

一、概述

在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源的新化合物。

植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。

李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。

许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。

规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径

●保护生态环境

●提高生产效率

●发展新型生物技术产业

来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较

Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with

植物次生代谢产品的市场潜能

Stages in the development and operation of a plant cell biotechnology process

植物细胞大规模培养的技术要求：

从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统；

从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的

Biomass and/or medium

Product extraction

Product Callus

Or

Suspension Culture established

终产物；代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。

二、植物细胞规模化培养体系的建立

1、细胞系的建立和选择

2、优良细胞系的增殖培养

3、大规模培养体系的建立

培养方式的选择：

●间歇培养－流加间歇培养

两级或多级间歇培养

●连续培养－单级连续培养

多级连续培养

回流式连续培养

●固定化细胞培养

单细胞克隆技术—细胞平板培养

●平板培养（plating culture）是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基

中进行培养的技术。

三、生物反应器类型及其特点

1、悬浮培养系统

液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。

●机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。

●气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易

使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。

●旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。

2、固定化培养系统

这一技术的优点在于：

●可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；

●细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可

以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

●由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了

培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

●正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以

进行连续生产。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

●包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；

●附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

第三节、培养细胞的次生代谢及产物积累

植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。

一、植物产生代谢产物的类型

植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：

酚类化合物－黄酮类

单酚类

醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）

萜类化合物－三萜皂甙

甾体皂甙

单萜、倍半萜、二萜

含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）

胺类（伯、仲、叔、季胺）

非蛋白质氨基酸

生氰甙

多炔类、有机酸等

二、培养条件下的植物细胞次生产物积累特性

●生长偶联型产物合成与细胞生长成正比。

●中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物

都不合成。

●非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。

三、提高细胞次生产物产量的途径影响因素

●内因细胞的遗传特性

母细胞外植体的生理状态

●外因温度

pH

营养状况

通气状况

生长调节因子：激素、前体物质

第四节细胞规模化培养实例

一、螺旋藻

1、螺旋藻的生物学特性

●螺旋藻属于蓝藻门、段殖体目、颤藻科、螺旋藻属；

●单细胞或多细胞，藻丝体呈螺旋状，无鞘，有气泡，上浮性好；

●含Chla ，藻胆蛋白和类胡萝卜素等光合色素但无Chlb，属光能自养型原

核生物；

●繁殖方式:横裂和藻丝断裂；

●喜高温（25℃-36℃）、高碱（pH9-11）且好光。

2、螺旋藻营养价值及应用

1）营养价值

●含具生物活性的蓝藻多糖；

●蛋白含量高；

●维生素（B12）；

●β-胡萝卜素；

●不饱和脂肪酸：r-亚麻酸可达干重1.7%；

●微量元素和矿物质：铁、锌、铜、硒等；

2）螺旋藻的应用

●人类功能性食品；

●WHO：“人类2l世纪的最佳保健品”；

●FAO：“21世纪最理想的食品”；

●作为珍贵水产动物饲料和饵料；

●潜在的基因转化受体，用于工业化生产药物等。

3）同大肠杆菌、酵母、其他植物和动物等基因转化受体相比，螺旋藻优点如下：

①基因组结构简单，便于基因分析；

②胞内具有蛋白高效表达机制，能耐受高浓度单一蛋白，内源蛋白更新速度慢，对外源蛋白容受力高；

③培养条件简单，繁殖快，成本低。

3、螺旋藻的生产和加工流程

1）螺旋藻的生长条件

①环境条件

●适宜光照条件：2.0-3.5 万lx

●温度：28-35℃

●培养液pH值：8.5-10

●搅动：保证气体和营养交换充分；

②培养基

●目前较通用的是Zarrouk配方（g/L）：

NaHCO3 16.8 KH2PO4 0.5

NaNO3 2.5 NaCl 1.0

FeSO4.7H2O 0.01 MgSO4.7H2O 0.2

K2SO4 1.0 CaCl2.2H2O 0.04

A5 (trace element) 1mL

2）螺旋藻生产流程

●选择藻种

●藻种分离、纯化和保藏

●藻种的活化

●接种及扩大培养

●规模化培养及日常管理

●采收

●注意事项

3）日常管理

①二氧化碳浓度：实验室和实际生产中，一般采取通入CO2和空气混合气体提供C 源，并进行搅动；CO2比例一般在1-5％。

②光照强度：在对数生长期后期，藻细胞浓度较高，细胞间遮光作用较强；若利用人工光源时应保证足够高的光强；若用日光，如>10万Lx时，应遮光，避免过高光伤害细胞。

③温度：最适温为28-35℃，过低时需设法调节。

④无机营养：连续或半连续培养中应及时补液；

⑤监测pH：太高时，可以调高通入CO2的浓度，低时可添加NaHCO3调节；

⑥适时采收，适当控制藻细胞浓度：过高会引起光照和无机营养不足，生长变慢；

⑦通过“察颜观色”监测藻类生长情况：发现不正常现象，立即镜检，以了解藻细胞生长情况及有无敌害生物污染。

二、雨生红球藻

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属，为真核光自养生物。

在弱光、氮磷丰富的环境中以游动的绿色营养细胞存在；逆境下，则以厚壁孢子形式存在，并累积大量虾青素（可占类胡萝卜素的99％）而呈红色。

1、虾青素

1）虾青素结构及来源

●3,3,-二羟基-4,4,-二酮基-β,β’-胡萝卜素;

●呈鲜红色，在水生动物、鸟类羽毛及植物叶、花、果中广泛存在;

目前主要是从水产品废弃物、单胞藻、酵母（Phaffia rhodozyma）中提取．动物本身并不能合成虾青素。

2）虾青素的生物学功能及应用

功能：

●“超级抗氧化剂”：可清除ROS，抗氧化活性是Vit.E的550倍，β类胡萝卜素

的10倍；

●着色功能

●抗癌活性

●增强机体免疫力

●消除时差症

●抵御UV辐射损害

应用：

●人类保健食品、药品；

●水产养殖动物、家禽、家畜饲料添加剂。

2、雨生红球藻的大规模生产

1）环境条件

●光： 1.5-4.0 Klx

●温度：14-28℃，>28℃则抑制生长

●pH：中性至微碱性

●可利用醋酸盐/丙酮酸盐进行异养

●机械搅动：保证气体和营养交换充分

2）培养基

3）大规模生产的基本步骤 ● 藻种选择

● 藻种分离、纯化和保藏 ● 藻种的活化 ● 接种及扩大培养

● 红球藻营养细胞的累积 ● 厚壁孢子及虾青素诱导 ●

注意事项

3、利用红球藻生产虾青素过程中存在问题

①雨生红球藻对环境变化敏感，指数生长期短，抗细菌和原生动物污染能力差;易被其他微藻，变形虫，原生动物污染；

②虾青素累积在厚壁孢子中，提取及利用不便;

③培养耗时长、连续性差，且在胁迫中会大量死亡； ④普遍适应低温，超过28℃就生长不良。

思考题

1．一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？2．建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？

3．悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律。

4．细胞大规模培养有哪些培养系统？

5．植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题。