实验六 B淋巴细胞功能检测—EAC花环试验

实验六B淋巴细胞功能检测—EAC花环试验

一、目的要求

掌握EAC花环试验的操作方法与判定标准。

二、实验原理

EAC花环试验是红细胞-抗红细胞抗体-补体（erythrocyte - antibody - complement,EAC）花环试验的简称。B淋巴细胞上带有补体受体，这一受体仅能与活化的C3（即C3裂解成分C3b、C3d）呈特异性结合。因此测定B细胞补体受体时，必须有活化的C3以及能显示活化C3与相应受体结合的指示系统。红细胞（E）可与相应抗体（A）相结合形成抗原-抗体复合物（EA），以红细胞作为指示细胞。EA复合物通过传统途径激活补体而生成活化的C3，然而EA与活化的C3结合形成EAC。当EAC中的C3与B细胞等细胞上的补体受体相结合时，EAC即围绕周围形成花环。淋巴细胞中，B淋巴细胞有补体受体，而T淋巴细胞则无补体受体，因此EAC花环试验可检测带有补体受体的淋巴细胞。

三、实验器材和操作方法

1.红细胞悬液取新鲜抗凝绵羊（或鸡）血液，用生理盐水（或Hank’s液）洗3次，最后配成4％的细胞悬液。

2.抗红细胞抗体抗鸡红细胞抗体的制备方法是：选用体重3~4kg的健康家兔，用以Hank’s液洗过3次的压积红细胞进行免疫，第1次0.5ml，皮内注射，以后隔日注射1次，每次递增0.5ml，从第二次开始，均已皮内、皮下多点注射。共注射5~7次，末次注射后7d 试血，测定红细胞凝集抗体效价，若达到1:2000以上时即可应用。应用时采用凝集价的1/2（亚凝集价）作为抗血清的稀释度（即1:4000）。

抗羊红细胞抗体可以自生物制品厂购入（溶血素），也可以自己制备。

3.补体取健康成年小鼠用乙醚麻醉后，剪开胸部皮肤暴露腋窝，剪断腋窝动脉放血，每只可取血1ml以上。也可用摘除眼球的方法进行采血。待凝后，37℃放置30min，继续置于冰箱中2h，离心分离血清，加入10％的经洗涤的红细胞，置于4℃冰箱中过夜，吸收除去对红细胞的天然抗体，即为补体。

4.EAC悬液的制备以鸡红细胞EAC花环为例：取4％鸡红细胞悬液1ml，加入

Hank’s液稀释的1:4000抗鸡红细胞抗体1ml，混匀，37℃水浴15min或者37℃温箱30min。离心弃上清液，用Hank’s液将沉淀（EA）恢复为1ml，加入等量的20％小鼠血清或1％豚鼠血清（补体），37℃水浴15min或者38℃温箱30min，即为EAC悬液。

5.花环试验取用分层液分离的淋巴细胞0.2ml，加入EAC悬液0.2ml，混匀，37℃水浴或者温箱30min，500r/min离心5min，弃上清液。加入1％戊二醛0.1ml，混匀后置4℃固定。

四、结果判定

以悬液制片，自然干燥，用姬姆萨染液或美蓝染液进行染色。用高倍镜检查200个淋巴细胞，凡吸附3个以上红细胞的淋巴细胞为EAC花环形成细胞，计算花环形成率。

五、注意事项

1.EAC花环试验的抗体是IgM类，如其中混杂有IgG类抗体，则EA容易和带有Fc受体的细胞形成EA玫瑰花环，影响试验的精确性。因此最好将抗红细胞抗体血清进一步纯化，从中提取IgM类抗体。

2.EAC花环形成受所用抗血清和补体浓度的影响。正式试验时，要用不同稀释度的补体做方阵滴定试验，以选择抗血清和补体的最适稀释度。

3.加入淋巴细胞与红细胞的比例一般以1:40为宜。淋巴细胞过少，花环形成率明显降低。

4.淋巴细胞、红细胞、补体均必须新鲜，否则花环形成率明显下降。